1、 实验三实验三网织红细胞计数网织红细胞计数一、实验原理一、实验原理 网织红细胞胞浆内残存有嗜碱性的网织红细胞胞浆内残存有嗜碱性的RNA物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后RNA中负电荷基团与带正电荷的有色基团结中负电荷基团与带正电荷的有色基团结合，凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状合，凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状或网状结构，可在显微镜下识别。计数或网状结构，可在显微镜下识别。计数1000个红细胞中所有的网织红细胞数直接报告其百个红细胞中所有的网织红细胞数直接报告其百分比，或分比，或红细胞计数结果报告其绝对值。红细胞计数结果报告其绝对值。网织红细胞计
2、数课件 网织红细胞（网织红细胞（Ret）是是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间的过渡细胞，是的过渡细胞，是尚未完全成熟的红细胞，尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内残存有嗜碱性的其胞浆内残存有嗜碱性的RNA物质。物质。嗜嗜碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。分型：丝球型、网型、破网型、点粒型。分型：丝球型、网型、破网型、点粒型。（、型）型）网织红细胞计数课件网织红细胞网织红细胞计数课件计数方法n1、普通光学显微镜法：活体染色后推片镜检n2、网织细胞计数仪法：荧光染色后
3、用流式细胞术计数网织红细胞计数课件二、试剂器材1、试剂 10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶液 2、器材 毛细血管采血用具、小试管、载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20 mm（较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正中央开一边长为3mm的菱形或正方形小孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）网织红细胞计数课件三、操作步骤1.染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液1滴，滴，任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴，于任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴，于已干燥的染料上，用推片角混匀后，将两玻片盖合已干燥的染料上，用推片角混匀后，将两
4、玻片盖合（玻片法）；试管法取染液（玻片法）；试管法取染液2滴入试管，加血滴入试管，加血2滴滴混匀，封闭好，待混匀，封闭好，待15分钟以上时间，分钟以上时间，2.推片：取混合液推片：取混合液1小滴于载玻片的一端，推制成薄小滴于载玻片的一端，推制成薄而均匀的血膜，而均匀的血膜，3.低倍镜浏览，选取红细胞分布均匀网织红细胞染低倍镜浏览，选取红细胞分布均匀网织红细胞染色较好的部分（体尾交界处），滴香柏油转换至油色较好的部分（体尾交界处），滴香柏油转换至油镜，在镜，在Miller窥盘下计数小方格中的窥盘下计数小方格中的RBC数和大方数和大方格中的网织红细胞数（或数出整个视野中的格中的网织红细胞数（或数出
5、整个视野中的RBC总数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至总数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至几个视野几个视野RBC总数总数1000为止）。为止）。网织红细胞计数课件Miller窥盘 A31B将将MillerMiller窥盘放在显窥盘放在显微镜目镜中微镜目镜中,通过窥盘通过窥盘中大小方格间的中大小方格间的9 9比比1 1比例关系计算比例关系计算RBCRBC数和数和RetRet数。数。网织红细胞计数课件网织红细胞计数课件四、计算 1.Miller窥盘法：网织红细胞（窥盘法：网织红细胞（Retic）百分率百分率(%)=（大方格内（大方格内Retic总数）总数）/（小方格内（小方格内RB
6、C总数总数9）100%2.直接计数法：网织红细胞（直接计数法：网织红细胞（Retic）百百分率分率(%)=多个视野内多个视野内Retic总数总数/多多个视野内个视野内RBC总数总数100%网织红细胞计数课件五、注意事项1.用酒精染液时，应待玻璃片上的酒精挥发干燥用酒精染液时，应待玻璃片上的酒精挥发干燥后，才能加血液，染色时应用推片角不停搅动，后，才能加血液，染色时应用推片角不停搅动，使染料和血液混合，防止凝固。使染料和血液混合，防止凝固。2.染色时间一定要充足，混合后不能立即推片，染色时间一定要充足，混合后不能立即推片，室温低时染色时间应适当延长，应覆以另一玻室温低时染色时间应适当延长，应覆以
7、另一玻片防止蒸发。片防止蒸发。3.染液与血液比例以染液与血液比例以1：1为宜，贫血适当加血量。为宜，贫血适当加血量。4.涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数5.试剂应定期重配，以免变质沉淀。试剂应定期重配，以免变质沉淀。6.与变性珠蛋白小体鉴别与变性珠蛋白小体鉴别网织红细胞计数课件六、参考值成人：成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%）新生儿：新生儿：0.02-0.06（2%-6%）儿童：儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%）成人绝对值成人绝对值（24-84）109/L 网织红细胞计数课件七、临床意义七、临床意义（1）评价骨髓增
8、生能力，判断贫血类型）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 再障再障时，明显降低。绝对值低于时，明显降低。绝对值低于5109/L可可做为急性再障的辅助诊断指标。做为急性再障的辅助诊断指标。失血、多数失血、多数溶血性贫血溶血性贫血患者网织红细胞可明患者网织红细胞可明显高于正常。显高于正常。营养不良性贫血营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持在治疗前网织红细胞可保持正常、轻度升高或降低。正常、轻度升高或降低。网织红细胞计数课件（2 2）评价疗效）评价疗效网织红细胞反应：网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维生素给予铁剂、维生素B12或叶酸治疗或叶酸治疗23d后，网织后，网
9、织红细胞计数值开始上升，红细胞计数值开始上升，710d达到最高达到最高(10%左右左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、血红蛋白开始升高。血红蛋白开始升高。骨髓移植、骨髓移植、EPO治疗后：治疗后：若骨髓开始恢复造若骨髓开始恢复造血功能，血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。升高，网织红细胞计数值上升。网织红细胞计数课件（3 3）放、化疗监测）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期早期HFR和和MFR降低，然后才检测到网织降低，然后才检测到网织红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功红细胞的降低。而停止
10、放、化疗，骨髓功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指能恢复后，又见上述指标依次上升。可指导临床医师适时调整治疗方案，避免造成导临床医师适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。严重的骨髓抑制。网织红细胞计数课件 RPI=RPI=病人网织红细胞（病人网织红细胞（%）/2 2*病人病人HCT/HCT/正常正常人人HCTHCT（男男0.450.45，女，女0.400.40）临床应用：临床应用：3 3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；提示溶血性贫血或急性失血性贫血；网织红生成指数网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI）网织红细胞计数课件八、思考题 一溶血性贫血
11、患者，红细胞计数2.6x1012/L，血细胞比容0.29，网织红细胞计数相对值为35%，如何报告网织红细胞检测结果？网织红细胞计数课件n外周血网织红细胞计数（百分数和绝对值）是一反映骨髓红系增生活性的常用指标。许多学者先后提出应用FCM和不同的RNA特异性荧光染料自动计数网织红细胞的方法，如派若宁Y、AO、溴化乙啶、thiazole orange等。目前最普遍应用的是 thiazoieorange 染色法，这种特异性RNA 的激发波（488nm）测量的特点，与人工计数法相比，它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值，而且还能获得网织红细胞成熟指数（RMI）。RMI是一个检测骨髓功能的独立实验室指标，它与网织红细胞内RNA含量成正比，RMI可成功地用于评价骨髓移植的效果。网织红细胞计数课件n目前，FCM检测网织红细胞主要用于 1）预测骨髓移植的效果；2）解释各种红系增长低下性贫血的发病原因;3）评价某些新的重组生物制剂的治疗效果。网织红细胞计数课件
