1、第二章第二章 蛋白质蛋白质第一节第一节 蛋白质的元素组成、分类及生物学功能蛋白质的元素组成、分类及生物学功能第二节第二节 氨基酸氨基酸第三节第三节 肽肽第四节第四节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构第五节第五节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系第六节第六节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质第七节第七节 蛋白质的分离纯化与鉴定蛋白质的分离纯化与鉴定第八节蛋白质组学简介第八节蛋白质组学简介 1 1、掌握基本氨基酸的结构、分类、性质以掌握基本氨基酸的结构、分类、性质以及肽的概念特点,分离纯化的基本方法。及肽的概念特点,分离纯化的基本方法。2 2、重点掌握蛋白质的结构、性质以及结构、重点掌
2、握蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系,蛋白质的分离纯化方和功能的相互关系,蛋白质的分离纯化方法、技术。法、技术。本章学习重点本章学习重点第一节第一节 蛋白质的元素组成、蛋白质的元素组成、分类及生物学功能分类及生物学功能一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类三、蛋白质的生物学功能三、蛋白质的生物学功能一、一、蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物蛋白质是一类含氮有机化合物,除含有碳、氢、氧,除含有碳、氢、氧外,还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些外,还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素,主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等
3、。这些元素元素,主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为:在蛋白质中的组成百分比约为:碳碳 50 50 氢氢 7 7 氧氧 23 23 氮氮 16%16%硫硫 0 03 3 其他其他 微微 量量蛋白质的含氮量蛋白质的含氮量v蛋白质的平均含氮量为蛋白质的平均含氮量为16%16%,这是蛋白质,这是蛋白质元 素 组 成 的 一 个 特 点,也 是元 素 组 成 的 一 个 特 点,也 是 凯 氏凯 氏(KjedahlKjedahl)定氮法)定氮法测定蛋白质含量的计测定蛋白质含量的计算基础。所以,可以根据生物样品中的算基础。所以,可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含
4、量:含氮量来计算蛋白质的大概含量:v蛋白质含量蛋白质含量=蛋白氮蛋白氮 6.25 6.25v6.256.25为为蛋白质系数蛋白质系数,即,即1 1克氮所代表的蛋克氮所代表的蛋白质量(克数)白质量(克数)三聚氰胺粉末不溶于冷水,溶于热水,微溶于乙二醇、甘油、不溶于冷水,溶于热水,微溶于乙二醇、甘油、乙醇,不溶于乙醚、苯、四氯化碳乙醇,不溶于乙醚、苯、四氯化碳,遇强酸或遇强酸或强碱水溶液水解。强碱水溶液水解。三聚氰胺含氮量高达66.6%其实凯氏定氮法的缺陷并不难弥补,只要多一其实凯氏定氮法的缺陷并不难弥补,只要多一道步骤即可:先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸道步骤即可:先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸
5、能让蛋白质形成沉淀,过滤后,分别测定沉淀和能让蛋白质形成沉淀,过滤后,分别测定沉淀和滤液中的氮含量,就可以知道蛋白质的真正含量滤液中的氮含量,就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量。和冒充蛋白质的氮含量。蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成 经酸、碱和酶处理蛋白质经酸、碱和酶处理蛋白质,使其彻底水解得,使其彻底水解得到产物为氨基酸,组成蛋白质的常见到产物为氨基酸,组成蛋白质的常见2020种氨基种氨基酸中除酸中除脯氨酸脯氨酸外,均为外,均为-氨基酸:氨基酸:C O O HCHH2NR不变部分不变部分可变部分可变部分二、二、蛋白质的分类蛋白质的分类1 1、据分子形状分、据分子形状分2 2、据分
6、子组成分、据分子组成分3 3、据溶解度分、据溶解度分4 4、据生物功能分、据生物功能分n球状蛋白质(球状蛋白质(globular protein)n*纤维状蛋白质(纤维状蛋白质(fibrous protein)外形接近球形或椭圆形,溶解性较好,细胞中的外形接近球形或椭圆形,溶解性较好,细胞中的大多数可溶性蛋白质如胞质酶类,属于此类。大多数可溶性蛋白质如胞质酶类,属于此类。n球状蛋白质(球状蛋白质(globular protein):v分子类似纤维或细棒。分子类似纤维或细棒。大都是结构蛋白,如胶原大都是结构蛋白,如胶原蛋白,角蛋白等。蛋白,角蛋白等。v可分为可溶性纤维状蛋可分为可溶性纤维状蛋白质
