1、 细胞融合能实现远缘杂交。其意义在细胞融合能实现远缘杂交。其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方法无新种的界限，有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基因型，扩大了遗传物质的重组范围。因型，扩大了遗传物质的重组范围。在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的
2、现象。象。通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。Electroporator 2510 from BrinkmannModel ECM830 from BTXA Alignment:Cells are brought into close contact by means of dielectrophoresis.B Fusion pulse:A squarewave pulse of a mere 15 microseconds is applied in order to permeate the membrane.The me
3、mbranes then fuse.C Heterokaryon phase:The cell membranes are fused completely and the cytoplasm has mixed together.Only the nuclei remain separate.D Entire fusion product:The nuclei are now fused as well.As a rule,the number of chromosomes is reduced.Fusion phases of oat protoplasts(Avena sativa)El
4、ectrofusion烟草叶肉及洋葱根尖烟草叶肉及洋葱根尖原生质体酶解分离原生质体酶解分离 提纯原生质体并调提纯原生质体并调整原生质体密度整原生质体密度a.调整融合仪参数，电击调整融合仪参数，电击使原生质体融合使原生质体融合b.PEG法使原生质体融合法使原生质体融合倒置显微镜观察并照相倒置显微镜观察并照相实验步骤：实验步骤：1.取酶储液取酶储液10ml，分别加入纤维素酶和果胶酶，分别加入纤维素酶和果胶酶0.08g,0.1g，制备酶液。，制备酶液。2.取材：烟草、洋葱根尖各取材：烟草、洋葱根尖各0.7g 取洋葱根尖，并将其切成取洋葱根尖，并将其切成0.5cm长短大小放入小长短大小放入小平皿中；取
5、烟草叶片将其剪成平皿中；取烟草叶片将其剪成0.5cm2 大小放入大小放入小平皿中。小平皿中。3.酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中，放入中，放入250c培养箱酶解。洋葱约培养箱酶解。洋葱约4h，烟草约，烟草约3h。4.观察酶解效果观察酶解效果5.原生质体的分离和纯化原生质体的分离和纯化 1）酶解后，用）酶解后，用300目铜网过滤酶液，去除未酶目铜网过滤酶液，去除未酶解的杂质，将滤液收集在解的杂质，将滤液收集在10ml离心管中。离心管中。2）1000转转/分离心分离心3分钟，用吸管或移液枪弃上分钟，用吸管或移液枪弃上清（注意不要把收集的原生质体吸走
6、）。清（注意不要把收集的原生质体吸走）。3）用）用CaCl2.2H2O（约（约1ml）悬浮下面的原生质）悬浮下面的原生质体（体（PEG法）；电融合法则用电融合液悬浮。法）；电融合法则用电融合液悬浮。4）显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多）显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多可重复可重复1）3）操作。）操作。完整洋葱原生质体（完整洋葱原生质体（40）完整烟草原生质体（完整烟草原生质体（40）6.原生质体的密度测定原生质体的密度测定 用血细胞记数板记数。每一样品测定用血细胞记数板记数。每一样品测定3次，根次，根据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至5*105
7、个个/ml。7.原生质体的融合原生质体的融合（一）（一）PEG法法 1）配制）配制PEG液（液（5ml）30%（w/v)PEG(MW=6000)1.5 g CaCl2.2H2O 0.0074g kH2PO4 0.0005 g 山梨醇山梨醇 0.0911g 调调pH 5.86.2 2）将两种原生质体悬液等量混合）将两种原生质体悬液等量混合3）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为为60mm的平皿中，每皿的平皿中，每皿78滴，每滴约滴，每滴约0.1ml。然后静置然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应有形成一薄层（
8、应有35个平皿的重复）。个平皿的重复）。4）用吸管将等量的）用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置体液滴上，再静置1015分钟。此时可取一个分钟。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。1 1、烟草叶肉和洋葱根尖细胞、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体融合（原生质体融合（40）2 2、烟草叶肉和洋葱根尖细、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合胞原生质体的异源融合（二）电融合法（二）电融合法 1）融合仪参数设置：融合仪参数设置：成串电流频率成串电流频率0.5MHz,电压电压30V,成串时间成串时间1min,
9、融合脉融合脉冲幅宽冲幅宽40S,融合电压融合电压150v,融合槽间距融合槽间距1mm 2）在融合小室中加入约）在融合小室中加入约100ul的原生质体悬浮液，将融的原生质体悬浮液，将融合小室接好电极后至于倒置显微镜下，静置约合小室接好电极后至于倒置显微镜下，静置约3min，使悬浮的原生质体沉降到平板底部，同时打开成串脉使悬浮的原生质体沉降到平板底部，同时打开成串脉冲输出开关及融合脉冲输出开关，使高压脉冲发生电冲输出开关及融合脉冲输出开关，使高压脉冲发生电路与融合小室接通。然后轻触脉冲触发开关，施加路与融合小室接通。然后轻触脉冲触发开关，施加3次次融合脉冲，每次间隔融合脉冲，每次间隔1s。融合脉冲
10、后成串脉冲再保持。融合脉冲后成串脉冲再保持1min。静置融合小室。静置融合小室2030min，在显微镜下观察融，在显微镜下观察融合过程。合过程。原生质体成串（原生质体成串（40）原生质体融合（图原生质体融合（图1）原生质体融合（图原生质体融合（图2）原生质体融合（图原生质体融合（图3）lTo“capture”disease resistance from wild potato specieslTo use segregating populations to identify plant disease resistance genes and transfer resistance int
11、o potato cultivarslIsolate protoplasts(typically leaf mesophyll)from two parental lineslFuse protoplasts either chemically(PEG)or using electrofusionlCell membranes fuse forming one cell containing 2 nucleilOn cell division nuclear material condenses together and hybrids cells are formed that contai
12、n DNA from both parental lines.Potato plants growing in a test tubeFreshly isolated potato protoplastsTwo protoplasts ready to fuse together Fusion products begin to divide on nutrient mediumIf the conditions are right,small shoots emerge from the green calliPutative somatic hybrid plants A fertile
13、somatic hybrid Phenotype of somatic hybrids clearly shows characteristics of both parents S.brevidens somatic hybrid S.tuberosumPhenotype of intraspecific diploids of S.tuberosum US-W9310.3 Somatic hybrid US-W9545.99Somatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant Verticillium wilt resistance test field at Hancock,Wisconsin Late blight resistance in backcross plant derived from somatic hybrids between S.bulbocastanum and potatoLine J101K6-A22 at Hancock Expt.Station(1)(1)(2)(3)(4)(5)HETEROKARYONLOSS OF ONE NUCLEUSNUCLEAR FUSIONCYTOPLASMIC HYBRIDS(CYBRIDS)SYNKARYON Thank you
