1、基因工程基因工程考纲要求考纲要求内容内容等级要求等级要求基因工程的操作步骤基因工程的操作步骤A A三、基因操作的基本步骤三、基因操作的基本步骤1 1、提取目的基因、提取目的基因(1)(1)目的基因的概念：目的基因的概念：人们需要的特定基因。人们需要的特定基因。（2 2）提取目的基因的途径）提取目的基因的途径提取目的基因的途径提取目的基因的途径人工合成基因（真核细胞）人工合成基因（真核细胞）反转录法反转录法 根据已知氨基酸根据已知氨基酸序列合成序列合成DNADNA从供体细胞的从供体细胞的DNADNA中直接分离基因中直接分离基因 方法：鸟枪法方法：鸟枪法 途径途径供体细胞中的供体细胞中的DNADN
2、A中直接分离基因中直接分离基因人工合成基因（真核细胞）人工合成基因（真核细胞）方法方法根据已知氨基酸根据已知氨基酸序列合成序列合成DNADNA过程过程供体细胞中的供体细胞中的DNADNA 限制酶限制酶许多许多DNADNA片段片段 载入载入运载体运载体 导入导入受体细胞受体细胞 外源外源DNADNA扩增扩增,产生特定性状产生特定性状 分离分离 目的基因目的基因目的基因目的基因mRNAmRNA 反转录反转录单链单链DNADNA 合成合成双链双链DNA(DNA(即目的基因即目的基因)蛋白质的氨基酸序蛋白质的氨基酸序列列 推测推测mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 推测推测结构基因的核苷酸结构基
3、因的核苷酸序列序列 化学合成化学合成目的基因目的基因鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法途径途径供体细胞中的供体细胞中的DNADNA中直接分中直接分离基因离基因人工合成基因（真核细人工合成基因（真核细胞）胞）方法方法鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知根据已知氨基酸序氨基酸序列合成列合成DNADNA优点优点操作简单操作简单专一性强专一性强专一性强，专一性强，可产生自可产生自然界不存然界不存在的新基在的新基因。因。缺点缺点工作量大，盲工作量大，盲目性大，专一目性大，专一性差性差操作过程较操作过程较麻烦，技术麻烦，技术要求过高。要求过高。适用范围适用范围狭小狭小 基因文库：储存某种生物基因的菌群的基因文库
4、：储存某种生物基因的菌群的总总 称，不是指生物基因。称，不是指生物基因。基因组文库：某个含有所有基因的受体基因组文库：某个含有所有基因的受体菌。指某个个体。菌。指某个个体。部分基因文库（部分基因文库（cDNA文库）：某个含有文库）：某个含有部分基因的受体菌。部分基因的受体菌。基因库：一个种群所有基因的总称，指基因库：一个种群所有基因的总称，指基因。基因。4）目的基因的扩增：）目的基因的扩增：PCR技术技术 原理：原理：DNA复制复制 结果：目的基因成指数增长结果：目的基因成指数增长 步骤：变性（解旋为单链）步骤：变性（解旋为单链）+引物，退火，引物，退火，延伸（延伸（DNA聚合酶作用），多次重
5、复聚合酶作用），多次重复 原料：原料：DNA模板、模板、4种脱氧核苷酸、引物、种脱氧核苷酸、引物、DNA聚合酶、聚合酶、ATP 复制方向：只能从复制方向：只能从5端向端向3端延伸端延伸 原因：原因：DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从而只能从3端延伸端延伸DNA链。链。2 2、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合-核心步骤核心步骤运载体和表达载体的运载体和表达载体的区别：区别：表达载体的组成：表达载体的组成：目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因运载体即质粒运载体即质粒表达载体即重组质粒表达载体即重组质粒2、目的基因与运载体结合（以质
6、粒为运载体）、目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）质粒质粒DNA分子分子同一种限制酶处理同一种限制酶处理 一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端 两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNA连接酶连接酶重组重组DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？三种情况：目的基因与目的基因结合三种情况：目的基因与目的基因结合 质粒与质粒结合质粒与质粒结合 目的基因与质粒结合目的基因与质粒结合39（选修模块3：现代生物科技专题）图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp
7、R为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别
8、和结合的位点是 ，其合成的产物是 。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞（1）导入方法：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径）导入方法：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径（唯一没有出现碱基互补配对的过程）（唯一没有出现碱基互补配对的过程）（2 2）受体种类不同，导入方法不同）受体种类不同，导入方法不同导入植物细胞：导入植物细胞：（卵细胞和体细胞（卵细胞和体细胞都可以）都可以）农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法、花粉管通道法基因枪法、花粉管通道法农杆菌转化法：农杆菌转化法：双子叶植物受伤时，伤口
9、分泌的酚类化合物，双子叶植物受伤时，伤口分泌的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞并进入细胞，将吸引农杆菌移向这些细胞并进入细胞，将目的基因整合到受体细胞染色体目的基因整合到受体细胞染色体DNADNA上。上。受体细胞：细菌受体细胞：细菌细胞壁的通透性增大细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制目的基因随受体细胞的繁殖而复制氯化钙氯化钙导入动物细胞导入动物细胞-显微注射法，将目的基因显微注射法，将目的基因注射到卵细胞中，受精后，胚胎移植。注射到卵细胞中，受精后，胚胎移植。导入微生物细胞导入微生物细胞-感受态细胞法感受态细胞法4 4、目的基因的检测和表
10、达、目的基因的检测和表达（1）检测：）检测：通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入DNADNA分子杂交法：分子杂交法：检测染色体检测染色体DNADNA分子是否插入目的基因分子是否插入目的基因或者目的基因是否转录出或者目的基因是否转录出RNARNA免疫法：免疫法：提取蛋白质用相应的抗体进行提取蛋白质用相应的抗体进行抗体抗体抗原杂交抗原杂交4 4、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌
11、落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。（2）表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达）表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。小小 结结