7、(如白质(如肌肉中的肌球蛋肌肉中的肌球蛋白)白)和不溶性纤维状蛋白和不溶性纤维状蛋白质(质(如胶原蛋白,角蛋白如胶原蛋白,角蛋白等)等)。*纤维状蛋白质(纤维状蛋白质(fibrous proteinfibrous protein):n简单蛋白简单蛋白(simple protein)n结合蛋白结合蛋白(conjugated protein)1 1、据分子形状分、据分子形状分2 2、据分子组成分、据分子组成分3 3、据溶解度分、据溶解度分4 4、据生物功能分、据生物功能分简单蛋白简单蛋白 又称为单纯蛋白质;这类蛋白质仅由氨基酸又称为单纯蛋白质;这类蛋白质仅由氨基酸组成,不含其它化学成分。组成,不含
8、其它化学成分。*清蛋白和球蛋白:清蛋白和球蛋白:albumin and globulin广泛存在于动广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水,球蛋白微溶于水,易溶于物组织中。清蛋白易溶于水,球蛋白微溶于水,易溶于稀酸中。稀酸中。*谷蛋白谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白(prolamin):植物蛋白,:植物蛋白,不溶于水,易溶于稀酸、稀碱中,后者可溶于不溶于水,易溶于稀酸、稀碱中,后者可溶于70708080乙醇中。乙醇中。*精蛋白和组蛋白精蛋白和组蛋白:碱性蛋白质,存在与细胞核中。:碱性蛋白质,存在与细胞核中。*硬蛋白硬蛋白:存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中,:存在于各种软骨
9、、腱、毛、发、丝等组织中,分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。结合蛋白结合蛋白 除氨基酸外,还含有其它化学成分(辅因除氨基酸外,还含有其它化学成分(辅因子),如:子),如:*色蛋白:含色素物质,如血红蛋白、细胞色素色蛋白:含色素物质,如血红蛋白、细胞色素等。等。*糖蛋白:含糖类物质,如细胞膜中的糖蛋白等。糖蛋白:含糖类物质,如细胞膜中的糖蛋白等。*脂蛋白:含脂类。,如血清脂蛋白:含脂类。,如血清-,-脂蛋白等。脂蛋白等。*核蛋白:含核酸结合而成,如核糖体。核蛋白:含核酸结合而成,如核糖体。1 1、据分子形状分、据分子形状分2 2、据分子组成分、据分子
10、组成分3 3、据溶解度分、据溶解度分4 4、据生物功能分、据生物功能分 清蛋白、球蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等谷蛋白、醇溶蛋白等n根据溶解度:根据溶解度:n清蛋白:又称白蛋白。溶于水。如乳清蛋白、血清清蛋白:又称白蛋白。溶于水。如乳清蛋白、血清清蛋白清蛋白n球蛋白:微溶于水,溶于稀中性盐溶液。如大豆球球蛋白:微溶于水,溶于稀中性盐溶液。如大豆球蛋白蛋白n谷蛋白:不溶于水、醇及中性盐溶液。但溶于稀酸、谷蛋白:不溶于水、醇及中性盐溶液。但溶于稀酸、稀碱。如米、麦蛋白稀碱。如米、麦蛋白n醇溶蛋白:不溶于水、溶于醇溶蛋白:不溶于水、溶于70-80%70-80%的乙醇。如玉米的乙醇。如玉米蛋
11、白蛋白 n另外还有精蛋白、组蛋白、硬蛋白等另外还有精蛋白、组蛋白、硬蛋白等 酶、结构蛋白、运输蛋酶、结构蛋白、运输蛋白、营养和储存蛋白、白、营养和储存蛋白、收缩蛋白和运动蛋白、收缩蛋白和运动蛋白、防御蛋白、调节蛋白防御蛋白、调节蛋白1 1、据分子形状分、据分子形状分2 2、据分子组成分、据分子组成分3 3、据溶解度分、据溶解度分4 4、据生物功能分、据生物功能分 三、蛋白质的生物学功能三、蛋白质的生物学功能1 1、催化功能、催化功能 酶类酶类2 2、结构功能、结构功能(胶原蛋白;韧带中的弹性蛋白;头发、指甲(胶原蛋白;韧带中的弹性蛋白;头发、指甲 和皮肤中的不溶性角蛋白;蚕丝、蛛网)和皮肤中的
12、不溶性角蛋白;蚕丝、蛛网)3 3、营养和储存功能、营养和储存功能(卵清蛋白和牛奶中的酪蛋白卵清蛋白和牛奶中的酪蛋白)4 4、运输功能、运输功能(血红蛋白、肌红蛋白血红蛋白、肌红蛋白)5 5、收缩或运动功能、收缩或运动功能(骨骼肌收缩(骨骼肌收缩肌动蛋白和肌球蛋白相肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动的结果)对滑动的结果)6 6、激素功能、激素功能(胰岛素胰岛素)7 7、保护和防御功能、保护和防御功能(蛋白质抗体和免疫球蛋白)(蛋白质抗体和免疫球蛋白)8 8、接受和传递信息功能、接受和传递信息功能(受体蛋白(受体蛋白)9 9、调节或控制细胞的生长、分化和遗传信息的表达功能、调节或控制细胞的生长、分化和遗传
13、信息的表达功能(组(组蛋白、阻遏蛋白)蛋白、阻遏蛋白)蛋白质是生命活动的物质基础,它参与了几乎所有蛋白质是生命活动的物质基础,它参与了几乎所有的生命活动过程。的生命活动过程。小小结结第一节第一节 蛋白质的元素组成、蛋白质的元素组成、分类及生物学功能分类及生物学功能一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类三、蛋白质的生物学功能三、蛋白质的生物学功能第二节第二节 氨氨 基基 酸(酸(amino acidamino acid)一、氨基酸的分类一、氨基酸的分类二、氨基酸的理化性质二、氨基酸的理化性质三、氨基酸的分离分析三、氨基酸的分离分析蛋白质的水解蛋白质的水解根据水解
