1、实验三动物组织基因组DNA的提取王翠芳2017-3-29实验目的实验目的1.实验原理（核酸分离纯化）实验原理（核酸分离纯化）2.实验仪器、试剂和耗材实验仪器、试剂和耗材3.实验步骤实验步骤4.实验结果与讨论实验结果与讨论5.动物组织基因组DNA的提取一、实验目的n从小鼠尾巴中提取纯的基因组从小鼠尾巴中提取纯的基因组DNA;n掌握基因组掌握基因组DNA抽提的办法，抽提的办法，理解核酸分离纯化的基本原理；理解核酸分离纯化的基本原理；二、实验原理nDNA：主要存在于细胞核的染色体中。核外也主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量有少量DNA，如线粒体，如线粒体DNA（mtDNA）、叶）、叶绿体绿体D
2、NA（cpDNA），质粒），质粒DNA。nRNA：存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA，rRNA，tRNA等。等。1 1、核酸的分类、核酸的分类二、实验原理n分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染；排除其它分子的污染；n核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降到最低程度；其它生物大分子的污染应降到最低程度；排除其它核酸分子的污染；排除其它核酸分子的污染；
3、2 2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则二、实验原理n核酸制备时应注意的事项：核酸制备时应注意的事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程；尽量简化操作步骤，缩短提取过程；减少化学因素对核酸的讲解；减少化学因素对核酸的讲解；减少物理因素的核酸的讲解：机械剪切力和减少物理因素的核酸的讲解：机械剪切力和高温；高温；防止核酸的生物讲解；防止核酸的生物讲解；2 2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则二、实验原理降低温度，改变降低温度，改变pH值，及盐的浓度，都利于对值，及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制剂更核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制剂更有利，几个条件并用更好。有
4、利，几个条件并用更好。DNA，抑制，抑制Dnase活力很容易，但活力很容易，但防止机械拉防止机械拉力张力更重要力张力更重要；RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制抑制Rnase活力较难，故在活力较难，故在RNA提取中设法抑制提取中设法抑制Rnase更重要更重要。3 3、核酸酶的抑制和抑制剂、核酸酶的抑制和抑制剂二、实验原理nDnase抑制：抑制：加入少量金属离子螯合剂，如加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，或柠檬酸钠，Dnase基本可以全部失活；基本可以全部失活；去垢剂、蛋白变性剂及去垢剂、蛋白变性剂及Dnase抑制剂
5、也可使抑制剂也可使Dnase失活；失活；3 3、核酸酶的抑制和抑制剂、核酸酶的抑制和抑制剂二、实验原理nRNase抑制：抑制：操作要带手套；操作要带手套；所有器皿要严格消毒；所有器皿要严格消毒；试剂处理；试剂处理；低温操作；低温操作；在分离过程中要加入一定的在分离过程中要加入一定的Rnase抑制剂抑制剂3 3、核酸酶的抑制和抑制剂、核酸酶的抑制和抑制剂二、实验原理4 4、核酸制备中常用的、核酸制备中常用的去垢剂去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质，核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质，用于核酸提取的去垢剂一般都是阴离子去垢剂，用于核酸提取的去垢剂一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：去
6、垢剂的作用：溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解核糖体上面的蛋白，使其解聚，将核酸溶解核糖体上面的蛋白，使其解聚，将核酸释放出来；释放出来；对对Rnase和和Dnase有一定的抑制作用；有一定的抑制作用；如如:SDS，脱氧胆酸钠，脱氧胆酸钠，4-氨基水杨酸钠，萘氨基水杨酸钠，萘-1，5-二磺酸钠二磺酸钠等等二、实验原理5 5、核酸制备中常用的蛋、核酸制备中常用的蛋白质变性剂白质变性剂蛋白质变性剂的作用：蛋白质变性剂的作用：使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白质污染；除去，以防造成蛋白质污染；使蛋白质变性，
