1、基础理论和技术的发展催生了基因工程 nDNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明nDNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立n遗传密码的破译遗传密码的破译n基因转移载体的发现基因转移载体的发现n工具酶的发明工具酶的发明nDNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明nDNA体外重组的实现体外重组的实现n重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功n第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世nPCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明1.11.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）“分子手术刀分子手术刀”分布：分
2、布：主要在原核生物中。主要在原核生物中。作用特点：作用特点：特异性，即识特异性，即识别特定核苷酸序列，别特定核苷酸序列，切割特定切点。切割特定切点。化学键：化学键：磷酸二酯键磷酸二酯键举例：举例：EcoEcoRIRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTC序列，并序列，并在在G和和A之间切开。之间切开。EcoRI限制酶限制酶重播重播“黏性末端黏性末端”和和“平末端平末端”DNA连接酶“分子缝合针”n连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为得到的，称之为EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶。另一。另一种是从种是从T T4 4噬菌体中分离得到，称为
3、噬菌体中分离得到，称为T T4 4DNADNA连连接酶接酶。nEcoliEcoliDNADNA连接酶只能连接黏性末端；连接酶只能连接黏性末端；T T4 4 DNADNA连接酶既连接可黏性末端，又可连接平连接酶既连接可黏性末端，又可连接平末端。末端。nDNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？聚合酶一样吗？为什么？DNADNA连接连接酶酶基因的载体“分子运输车”常用的载体种类有：常用的载体种类有：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等。噬菌体的衍生物，动植物病毒等。质粒 质粒是基因工质粒是基因工程最常用的运载体，程最常用的运载体，它广泛地存在于细它广泛地存在于细菌中，是细菌染色菌中，是
4、细菌染色体外能够自主复制体外能够自主复制的很小的环状的很小的环状DNA分子，大小只有普分子，大小只有普通细菌拟核通细菌拟核DNA的的百分之一。百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造基因的载体“分子运输车”载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：1 1、能能够在宿主细胞中够在宿主细胞中自我复制自我复制并稳定保存；并稳定保存；2 2、有一个至多个限制酶切点有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接；，以便与外源基因连接；3 3、有有某些某些标记基因标记基因，便于进行鉴定和选择，便于进行鉴定和选择。（如抗菌素的。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等抗性基因、产物具有颜色
5、反应的基因等 ）4 4、对受体细胞无害对受体细胞无害且大小合适。且大小合适。常用的载体种类有：常用的载体种类有：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等。噬菌体的衍生物，动植物病毒等。1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序、目的基因的获取目的基因的获取二二、基因表达载体的构建（核心）基因表达载体的构建（核心）三三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞四四、目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 用用 种种限制酶限制酶将将供供体细胞体细胞中的中的DNADNA切成
6、许多片切成许多片段段，将这些片段分别，将这些片段分别载入载入运载体运载体，然后通过运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体菌，分别转入不同的受体菌，让这些外源让这些外源DNADNA片段片段分别在分别在各个各个受体菌受体菌中中储存储存。建立。建立基因文库基因文库用限制酶切断成用限制酶切断成许多片段许多片段基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库方法一、从基因文库中获取目的基因方法一、从基因文库中获取目的基因多多如如:鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法）基基 因因 文文 库库推测：由推测：由mRNAmRNA反反转录形成互补转录形成互补DNADNA的过程。的过程。部分基因文库部分基因文库如如