14、程度根据水解程度 完全水解完全水解 氨基酸混合物氨基酸混合物 不完全水解不完全水解 大小不等的肽和氨基酸大小不等的肽和氨基酸 根据水解方法根据水解方法 酸水解:多数氨基酸稳定,不引起消旋作用;酸水解:多数氨基酸稳定,不引起消旋作用;TrpTrp完全被破完全被破坏,羟基氨基酸部分分解,坏,羟基氨基酸部分分解,GlnGln和和AsnAsn的酰胺基被水解下来。的酰胺基被水解下来。碱水解:碱水解:Trp Trp稳定;多数氨基酸被不同程度破坏,且产生稳定;多数氨基酸被不同程度破坏,且产生消旋现象,消旋现象,ArgArg脱氨。脱氨。酶水解:不产生消旋作用,也不破坏氨基酸,但需多种酶酶水解:不产生消旋作用,
15、也不破坏氨基酸,但需多种酶协同作用。协同作用。水解方法水解方法反应条件反应条件产物产物优点优点缺点缺点酸水解酸水解6M HCl 或或4M H2SO4共煮共煮20hrsL-aa不引起消不引起消旋旋Trp被破坏;被破坏;一部分羟基一部分羟基aa(Ser,Thr)被分解;被分解;Asn 和和Gln 的酰胺基被的酰胺基被水解下来水解下来碱水解碱水解5M NaOH共煮共煮20hrsL-aa 和和D-aa混合物混合物不破坏不破坏Trp引起消旋;引起消旋;Arg 脱氨基脱氨基生成鸟氨酸生成鸟氨酸酶水解酶水解生理温度、生理温度、pH肽段和氨基肽段和氨基酸混合物酸混合物不破坏不破坏aa不引起消不引起消旋旋酶解时
16、间长酶解时间长蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成l目前已发现的氨基酸有目前已发现的氨基酸有250250多种。但是组成蛋白质多种。但是组成蛋白质的常见的氨基酸只有的常见的氨基酸只有2020种,称为种,称为基本氨基酸基本氨基酸。l各种蛋白质所含的各种蛋白质所含的2020种常见氨基酸的种类和数目种常见氨基酸的种类和数目各不相同。或者说,各不相同。或者说,2020种常见氨基酸不同的排列顺种常见氨基酸不同的排列顺序组成了特定的蛋白质。序组成了特定的蛋白质。蛋白质分子中的氨基酸组成与其性质相关。此外蛋白质分子中的氨基酸组成与其性质相关。此外蛋白质分子中氨基酸组成及比例与其结构也有一定蛋白质分子中氨基酸组
17、成及比例与其结构也有一定的关系。的关系。一、氨基酸的分类一、氨基酸的分类根据是否组成蛋白质分为:根据是否组成蛋白质分为:1.1.蛋白质中常见氨基酸蛋白质中常见氨基酸 2.2.蛋白质中稀有氨基酸蛋白质中稀有氨基酸 3.3.非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸根据根据R R侧链极性分类侧链极性分类根据根据R R侧链结构分类侧链结构分类从营养学角度分类从营养学角度分类1.1.常见蛋白质氨基酸(常见蛋白质氨基酸(2020种)种)v有对应的遗传密码。有对应的遗传密码。v近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸,有证据表明此氨基酸由终止密码胱氨酸,有证据表明此氨基酸由终止密码
18、UGAUGA编码,可能是第编码,可能是第2121种蛋白质氨基酸。种蛋白质氨基酸。结构通式(脯氨酸除外)结构通式(脯氨酸除外)共同特点:共同特点:L-L-型,羧基相连的型,羧基相连的-碳上连接碳上连接-NH-NH2 2,所以都是,所以都是L-L-氨基酸。氨基酸。C O O HCHH2NR不变部分不变部分可变部分可变部分 根据根据R R基团极性基团极性2020种常见氨基酸又分为种常见氨基酸又分为(1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸:基团氨基酸:8 8种种Ala Val Leu Ile Ala Val Leu Ile Phe Pro Trp MetPhe Pro Trp Met(2)(2)极性不
19、带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸:基团氨基酸:7 7种种Gly Ser Thr Gly Ser Thr Tyr Asn Gln CysTyr Asn Gln Cys(3)(3)带负电荷带负电荷R R基团氨基酸:基团氨基酸:2 2种种Asp GluAsp Glu(4)(4)带正电荷带正电荷R R基团氨基酸:基团氨基酸:3 3种种Lys Arg HisLys Arg His 1 1、蛋白质中常见氨基酸的结构、蛋白质中常见氨基酸的结构(1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCH CCH3OHO-氨基丙酸氨基丙酸丙氨酸丙氨酸 Alanine(1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基
