1、第四章第四章 基因工程的主要技术及其原理基因工程的主要技术及其原理生命科学学院生命科学学院第四章第四章 基因工程的主要技术及其原理基因工程的主要技术及其原理 第一节第一节 DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化 第二节第二节 凝胶电泳凝胶电泳 第三节第三节 核酸和蛋白质的分子杂交核酸和蛋白质的分子杂交 第四节第四节 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术 第五节第五节 DNA序列分析序列分析 第六节第六节 基因定点诱变基因定点诱变 第七节第七节 DNA与蛋白质互作分析与蛋白质互作分析 生命科学学院生命科学学院第一节第一节 DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化 核酸是遗传信息的载体，是最重要
2、的生物信息核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作作 。生命科学学院生命科学学院第一节第一节 DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化核酸提取与纯化的原则核酸提取与纯化的原则保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要过高温度不要过高 控制一定的控制一定的pHpH值范围值范围(pH(pH值值5-9)5-9)保持一定的离子强度保持一定的离子强度 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力减少物理因素对核酸降
3、解的机械剪切力防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。需加核酸酶抑制剂。生命科学学院生命科学学院第一节第一节 DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化 DNA DNA酶抑制剂酶抑制剂 金属离子螯合剂：金属离子螯合剂：DNADNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，因此使用的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制金属
4、二价离子螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。如酶活性。如EDTA-NaEDTA-Na2 2(乙乙二胺四乙酸二钠二胺四乙酸二钠)、8-8-羟基喹啉；羟基喹啉；阴离子型表面活性剂：阴离子型表面活性剂：如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。合物在高盐溶液中沉淀。生命科学学院生命科学学院第一节第一节 DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化 RNA RNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂 RNAaseRNAas
5、e分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。耐碱，不宜失活。皂土（皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。，使其失活。肝素肝素 复合硅酸盐（复合硅酸盐（Macaloid)RNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasin）氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-Ribonucleoside Complex,VRC)生命科学学院生命科学学院第一节第一节 DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化RNARNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂 DEPC(二
6、乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。使用注意：使用注意：DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。倍。容易降解，保存在容易降解，保存在4 或液氮中；或液氮中；提提RNA时，时，0.1%DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h。剧毒。剧毒。生命科学学院生命科学学院第一节第一节 DNA和和RNA的提取和纯化的提取和纯化一般程序一般程序
7、 1、供体的核酸分离、供体的核酸分离 供体细胞培养供体细胞培养 收集收集(菌体菌体)细胞细胞 细胞破碎细胞破碎 分离总分离总DNA 分离细胞器分离细胞器 分离总分离总RNA 分离细胞器分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性特异性RNA 染色体染色体DNA(组建基因组文库组建基因组文库)生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 DNA DNA提取的几种方法提取的几种方法 基因组基因组DNADNA的提取的提取 CTABCTAB法法 SDSSDS法法 其它其它 非基因组非基因组DNADNA的提取的提取 质粒质粒DNADNA的提取的提取 碱裂解法碱
8、裂解法 煮沸法煮沸法 线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNADNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDSSDS裂解法裂解法生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 基因组基因组DNA-CTABDNA-CTAB法原理（植物法原理（植物DNADNA提取经典方法）提取经典方法）CTABCTAB（hexadecyltrimethylammonium bromidehexadecyltrimethylammonium bromide，十六，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物
9、。膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl0.7mol/L NaCl）是可溶的，）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：注：CTABCTAB溶液在低于溶液在低于15 15 时会形成沉淀析出，因此时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于不要低于1515。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理
10、与方法CTABCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞
11、膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除酚容易去除生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法CTABCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 PVPPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNADNA中酚的污染中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。组份组份 Tris
12、-HCl Tris-HCl（pH8.0pH8.0）EDTA EDTA（pH8.0pH8.0）NaClNaCl CTAB CTAB PVP40 PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 100 mM 20 mM 20 mM1.4M1.4M 3%(W/V)3%(W/V)5%(W/V)5%(W/V)2%2%（V/VV/V）使用前加入使用前加入生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 CTAB CTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀
13、DNADNA溶液溶液生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 基因组基因组DNA-DNA-SDS法原理法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的沉淀水