7、cDNAcDNA方方法法二、二、利利用用PCRPCR扩扩增增目目的的基基因因根据根据已知已知蛋白质蛋白质的的氨基酸序列氨基酸序列，推测推测出相应的出相应的信使信使RNARNA序序列，然后按照列，然后按照碱基互碱基互补配对补配对原则，原则，推测推测出出相应相应基因的核苷酸序基因的核苷酸序列列，再通过化学方法，再通过化学方法，以以单个核苷酸为原料单个核苷酸为原料合成目的基因合成目的基因。方法三、直接人工合成（适合于较小的基因）方法三、直接人工合成（适合于较小的基因）转录转录目的基因目的基因与运载体的结合过程，实际与运载体的结合过程，实际上是不同来源的上是不同来源的基因重组基因重组的过程。的过程。导
8、入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2+2+处理成感受态细胞处理成感受态细胞 原理原理:借鉴借鉴细菌细菌或或病毒病毒侵染侵染细胞细胞的途径。的途径。方法方法1 1、将目的基因导入植物细胞、将目的基因导入植物细胞:卵细胞极 核花粉粒花粉粒萌发花粉管花粉管精子 （2）受精卵受精极核受 精 卵（1 1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少等。）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少等。（2 2）方法：）方法：含目的基因的表达载体含目的基因的表达载体提纯提纯 取卵（受
9、精卵），显微取卵（受精卵），显微注注射射 胚胎培养胚胎培养,发育成具有新性状的动物。发育成具有新性状的动物。用用CaCa2+2+处理处理细胞细胞成感受态成感受态细胞细胞 表达载体表达载体溶于缓冲液中与感受态细胞溶于缓冲液中与感受态细胞混合混合，一定温度下，一定温度下感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNADNA分子。分子。2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞:3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞:导入目的基因后需要检测哪些方面？检测方法？导入目的基因后需要检测哪些方面？检测方法？个体水平鉴定：个体水平鉴定：（有时）（有时）检测转基因生物染色体上是否插入目的基因
10、检测转基因生物染色体上是否插入目的基因 检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法:DNA分子杂交技术分子杂交技术分分子子水水平平检检测测DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成成杂合双链区杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然；在没有互补碱基序列的部
11、位，仍然是两条游离的单链。是两条游离的单链。DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd导入目的基因后需要检测哪些方面？检测方法？导入目的基因后需要检测哪些方面？检测方法？个体水平鉴定：个体水平鉴定：（有时）（有时）检测转基因生物染色体上是否插入目的基因检测转基因生物染色体上是否插入目的基因 检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫或抗病接种实验、活性比较等。抗虫或抗病接种实验、活性比较
12、等。方法方法:DNA分子杂交技术分子杂交技术方法方法:DNA RNA分子杂交技术分子杂交技术方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交分分子子水水平平检检测测一、一、原核细胞原核细胞的基因结构：的基因结构：编码区编码区能转录能转录,并并编码编码蛋白质的蛋白质的序列序列。能转录能转录,但不编码蛋白质的序列。但不编码蛋白质的序列。启动子启动子（RNARNA聚合聚合酶结合位点）酶结合位点）终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：编码区编码区启动子启动子（RNARNA聚合聚合酶结合位点）酶结合位点）终止子终止子二、二、真核细胞真核细胞的基因结构：的基因结构：编码
13、编码蛋白质的蛋白质的序列序列补充知识补充知识非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 基因工程的成果与发展前景 动物基因工程动物基因工程用于转基因动物做用于转基因动物做器官移植器官移植供体供体用于提高动物用于提高动物生长生长速度速度植物基因工程植物基因工程 抗虫抗虫转基因植物转基因植物抗病抗病转基因植物转基因植物抗逆抗逆转基因植物转基因植物利用转基因利用转基因改良改良植物品质植物品质用转基因动物生产用转基因动物生产药物药物用于用于改良改良畜产品的品质畜产品的品质基因治疗基因治疗基因工程药物基因工程药物1 1、基因工程又叫做、基因
14、工程又叫做_技术。技术。2 2、分子手术刀是、分子手术刀是_ _ _，简称，简称_ _ _，它切割，它切割的是两个核苷酸间的的是两个核苷酸间的_ _ _键。键。3 3、分子缝合针是、分子缝合针是_ _ _，它与，它与DNADNA聚合酶的区聚合酶的区别有别有_ _ _、_ _ _。（任意写出两点即可）。（任意写出两点即可）4 4、基因工程的操作步骤有：一、基因工程的操作步骤有：一、_ _ _ _ _；二、二、_ _ _；三、；三、_ _ _；四、；四、_ _ _；其中其中_是基因工程的核心。是基因工程的核心。5 5、基因文库包括、基因文库包括_、_两大类；两大类；PCRPCR技术技术的原理是的原