20、团氨基酸 H2NCH CCHOHOCH3CH3-氨基异戊酸氨基异戊酸丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine(1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCH CCH2OHOCH CH3CH3-氨基异己酸氨基异己酸丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine -氨基氨基-甲基戊酸甲基戊酸丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine(1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸(1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCHCCH2OHO -氨
21、基氨基-苯基丙苯基丙酸酸丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine苯丙氨酸苯丙氨酸 Phenylalanine (1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸HNCOHO-吡咯烷基吡咯烷基-羧酸羧酸丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine苯丙氨酸苯丙氨酸 Phenylalanine脯氨酸脯氨酸 Proline(1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCHCCH2OHOHN -氨基氨基-吲哚基丙吲哚基丙酸酸丙氨酸丙氨酸 Alan
22、ine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine苯丙氨酸苯丙氨酸 Phenylalanine脯氨酸脯氨酸 Proline色氨酸色氨酸 Tryptophan (1)(1)非极性非极性R R基团氨基酸基团氨基酸H2NCHCCH2OHOCH2SCH3 -氨基氨基-甲硫基丁酸甲硫基丁酸丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine苯丙氨酸苯丙氨酸 Phenylalanine(F)脯氨酸脯氨酸 Proline色氨酸色氨酸 Tryptophan(W)甲硫氨酸甲硫氨酸 Methionine R
23、 R基疏水性大小基疏水性大小 Ala AlaMetMetProProValValLeuLeuIleIlePhePheTrpTrp 这类氨基酸这类氨基酸R R基的疏水性在维持蛋白质的三维基的疏水性在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。结构中起着重要作用。特点:不易溶于水特点:不易溶于水ProPro是唯一的一种是唯一的一种-亚氨基酸,它在蛋白亚氨基酸,它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用,一般出现质空间结构中具有极重要的作用,一般出现在两段在两段-螺旋之间的拐角处。螺旋之间的拐角处。HNCOHO (2)(2)极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸H2NCH CHOHO氨基乙酸氨基乙酸甘
24、氨酸甘氨酸 Glycine (2)(2)极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCH CCH2OHOOH -氨基氨基-羟基丙羟基丙酸酸甘氨酸甘氨酸 Glycine 丝氨酸丝氨酸 Serine (2)(2)极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸H2NCH CCHOHOOHCH3 -氨基氨基-羟基丁羟基丁酸酸甘氨酸甘氨酸 Glycine 丝氨酸丝氨酸 Serine苏氨酸苏氨酸 Threonine (2)(2)极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸H2NCHCCH2OHOOH -氨基氨基-对羟苯基丙对羟苯基丙酸酸甘氨酸甘氨酸 Glycine 丝氨酸丝氨酸 S
25、erine苏氨酸苏氨酸 Threonine酪氨酸酪氨酸 Tyrosine(2)(2)极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCH CCH2OHOCNH2O甘氨酸甘氨酸 Glycine 丝氨酸丝氨酸 Serine苏氨酸苏氨酸 Threonine酪氨酸酪氨酸 Tyrosine天冬酰胺天冬酰胺 Asparagine(2)(2)极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCHCCH2OHOCH2CNH2O甘氨酸甘氨酸 Glycine 丝氨酸丝氨酸 Serine苏氨酸苏氨酸 Threonine酪氨酸酪氨酸 Tyrosine天冬酰胺天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺谷氨
