1、植物快速繁殖专题学习 基本技术陈 刚华南师范大学生命科学学院 2005.5基本技术实验室设备及器材 培养基及配制 实验操作技术 实验室设备及器材 常用设备器材 超净工作台 紫外灯 培养架 灭菌锅 电子天平 酸度计 人工气候箱 培养大棚玻璃器皿 量筒、容量瓶、培养皿、广口瓶、细口瓶、培养瓶、三角瓶、玻璃棒、移液管、滴瓶等 工具 解剖刀、镊子、剪刀、吸耳球、封口膜、酒精灯等培养基及配制 培养基：培养基成分（五大类）植物激素配制 母液的配制 培养基配制程序常用培养基配方 MS、B5、N6及各自特点培养基 培养基成分大致可以分为五大类，大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、植物激素（生长调节剂）。大量元
2、素 大量元素是指氮、磷、钾、钙、镁、硫等元素。其中氮是培养基中大量需要的。在MS培养基中，以铵态氮的含量为主。磷是生物必需的一种元素，也是作为能源aTP合成所不可缺少的，培养基中以磷酸根(P02)的形式添加，另外钾、钙、镁、硫等元素，也是植物生长所必需的，这些元素缺乏会产生缺素症，影响酶的活性和代谢。微量元素 微量元素是植物生命活动不可缺少的。锰、铜、钼、锌等是植物生长所需要的微量元素，MS培养基中经常使用。铁盐 铁在合成叶绿素中起重要作用，是植物生长不可缺少的金属元素，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。铁盐(FeSO4和FeCl2)在 pH5.2以上常成Fe(OH)2的不溶性沉淀，所以常用以
3、FeS047H20和Na2-EDTa结合成的螯合铁。有机成分 维生素是植物组织培养中经常使用的，有维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等。肌醇对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有促进作用，还可以增强愈伤组织的生长。在组织培养中，大多数情况不能正常进行光合作用，必须在培养基中加糖，作为碳源。同时糖的浓度对调节培养基的渗透压有一定作用。培养基中使用最普遍的是蔗糖，浓度为23。植物激素 植物激素是植物生命活动中不可缺少的物质，它能促进细胞的分裂生长及诱导器官的分化。组织培养中应用较多的有吲哚乙酸(IAA)；吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，
4、4二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6苄基氨基嘌呤(6-BA)、CPPU、TDZ等。配制 母液配制顺序是：1.用灵敏度为0.1mg的天平称取药品。2.往烧杯加入适量蒸馏水或无菌水。3.将药品放入烧杯内,并用玻璃棒搅拌使其溶解,难溶时可适当加温以加速溶解。4.要待一种药品完全溶解再加入下一种药品5.所加入的药品应依次加入，直至药品全部加入溶解为止。6.母液装入相应的瓶内，特别是有机成分的母液应该放入4冰箱。培养基配制顺序1.取烧杯或三角瓶注入一定量的蒸馏水，将各种母液按所需容积分别用移液管吸取并混合在一起，然后按要求加入一定量的激素、蔗糖后定容至一定体积。2.用1mol/L的NaOH或HCl调节pH。
5、3.如制固体培养基，则加入1%左右的琼脂后加热煮沸，使其熔化。4.分装，可用漏斗将液状培养基注入培养瓶，注入量视培养瓶容量大小而定，通常为容器的1/5左右。培养基配制顺序5.封瓶口。6.高压蒸汽灭菌。120，1.5Mpa,消毒1520min。注意压力不能太大，时间也不宜过长，否则蔗糖、有机物特别是维生素类物质会在高温下分解，影响培养基的酸碱度，琼脂也会分解，颜色变深且不易凝固。7.灭菌后的培养基可放入接种室内静置，让其降温后凝固，如需斜面可将其斜放。常用培养基配方 成分成分MSB5N6大量元素大量元素NH4NO3(NH4)2SO4KNO3CaCl22H2OKH2PO4 MgSO47H2O mg
6、/L16501900440170370 mg/L1343000150150500mg/L4632830166400185成分成分MSB5N6微量元素微量元素MnSO44H2OZnSO44H2OH3BO3KINa2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O mg/L22.38.66.20.830.250.0250.025 mg/L10230.750.250.0250.025mg/L4.41.51.60.8成分MSB5N6铁盐铁盐Na2EDTAFeSO47H2O mg/L37.2527.85 mg/L37.2527.85mg/L37.2527.85有机物质有机物质甘氨酸硫铵素烟酸盐酸吡哆
7、醇 肌醇 mg/L2.00.40.50.5100 mg/L1011100mg/L2.01.00.50.5特点1.MS培养基特点是无机盐浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也比较合适，也不需要附加更多的有机附加物。是目前应用最广泛的一种培养基。特点2.B5培养基特点是含有较低的铵，这个成分可能对不少培养物生长有抑制作用。从实践中得知，有些植物在B5培养基中生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。特点3.N6培养基的特点是成分简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高且不含钼。在国内已广泛用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和组织培养。实验操作技术
8、1.外植体的选择2.外植体的灭菌3.接种4.培养5.外植体褐化及防止6.玻璃化及预防 外植体的选择 外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。除培养基成分外，决定外植体培养成败的另一重要因素是外植体的来源。再有，不同品种、不同部位之间的分化能力都有巨大差别。外植体的选择1.选择合适的外植体部位2.不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的。在组织培养过程中，如何选择合适的、最以表达全能性的部位是决定组织培养体系成功的前提之一。外植体的选择2.选择优良的种质 3.无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对