15、理是_ _ _,结果是结果是_ _ _；若基因较小且；若基因较小且序列已知可用序列已知可用_方法获取目的基因。方法获取目的基因。6 6、将目的基因导入植物细胞可采取的方法有：、将目的基因导入植物细胞可采取的方法有：_、_、_；导入动物细胞的；导入动物细胞的方法有方法有_；将目的基因导入微生物细；将目的基因导入微生物细胞可采取的方法有胞可采取的方法有_。7 7、检测目的基因是否插入受体细胞染色体的方、检测目的基因是否插入受体细胞染色体的方法是法是_技术；检测目的基因是否翻译为技术；检测目的基因是否翻译为蛋白质可用蛋白质可用_技术。技术。*8 8、珠蛋白是血红蛋白的重要组成成分，珠蛋白是血红蛋白的
16、重要组成成分，当它结构异常时动物可能患镰刀型细胞贫血当它结构异常时动物可能患镰刀型细胞贫血症。利用基因工程的方法使大肠杆菌生产出症。利用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的鼠的珠蛋白，该如何设计？（珠蛋白，该如何设计？（提示：分提示：分步写，可以参考基因工程的操作步骤步写，可以参考基因工程的操作步骤）2009江苏高考34题 (2)(2)图中表示图中表示HindIIIHindIII与与Bam IBam I酶切、酶切、DNADNA连接酶连接的过连接酶连接的过程，此过程可获得程，此过程可获得 种重组质粒种重组质粒 。如果换用如果换用Bst lBst l与与BamH lBamH l酶切，目的基因与质粒连
17、接后酶切，目的基因与质粒连接后可获得可获得 种重组质粒。种重组质粒。1.4 1.4 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起 蛋白质是生命活动的蛋白质是生命活动的 。主要承担者主要承担者蛋白质是生命活动的蛋白质是生命活动的 。结构蛋白结构蛋白催化催化-酶酶运输运输-血红蛋白血红蛋白调节调节-某些激素某些激素免疫免疫-抗体抗体主要承担者主要承担者实例一：干扰素的保存实例一：干扰素的保存原因原因:干扰素易形成二聚体干扰素易形成二聚体,变性使活性降低。变性使活性降低。设计设计:如果将其分子上的一个如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨半胱氨酸变成丝氨酸酸，那么在，那么在-70-70的条件下，可以保存半年。的条
18、件下，可以保存半年。蛋白质工程实例蛋白质工程实例一、蛋白质工程的崛起的缘由一、蛋白质工程的崛起的缘由 基因工程在原则上只能生产自然界已存基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。在的蛋白质。蛋白质工程能产生自然界原本不存在的蛋白质工程能产生自然界原本不存在的新的蛋白质。新的蛋白质。设计设计:如果对赖氨酸合成过程中的两个关键酶如果对赖氨酸合成过程中的两个关键酶进行改造进行改造,可以使玉米叶片和种子中的游离赖可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高氨酸分别提高5 5倍和倍和2 2倍。倍。原因：原因：赖氨酸合成过程中两个关键酶赖氨酸合成过程中两个关键酶天冬天冬氨酸激酶氨酸激酶和和二氢吡啶二羧酸
19、合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响。当赖氨酸浓度达到细胞内赖氨酸浓度的影响。当赖氨酸浓度达到一定量时，就会抑制这两种酶的活性。一定量时，就会抑制这两种酶的活性。实例二：提高玉米中赖氨酸的含量实例二：提高玉米中赖氨酸的含量实例三：提高工业用酶的稳定性实例三：提高工业用酶的稳定性 许多工业用酶是在改变天然酶的特性后，才许多工业用酶是在改变天然酶的特性后，才使之适应生产和使用需要的。使之适应生产和使用需要的。在已研究过的几千种酶中，绝大多数酶都不能应在已研究过的几千种酶中，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但用于工业生产，这些酶虽然在自然
20、状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有产中每一步的反应体系中常常会有酸酸、碱碱或或有机溶剂有机溶剂存在，反应存在，反应温度温度较高，在这种条件下，大多数酶会很较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。非常重要的课题。旁栏思考题旁栏思考题 你知道人类你知道人类蛋白质组计划蛋白质组计划吗？它与蛋白质工吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？人类蛋白
21、质组计划是继人类基因组计划人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。的科学命题。20012001年年，国际人类蛋白质组组，国际人类蛋白质组组织宣告织宣告成立成立。之后，该组织正式提出启动了。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是由两项重大国际合作行动：一项是由中国科学中国科学家家牵头执行的牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血人类血浆蛋白质组计划浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷
22、幕。组计划的帷幕。“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有京，目前有1616个国家和地区的个国家和地区的8080多个实验室多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。新药研发的突破提供重要的
23、科学基础。人类人类蛋白质组计划蛋白质组计划的深入研究将的深入研究将是对蛋是对蛋白质工程的有力推动和理论支持白质工程的有力推动和理论支持。二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理1 1、蛋白质工程的目标、蛋白质工程的目标 根据根据人们对蛋白质人们对蛋白质功能功能的特定的特定需求需求，对对蛋蛋白质的白质的结构结构进行分子进行分子设计设计。2、蛋白质工程的基本途径、蛋白质工程的基本途径预期的蛋白质功能预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）（基因）推测并合成推测并合成P27/“
24、P27/“讨论讨论”3 3、蛋白质工程的概念、蛋白质工程的概念 是指以蛋白质分子的结构规律及其生是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，物功能的关系作为基础，通过基因修饰或通过基因修饰或基因合成，基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制对现有蛋白质进行改造，或制造一种造一种新的蛋白质新的蛋白质，以满足人类的生产和，以满足人类的生产和生活的需求。生活的需求。4 4、蛋白质工程与基因工程的关系、蛋白质工程与基因工程的关系 蛋白质工程是在基因工程的基础上蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的延伸出来的第二代基因工程第二代基因工程，是包含多学，是包含多学科的综合科技工程领域。科的综合科技
25、工程领域。P27/P27/异想天开：异想天开：能不能根据人类需要的蛋白能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品呢？中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品呢？理论上讲可以理论上讲可以，但，但目前还没有真正成功的目前还没有真正成功的例子例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。主主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂要
26、原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对，人类对蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质，而且功能作用的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的带来什么危害也是人们所担心的。三、蛋白质工程的进展和前景三、蛋白质工程的进展和前景1 1、药品改造、药品改造如：速效型胰岛素如：速效型胰岛素2 2、材料科学、材料科学如：电子元件如：电子元件3 3、蛋白质的高级结构有待深入研究、蛋白质的高级结构有待深入研究P28/P28/思考与探究思考
27、与探究 1.1.蛋白质工程的崛起主要蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础是工业生产和基础理论研究的需要理论研究的需要。2.2.基因工程是遵循中心法则，基因工程是遵循中心法则，从从DNAmRNADNAmRNA蛋白质蛋白质折叠产生折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能确定蛋白质的功能蛋白质应有的蛋白质应有的高级结构高级结构蛋白质应具备的折叠状态蛋白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的氨基酸序列应有的碱基排列，应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。可以创造自然
28、界不存在的蛋白质。3.3.酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。业以及医药工业中。-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；连
29、续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些功能的衰竭等。至于我们日常生活中所见到的功能的衰竭等。至于我们日常生活中所见到的加酶加酶洗衣粉、嫩肉粉洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的体现了。等，就更是酶工程最直接的体现了。通常所说的通常所说的酶工程酶工程是用工程菌生产酶制剂，是用工程菌生产酶制剂，而而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后然后由酶的分子结构来由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序确定相应基因的碱基序列等步骤。列等步骤。因此，因此，酶工程的重点在于对已存酶酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使使酶工程成为蛋白质工程的一部分酶工程成为蛋白质工程的一部分。