26、酰胺 Glutamine(2)(2)极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸甘氨酸甘氨酸 Glycine 丝氨酸丝氨酸 Serine苏氨酸苏氨酸 Threonine酪氨酸酪氨酸 Tyrosine天冬酰胺天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺谷氨酰胺 Glutamine(Q)半胱氨酸半胱氨酸 Cysteine H2NCH CCH2OHOSH -氨基氨基-巯基丙巯基丙酸酸特点:这类氨基酸侧链含极性基团,但在生理条件下不解离,特点:这类氨基酸侧链含极性基团,但在生理条件下不解离,易溶于水,易溶于水,R R侧链能与水形成氢键。侧链能与水形成氢键。Cys Cys中中R R含巯基(含巯基(-SH
27、-SH),两个),两个CysCys的巯基的巯基 氧化生成二硫键,生成胱氨酸。氧化生成二硫键,生成胱氨酸。二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。(3)(3)带负电荷带负电荷R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCH CCH2OHOCOHO -氨基丁二酸氨基丁二酸天冬氨酸天冬氨酸 Aspartate(3)(3)带负电荷带负电荷R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCH CCH2OHOCH2COHO -氨基戊二酸氨基戊二酸天冬氨酸天冬氨酸 Aspartate(D)谷氨酸谷氨酸 Glutamate(E)在生理条件下在生理条件下,侧链侧链羧基羧基完全解完全解离,带负电荷。离,带
28、负电荷。为酸性氨基酸。为酸性氨基酸。(4)(4)带正电荷带正电荷R R基团氨基酸基团氨基酸H2NCH CCH2OHOCH2CH2CH2NH2,-二氨基己酸二氨基己酸赖氨酸赖氨酸 Lysine(4)(4)带正电荷带正电荷R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCHCCH2OHOCH2CH2NHCNH2NH -氨基氨基-胍基戊胍基戊酸酸赖氨酸赖氨酸 Lysine精氨酸精氨酸 Arginine(4)(4)带正电荷带正电荷R R基团氨基酸基团氨基酸 H2NCH CCH2OHONNH -氨基氨基-咪唑基丙咪唑基丙酸酸赖氨酸赖氨酸 Lysine(K)精氨酸精氨酸 Arginine组氨酸组氨酸 Histidine
29、在生理条件下,侧链解离,带正电荷。在生理条件下,侧链解离,带正电荷。为碱性氨基酸。为碱性氨基酸。另外,根据另外,根据R R侧链的化学结构,侧链的化学结构,2020种常见种常见氨基酸氨基酸 可以分为:可以分为:v脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸 (1515种)种)v芳香族氨基酸(芳香族氨基酸(Phe,TyrPhe,Tyr)v杂环族氨基酸杂环族氨基酸 (Trp,His,ProTrp,His,Pro)从营养学角度分类:必需氨基酸和非必需氨基从营养学角度分类:必需氨基酸和非必需氨基酸酸必需氨基酸:必需氨基酸:人和哺乳动物不可缺少但又不能自身合人和哺乳动物不可缺少但又不能自身合成的氨基酸,只能从食物中补充成的氨
30、基酸,只能从食物中补充。包括包括8 8种种(Ile、Met、Val、Leu、Trp、Phe、Thr、Lys)“一家写两三本书来一家写两三本书来”还有还有2 2种:种:ArgArg、HisHis,人和哺,人和哺乳动物虽然能够合成,但数量远远达不到机体的需求,乳动物虽然能够合成,但数量远远达不到机体的需求,尤其是在胚胎发育以及婴幼儿期间,基本上也是由食尤其是在胚胎发育以及婴幼儿期间,基本上也是由食物中补充,称为物中补充,称为半必需氨基酸。半必需氨基酸。注:植物和微生物能合成自己全部的氨基酸。注:植物和微生物能合成自己全部的氨基酸。2.2.蛋白质中几种重要的稀有氨基酸蛋白质中几种重要的稀有氨基酸在少
31、数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸,通常称在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸,通常称为为稀有的蛋白质氨基酸。稀有的蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。在这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。在 遗传上,不具有遗传密码。遗传上,不具有遗传密码。其中重要的有其中重要的有4-4-羟基脯氨酸、羟基脯氨酸、5-5-羟基赖氨酸、羟基赖氨酸、N-N-甲基甲基赖氨酸、和赖氨酸、和3,5-3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。基酸的结构如下。NHHOCOOH4-羟基脯氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羟基赖
32、氨酸NH2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基赖氨酸HOIICH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸 3.3.非蛋白氨基酸(非蛋白氨基酸(200200多种)多种)广泛存在于各种细胞和组织中,呈游离或结广泛存在于各种细胞和组织中,呈游离或结合态,但并不存在于蛋白质中的一类氨基酸,合态,但并不存在于蛋白质中的一类氨基酸,大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。大部分也是蛋白质氨基酸的衍生物。H H2 2N-CHN-CH2 2-CH-CH2 2-COOH H-COOH H2 2N-CHN-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH-丙氨酸丙氨酸-氨基丁酸氨基丁酸