9、材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。外植体的选择3.选择健壮的植株 4.组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。外植体的选择4.选择最适的时期 5.组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。一般进行快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，如选取茎尖，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高，携带细菌数量较少，在器官建成上也更为容易。此外，嫩叶、花蕾等携菌量较少，容易形成愈伤
10、组织。外植体的选择5.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.51.00cm之间。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。外植体的灭菌 灭菌的目的是既要杀死材料表面的全部微生物，又要不伤害材料，这要根据不同的材料，选用适当的消毒剂、合适的浓度和处理时间，灵活掌握。能够杀菌的消毒剂种类很多，但适于进行植物材料杀菌的消毒剂种类并不多。外植体的灭菌 常用灭菌剂的使用及其效果灭菌剂使用浓度(%)消除的难灭菌时间(min)效果次氯酸钠2易530很好次氯酸钙9-10易530很好漂白粉饱
11、和浓度易530很好氯化汞0.1-1较难210最好酒精7075易0.22好过氧化氢10-12最易515好溴水1-2易210很好硝酸银1较难530好抗菌素4-50mg/L中3060较好外植体的灭菌1.消毒步骤 用加有少许洗衣粉或洗洁精的水溶液洗12次或流水冲洗数小时7075%的酒精浸蘸几秒钟并摇动0.10.2的升汞(氯化汞，HgC12)+0.1吐温中-20的消毒液中浸泡35(或0.1升汞中浸泡10min)并摇动无菌水冲洗35次准备接种。外植体的灭菌2.注意事项消毒时间 在酒精溶液中浸蘸的时间不能过长，一般不超过30秒，否则材料会严重脱水而死亡。在消毒液中消毒的时间随材料的大小、忍耐力、种类和浓度而
12、异，最好要做预备试验来加以确定。外植体的灭菌消毒液用量 消毒液用量一般应是材料体积的510倍以上。消毒 消毒时一定要随时摇动，使材料表面尽可能全面地与消毒液接触；消毒后的材料应立即用无菌水清洗，并尽快切取所需外植体移入新鲜培养基上，减少在空气中的暴露时间，避免材料的风干和褐化。外植体的接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个接种过程均需无菌操作。外植体的接种 注意事项:1.操作人员须换经灭菌的工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行灭菌，进行操作前再用70的酒精擦洗双手。2.操作期间经常用70的酒精擦拭双手和
13、台面。外植体的接种 3.在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内。解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。4.工具用后及时灭菌，避免交叉污染。5.工作人员的呼吸也是污染的主要途径。6.由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。培养 接种后的外植体应送到培养室去培养。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH等。培养 1.光照 光照对离体培养物的生长发育具有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导来说，暗培养比光培养更合适。但器官的分化需要光照，并随着试管苗的生长，光照强度需要不断地加强，才能使
14、小苗生长健壮，并促进它从“异养”向“自养”转化，以提高移植后的成活率。培养 2.温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在2332之间。培养室一般所用的温度是252。低于15或高于35，对生长都是不利的。模仿自然界的昼夜温差，夜间暗培养时适当地降低温度，有利于组培苗生长健壮和诱导生根。培养 3.湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100；二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过
15、高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70一80的相对湿度。培养 4.氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。在固体培养中，最好采用通气性好的瓶盖或瓶塞。此外，愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质的枯竭，水分的散失，以及一些组织代谢产物的积累，必须将组织及时转移到新的培养基上。外植体褐变及防止 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。外植体
16、褐变及防止 一、褐变的原因 影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。外植体褐变及防止 1.与基因型有关 不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。外植体褐变及防止 2.与取样外植体的年龄有关 通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)
17、接种更为理想。外植体褐变及防止 3.与外植体取材时间有关 一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。外植体褐变及防止 4.与培养基有关过 高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。外植体褐变及防止 植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素B
18、A有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。一般在液体培养基和半固体培养基上褐化程度比在固体培养基上轻。外植体褐变及防止 5.培养条件不适宜 如温度过高、光照过强、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。在咖啡组织培养中曾观察到这一现象。外植体褐变及防止 6.材料转移时间时间 过长也会引起材料的褐变，以致全部死亡。外植体褐变及防止 二、褐变的防止措施 1 选择适宜的外植体及最佳培养基2 许多成功的经验表明，选择适当的外植体并建立最佳的培养条件是防止外植体褐变最主要的手段。外植体材料应有较强的分生能