14、相中的DNA。SDSSDS法法DNADNA提取缓冲液提取缓冲液组份组份Tris-HCl Tris-HCl（pH8.0pH8.0）EDTA EDTA（pH8.0pH8.0）NaClNaClSDSSDS终浓度终浓度 10 mM 10 mM 20 mM 20 mM0.4M0.4M2%2%生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法SDSSDS法流程图（以动物组织为例）法流程图（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNADNA溶液溶液生命科学学院生命科学学院一、一、DN
15、A提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法基因组基因组DNA-DNA-其它方法其它方法 根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法 化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式生物方式：酶法：酶法生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法基因组基因组DNA-DNA-其它方法其它方法 根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法吸附材料结合法 硅质材料硅质材料:高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合
16、核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。阴离子交换树脂阴离子交换树脂:低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值值洗脱。适用于纯度要求高的实验。洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁珠磁珠:磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。从而达到分离目的。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法基因组基因组DNA-DNA-其它方法其它方法 根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：浓盐法：浓盐法：利用利用RNPRNP和和DNPDNP在盐溶液中溶解度不同，将
17、二在盐溶液中溶解度不同，将二者分离者分离 有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用制核酸酶的降解作用 密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物离各种内容物生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 碱裂解法由碱裂解法由BirnboimBirnboim和和DolyDoly设计并于设计并于19791979年发表，基年发表，基于染色体于染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA变性与复性的差异而
18、达到分离目的。变性与复性的差异而达到分离目的。在在pHpH高达高达12.512.5的碱性条件下，染色体的碱性条件下，染色体DNADNA的氢键断裂，的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒双螺旋结构解开而变性，质粒DNADNA的大部分氢键也断裂，的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以当以pH4.6pH4.6的的KAcKAc高盐缓冲液调节其高盐缓冲液调节其pHpH至中性时，变性至中性时，变性的质粒的质粒DNADNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNADNA不能复性而形成缠连
19、的网状结构。不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体通过离心，染色体DNADNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNARNA、蛋白质、蛋白质-SDS-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。复合物等一起沉淀下来而被除去。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液碱裂解法流程图碱裂解法流程图生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本
20、原理与方法提取的基本原理与方法质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法(溶液配方溶液配方)Solution 50 mmol/L 葡萄糖、葡萄糖、25 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA(pH 8.0)高压灭菌后，高压灭菌后，4保存备用。保存备用。Solution(现用现配制现用现配制)0.2 mol/L NaOH、1%SDS Solution（100 ml）5mol/L KAc 60 ml、冰醋酸、冰醋酸 11.5 ml、水、水 28.5 ml 配制成的溶液配制成的溶液含含3 mol/L钾盐、钾盐、5 mol/L醋酸（醋酸（pH 4.8）。）。生命科学学院生
21、命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 所用试剂的生化作用所用试剂的生化作用 溶菌酶溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键，因而具有溶菌作用。糖苷键，因而具有溶菌作用。葡萄糖葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。受机械剪切力作用而降解。EDTA:EDTA螯合螯合Mg2+和和Ca2+等金属离子，抑制脱氧等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对核糖核酸酶对DNA的降解作用的降
22、解作用,同时有利于溶菌酶的作用。同时有利于溶菌酶的作用。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 所用试剂的生化作用所用试剂的生化作用 NaOH-SDS液液:NaOH浓度为浓度为0.2 mol/L，加抽提液时，加抽提液时，该系统的该系统的pH就高达就高达12.6，因而促使染色体，因而促使染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性。的变性。SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋
23、白，还能与蛋白质结合成为蛋白，还能与蛋白质结合成为R一一OS03-R+一蛋白质的一蛋白质的复合物复合物,使蛋白质变性沉淀下来。使蛋白质变性沉淀下来。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 所用试剂的生化作用所用试剂的生化作用 KAc:pH4.8的的KAc溶液是为了把溶液是为了把pHl2.6的抽提液调节的抽提液调节至中性，使变性的质粒至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。能够复性，并能稳定存在。高盐高盐3mol/L KAc有利于变性的大分子染色体有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及以及SDS-蛋白复合物
24、的凝聚而沉淀。染色体蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。沉淀更完全。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 所用试剂的生化作用所用试剂的生化作用 无水乙醇无水乙醇:沉淀沉淀DNA，它的优点是可以任意比例和水相，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反
25、应，对DNA很安全。很安全。DNA溶液是溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去醇会夺去DNA周围的水分子，使周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。酚酚-氯仿氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而