33、 非蛋白氨基酸存在的意义非蛋白氨基酸存在的意义:(1)(1)作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分:作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分:D-Glu D-AlaD-Glu D-Ala(2)(2)作为一些重要代谢物的前体或中间体作为一些重要代谢物的前体或中间体:-丙氨酸、鸟丙氨酸、鸟氨酸(氨酸(OrnOrn)、胍氨酸()、胍氨酸(CitCit)(3)(3)作为神经传导的化学物质:作为神经传导的化学物质:-氨基丁酸氨基丁酸(4)(4)有些氨基酸只作为一种有些氨基酸只作为一种N N素的转运和贮藏载体素的转运和贮藏载体(5)(5)杀虫防御作用杀虫防御作用:如种子中高浓度的刀豆氨酸和如种子中高浓度的刀豆氨酸和5-5-羟色
34、羟色氨酸能防止毛虫的危害,高精氨酸能抑制细菌的生长。氨酸能防止毛虫的危害,高精氨酸能抑制细菌的生长。绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。1.1.高熔点高熔点2.2.一般均溶于水,溶于强酸、强碱;不溶于乙一般均溶于水,溶于强酸、强碱;不溶于乙醚。醚。3.3.氨基酸一般有味:氨基酸一般有味:如大米的香味(如大米的香味(Cys)Cys)、啤、啤酒的苦味(酒的苦味(ValVal、LeuLeu、IleIle)氨基酸的两个重要性质:氨基酸的两个重要性质:氨基酸晶体的熔点氨基酸晶体的熔点高(高(200200 C C);氨基酸使水的介电常数增高。);氨基酸使水的介电常数增高。二
35、、二、氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质二、二、氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质 除甘氨酸外,其他氨基除甘氨酸外,其他氨基酸含有一个手性酸含有一个手性-碳原碳原子,因此都具有旋光性子,因此都具有旋光性。(二)氨基酸的光学性质(二)氨基酸的光学性质l旋光性:旋光性:旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。使偏振面向右旋的,称右旋光物旋转的能力。使偏振面向右旋的,称右旋光物质,记为质,记为“+”,使偏振面向左旋的,称左旋,使偏振面向左旋的,称左旋光物质,记为光物质,记为“-”。l氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。氨基酸的旋光性是由它们的结构决定的。l除甘氨酸外,
36、其它氨基酸的除甘氨酸外,其它氨基酸的-C-C原子都与四个原子都与四个不同的原子和基团连接,因而是不对称不同的原子和基团连接,因而是不对称C C原子。原子。l手性中心手性中心(chiral centerchiral center):当一个):当一个C C原子有原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳四个不同的取代基同它连接形成一个不对称碳原子时,这个碳原子就是一个不对称中心或称原子时,这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中心。做手性中心。2.2.氨基酸的光吸收氨基酸的光吸收构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基种氨基酸在可见光区都没有光酸在可见光区都没有光吸收,但在远紫外区吸收,但在远紫
37、外区(220nm)(97%97%以上);以上);b b、测定蛋白质的分子质量。、测定蛋白质的分子质量。(用于估算氨(用于估算氨基酸残基数从而估计序列测定工作量的大小)基酸残基数从而估计序列测定工作量的大小)测定蛋白质一级结构前的要求测定蛋白质一级结构前的要求 分子质量测定的要求并不高,目前用物理化学方法分子质量测定的要求并不高,目前用物理化学方法测出的分子质量,误差在测出的分子质量,误差在10%10%左右就足够了。左右就足够了。常用测定方法有:常用测定方法有:凝胶过滤法;凝胶过滤法;SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法;聚丙烯酰胺凝胶电泳法;沉降分析法等沉降分析法等1 1、凝胶过滤法、凝胶过滤