19、力，在最适宜的细胞脱分化与再分化的培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。外植体褐变及防止 在培养条件的许多因子中，较为重要的是适宜的无机盐成分、适宜的蔗糖浓度及激素水平。适宜的温度及在黑暗条件下进行培养也可显著减少材料的褐变。如能在初始培养的16周内用暗培养，或在150lx左右的光强下进行光培养，可抑制酚类物质氧化。外植体褐变及防止 2 连续转移 对于易褐变的材料进行连续转移可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用。在无刺黑莓的茎尖培养中，接种后12d就转入新鲜培养基；在山月桂树的茎尖培养中，接种1224h便转入液体培养基，然后继续每天转移1次，连续7天，褐化便得到了完全控制。外
20、植体褐变及防止 3 加抗氧化剂 在培养基中加入抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成。抗氧化剂包括抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和牛血清白蛋白等。在静止的液体培养基中加入抗氧化剂比在固体培养基中加入抗氧化剂，效果要明显得多。在倒挂金钟茎尖培养中加入0.01PVP便对褐变有抑制作用。外植体褐变及防止 4 加活性炭 5 10.5的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。玻璃化及预防 植物组培玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质
21、，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃化及预防 玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。玻璃化及预防 一、玻璃现象及其产生原因 玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。玻璃化及预防 1.激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高(或细胞分裂素与生长素比例高)，易导致玻璃化苗的产生。产生玻璃化苗的细胞分裂素浓度因植物种类的不同而异。细胞分裂素的主要作用
22、是促进芽的分化，打破顶端优势，促进腋芽发生，因而玻璃化苗也表现为茎节较短、分枝较多的特点。使细胞分裂素增多的原因有以下几种：玻璃化及预防 1.培养基中一次性加入过多细胞分裂素，比如6BA、ZT等；2.细胞分裂素与生长素比例失调，细胞分裂素含量远远高于生长素，而使植物过多吸收细胞分裂素，体内激素比例严重失调试管苗无法正常生长，而导致玻璃化；3.在多次继代培养时愈伤组织和试管苗体内累积过量的细胞分裂素。在初级培养相同的培养基，最初的几代玻璃化现象很少，通常是继代次数越多玻璃化苗的比例越大。玻璃化及预防 2.琼脂浓度 培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻
23、璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼脂的浓度一定要适当。玻璃化及预防 3.温度 适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。玻璃化及预防 4.光照时间 不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在1012h光照下都能生长良好，光照时数大于15h时，玻璃化苗的比例明显增加。玻璃化及预防 5.通风条件 试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。玻璃化及预防 6.离子水平 植
24、物生长需要一定的矿物质营养，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。玻璃化及预防 二、预防措施 尽管玻璃化苗的出现已成为不少快速繁殖的中的普遍现象，但目前对某些植物的玻璃化已得到有效控制。玻璃化及预防 1.适当控制培养基中无机营养成分 大多数植物在MS培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于MS培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少
25、玻璃化苗的比例。玻璃化及预防 2.适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度 适当提高培养基中蔗糖的含量，可降低培养基中的渗透势，减少外植体从培养基中获得过多的水分。而适当提高培养基中琼脂的含量，尤其在高温季节，可降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，也可降低玻璃化；如将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。玻璃化及预防 3.适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 细胞分裂素和赤霉素可以促进芽的分化，但是为了防止玻璃化现象，应适当减少其用量，或增加生长素的比例。在继代培养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。玻璃化及预防 4.增加自然光照，控制光照时间 在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，
26、玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植物以812h为宜；光照度在100018001x之间，就此可以满足植物生长的要求。玻璃化及预防 5.控制好温度 培养温度要适宜植物的正常生长发育。如果培养室的温度过低，应采取增温措施。热击处理，可防治玻璃化的发生。如用40热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。玻璃化及预防 6.改善培养器皿的气体交换状况 如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。玻璃化及预防 7.在培养基中添加其他物质 在培养基中加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化，如用0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生。在培养基中加入0.3的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。