7、故可使核糖体解聚释放出核使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸；酸；某些蛋白质变性剂也可抑制某些蛋白质变性剂也可抑制Rnase活性和破活性和破裂细胞的作用；裂细胞的作用；如：如：苯酚、氯仿、盐酸胍、苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤破碎细胞破碎细胞提取提取纯化纯化二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤破碎细胞破碎细胞 微生物：溶酶菌、微生物：溶酶菌、SDS裂解；裂解；高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法酶法蛋白酶、胰蛋白酶；蛋白酶、胰蛋白酶；冰冻法冰冻法 反复冻融或液氮冻后反复冻融或液氮冻后组织捣碎；组织
8、捣碎；动物：液氮处理后用匀浆器破碎；动物：液氮处理后用匀浆器破碎；以上处理时均要以上处理时均要加入核酸酶抑制剂加入核酸酶抑制剂。二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离；病毒的核蛋白与其它成分分离；使核酸与蛋白质分离；使核酸与蛋白质分离；除去脂类；除去脂类；多糖的除去；多糖的除去；破碎细胞破碎细胞提取提取二、实验原理6 6、核酸制备的步骤、核酸制备的步骤根据所需核酸的性质和特点除去其它根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染，并除去其它提取过程中的核酸污染，并除去其它提取过程中的一系列试剂（盐、有
9、机溶剂等）杂质，一系列试剂（盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。最后得到均一的核酸样品。破碎细胞破碎细胞提取提取纯化纯化二、实验原理7 7、核酸样品的保存、核酸样品的保存核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质温度：温度：4 最佳最简单；最佳最简单；-70长期保存的良好温度；长期保存的良好温度；-20；保存介质：保存介质：TE缓冲液（最常用）缓冲液（最常用）10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1mmol/L EDTA pH 8.0三、实验试剂、仪器和耗材材料：材料：小鼠尾巴小鼠尾巴仪器：仪器：离心机、各种规格移液器、无离心机、各种规格移液器、无菌移液
10、器吸头、分光光度计菌移液器吸头、分光光度计试剂：试剂：组织基因组组织基因组DNA提取试剂盒提取试剂盒 无水乙醇无水乙醇四、实验步骤 在液氮中将组织块研磨粉碎；在液氮中将组织块研磨粉碎；取不多于取不多于50 mg磨碎的组织，放入磨碎的组织，放入1.5或或2.0 ml离心离心管中。注意：样本的磨碎程度将影响裂解效果。管中。注意：样本的磨碎程度将影响裂解效果。加入加入600ul的的FL Buffer和和10ul PK solution，混合，混合均匀。注意混合充分将有助于裂解。均匀。注意混合充分将有助于裂解。于于56温浴温浴15min（如果组织较难裂解完全，可（如果组织较难裂解完全，可以适当延长温浴
11、时间，甚至过夜）。然后以适当延长温浴时间，甚至过夜）。然后14000g离离心心3min。取取500ul上清液，至新的上清液，至新的2.0ml离心管中。离心管中。四、实验步骤 加入加入700ul binding buffer和和300ul无水乙醇，颠倒无水乙醇，颠倒混匀；混匀；将混合液转移至将混合液转移至Spin Colomn。于。于10000g离心离心1min，并弃去接液管中的液体。由于混合液体积大，并弃去接液管中的液体。由于混合液体积大于于750ul，请分两次离心过柱。，请分两次离心过柱。向向Spin colomn中加入中加入500ul的的PW Buffer。于。于10000g离心离心30s
12、，并弃去接液管中液体。，并弃去接液管中液体。向向Spin colomn中加入中加入600ul的的Wash Bufer。于。于10000g离心离心30s，并弃去接液管中液体。，并弃去接液管中液体。重复实验步骤重复实验步骤9。四、实验步骤11 再次将再次将Spin Colomn于于10000g离心离心1min，并将，并将Spin Colomn转移至一个新的转移至一个新的1.5ml离心管；离心管；12 向向Spin colomn中加入中加入100ul-200ul Elution Buffer,并于室温放置并于室温放置1min。13 10000g离心离心1min，并弃去，并弃去Spin Colomn,1.5 ml离离心管中液体含有心管中液体含有DNA。五、实验结果检测检测DNA的浓度和质量：的浓度和质量：取出一部分的取出一部分的DNA，用，用elution buffer稀释到一定的稀释到一定的倍数，用紫外分光光度计分别测定倍数，用紫外分光光度计分别测定OD260，OD280，OD320.DNA浓度浓度:（ug/ml）=50 x OD260 x 稀释倍数稀释倍数DNA质量质量:2.0 OD260-320/OD280-320 1.7注意：注意：1.0 OD260 0.1