38、法原理:原理:根据蛋白质的分子量的大根据蛋白质的分子量的大小分离,在一定范围内蛋小分离,在一定范围内蛋白质的白质的分子量的对数和洗分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系脱体积之间成线性关系。Ve/Vo分子量对数分子量对数SDS-PAGE法测定分子量法测定分子量1)1)支持介质支持介质聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺(PAGE)(PAGE)丙烯酰胺丙烯酰胺为单体,为单体,N N,N N亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂聚合而成的具亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂聚合而成的具网状网状结构的凝胶;结构的凝胶;在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(烷基硫酸钠(SDS),使蛋白
39、样品与),使蛋白样品与SDS结合形结合形成带成带负电荷的复合物负电荷的复合物,由于复合物,由于复合物分子量的不同分子量的不同,在电泳中反应出在电泳中反应出不同的迁移率不同的迁移率。根据根据标准样品标准样品在该系统电泳中所作出的在该系统电泳中所作出的标准曲标准曲线线,推算出被测蛋白样品分子量的,推算出被测蛋白样品分子量的近似值近似值。相对迁移率相对迁移率m mR R=样品迁移距离(样品迁移距离(cmcm)/染料迁移距离(染料迁移距离(cmcm)点样孔点样孔染料迁移距离染料迁移距离样品迁移距离样品迁移距离 MrMr =bmbmR R +K +KMrMr为蛋白质分子量为蛋白质分子量m mR R为相对
40、迁移率为相对迁移率b b为斜率为斜率K K为截距。为截距。沉降速度法沉降速度法一级结构测定步骤一级结构测定步骤(1 1)测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目(2 2)拆分蛋白质分子中的多肽链)拆分蛋白质分子中的多肽链(3 3)断裂多肽链内的二硫键)断裂多肽链内的二硫键(4 4)测定多肽链的氨基酸组成测定多肽链的氨基酸组成(5 5)分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端末端(6 6)多肽链部分裂解成肽段)多肽链部分裂解成肽段(7 7)测定各个肽段的氨基酸顺序)测定各个肽段的氨基酸顺序(8 8)确定肽段在多肽链中的顺序)确定肽段在多肽链中的顺序(9 9)确定多肽链
41、中二硫键的位置)确定多肽链中二硫键的位置一级结构测定步骤一级结构测定步骤根据根据N N末端或末端或C C末端末端残基摩尔数和蛋白残基摩尔数和蛋白质摩尔数(根据分质摩尔数(根据分子质量计算)确定子质量计算)确定(1 1)测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目(2 2)拆分蛋白质分子中的多肽链)拆分蛋白质分子中的多肽链(3 3)断裂多肽链内的二硫键)断裂多肽链内的二硫键(4 4)测定多肽链的氨基酸组成测定多肽链的氨基酸组成(5 5)分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端末端(6 6)多肽链部分裂解成肽段)多肽链部分裂解成肽段(7 7)测定各个肽段的氨基酸顺序)测定各
42、个肽段的氨基酸顺序(8 8)确定肽段在多肽链中的顺序)确定肽段在多肽链中的顺序(9 9)确定多肽链中二硫键的位置)确定多肽链中二硫键的位置(2 2)拆分蛋白质分子中的多肽链)拆分蛋白质分子中的多肽链测定步骤测定步骤s ss sHCOOOHCOOOH HSOSO3 3H HSOSO3 3H H多肽链之间有两种结合方式:多肽链之间有两种结合方式:非共价键结合:非共价键结合:8mol/L 8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍盐酸胍二硫键结合二硫键结合:a.a.过甲酸氧化过甲酸氧化 b.b.巯基乙醇还原:可在巯基乙醇还原:可在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/
43、L盐酸胍存在盐酸胍存在下,用过量的下,用过量的-巯基乙醇处理巯基乙醇处理,使二硫键还原为巯基,然后使二硫键还原为巯基,然后用烷基化试剂(用烷基化试剂(ICHICH2 2COOHCOOH)保护生成的巯基,以防止它重)保护生成的巯基,以防止它重新被氧化。新被氧化。(3 3)断裂多肽链内的二硫键)断裂多肽链内的二硫键胰岛素胰岛素 -巯基乙醇巯基乙醇碘乙酸碘乙酸(4 4)测定多肽链的氨基酸组成测定多肽链的氨基酸组成测定步骤测定步骤 完全水解,测定每种氨基酸的含量,根据蛋白质分子质量,可完全水解,测定每种氨基酸的含量,根据蛋白质分子质量,可以算出蛋白质的氨基酸组成(每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的以算出蛋白
44、质的氨基酸组成(每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数)摩尔数),以便选择用何种方法裂解蛋白质。以便选择用何种方法裂解蛋白质。酸水解:酸水解:6 mol/L6 mol/L的盐酸或的盐酸或4 mol/L4 mol/L的硫酸在的硫酸在105-110105-110条件下条件下进行水解,反应时间约进行水解,反应时间约10102424小时。缺点是小时。缺点是TrpTrp被沸酸完全破被沸酸完全破坏;含有羟基的氨基酸如坏;含有羟基的氨基酸如SerSer、ThrThr、TyrTyr有一小部分被分解;有一小部分被分解;AsnAsn、GlnGln侧链的酰胺基被水解成了羧基。侧链的酰胺基被水解成了羧基。碱水解:用碱水解
45、:用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸2020小时。该法的优点是色氨小时。该法的优点是色氨酸酸(Trp)(Trp)在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。酶解:胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。酶解:胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。(5 5)分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端末端测定步骤测定步骤N-N-末端末端残基残基:2,4-2,4-二硝基氟苯法二硝基氟苯法丹磺酰氯法丹磺酰氯法苯异硫氰酸酯法苯异硫氰酸酯法氨肽酶法氨肽酶法 C C-末端末端残基:残基:肼解法肼解法羧肽酶法羧肽酶法1 1、N N端分析(氨基末端分析)端分析(氨基末端分析)二硝
46、基氟苯(二硝基氟苯(FDNB)法)法O2NFNO2+H2NCH CROHNCH CROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCH CROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸FDNBFDNBEdman降解法(苯异硫氰酸酯法)降解法(苯异硫氰酸酯法)N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸乙酸乙酯抽提乙酸乙酯抽提色谱鉴定色谱鉴定氨肽酶法氨肽酶法l 氨肽酶是一种肽链氨肽酶是一种肽链外切酶外切酶,它能从多肽链的,它能从多肽链的N-N-端端逐个向逐个
47、向里水解。里水解。l 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的AAAA种类和数种类和数量,按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线,从量,按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线,从而知道而知道Pr N-Pr N-末端残基顺序。末端残基顺序。l 最常用为最常用为亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶,水解以亮氨酸残基为,水解以亮氨酸残基为N-N-末端的末端的肽键速度最大。肽键速度最大。NH2PheGluLeu.2 2、C-C-末端分析(羧基末端分析)末端分析(羧基末端分析)H2NCHCROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2
48、NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸苯甲苯甲醛醛不溶于水不溶于水DNFBDNFBDNFB-AADNFB-AA色谱分析色谱分析鉴定鉴定水相水相NH2PheGluLeu.COOHPheGluLeu.LeuGluPheCOOH羧肽酶羧肽酶A羧肽酶羧肽酶BLeuProLys(Arg or Pro)COOH不能切割不能切割不能切割不能切割LeuProLys(Arg)COOH能切割能切割小结小结:蛋白质的末端分析(蛋白质的末端分析(N N、C C端)端)N N末端分析末端分析二硝基氟苯(二硝基氟苯(FDNB)法)法Edman降解法降解法丹磺酰氯(丹磺酰氯(DNS-Cl)
49、法)法氨肽酶法氨肽酶法C C末端分析末端分析肼解法肼解法羧肽酶羧肽酶测定步骤测定步骤(6 6)多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段 可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片,并将其分离开来。裂成两套或多套肽段或肽碎片,并将其分离开来。A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 酶解法酶解法:胰蛋白酶,糜蛋白酶,胃蛋白酶,嗜热胰蛋白酶,糜蛋白酶,胃蛋白酶,嗜热菌蛋白酶,羧肽酶和氨肽酶菌蛋白酶,羧肽酶和氨肽酶n 化学法:化学法:溴化氰,羟胺溴化氰,羟胺Trypsinase :R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg侧链(专
50、一性较侧链(专一性较强,水解速度快)。强,水解速度快)。R R2 2=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin):):R1=Phe,Trp,Tyr;R1=Phe,Trp,Tyr;LeuLeu,MetMet和和HisHis水水解稍慢。解稍慢。R R2 2=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链肽链水解位点水解位点糜蛋白酶糜蛋白酶Pepsin:R R1 1和和R R2 2Phe,T