26、与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 所用试剂的生化作用所用试剂的生化作用 异戊醇异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。层水相、中层变性蛋白
27、相以及下层有机溶剂相维持稳定。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 质粒质粒DNADNA煮沸法煮沸法 原理：原理：染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎
28、片结合形片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。液相中，从而可通过离心将两者分开。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 细胞器细胞器DNADNA差速离心法差速离心法 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心的沉降速度也一定，根
29、据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。法，将细胞内各种组分分级分离出来。差速离心法原理差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。层，从而得以分离。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释
30、放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中DNADNA提取的基本步骤提取的基本步骤生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法u 最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温低温保存的样品材料不要反复保存的样品材料不要反复冻融冻融u 提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时，时，要选择有核细胞（白细胞）要选择有核细胞（白细胞）u 组培细胞培养时间不能过组培细胞培养时间不能过长，否则会造成长，否则会造成DNADNA降解降解u 含病毒的液
31、体材料含病毒的液体材料DNADNA含含量较少，提取前先富集量较少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取u 使用处于对数期的新鲜菌使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质体（老化菌体导致开环质粒增加）粒增加）u 培养时应加入筛选压力，培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易否则菌体易污染，质粒易丢失丢失u 尽量选择高拷贝的质粒，尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量应加大菌体用量u 菌株不要频繁转接（质粒菌株不要频繁转接（质粒丢失）丢失）材料准备材料准备生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原
32、理与方法提取的基本原理与方法 细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNADNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K 细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌培养基去除干净，同时保证菌体在
33、悬浮液中充分悬浮体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5 5分分钟），否则质粒易被打断钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会复性时间也不宜过长，否则会有基因组有基因组DNADNA的污染的污染G G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法核酸分离、纯化核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNADNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系 采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，
34、但动氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法的去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法核酸分离、纯化核酸分离、纯化 蛋白质的去除蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤 蛋白酶处理蛋白酶处理生命科学学院生命科学学院
35、一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体体积的积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积体积)，氯苯可以，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用用PEG8000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNA：在：在500L DNA液中加液中加入入200l 20%PEG8000(含含1.2 M N
36、aCl)，冰浴，冰浴20min。生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合的结合 盐离子的去除：盐离子的去除：70的乙醇洗涤的乙醇洗涤生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取
37、的基本原理与方法提取的基本原理与方法 核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀），有利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防
38、止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法DNA提取常见问题提取常见问题u DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质u DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应u DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子u 重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）u 重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥
39、发u 增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）问题问题1 1：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原因原因对对策策生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法DNA提取常见问题提取常见问题材料不新鲜或反复冻融材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶未很好抑制内源核酸酶的活性的活性提取过程操作过于剧烈提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染反复冻融反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融液氮研磨或匀浆组织
40、后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌将将DNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融 问题问题2：DNA降解。降解。对对策策 原因原因生命科学学院生命科学学院一、一、DNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法DNA提取常见问题提取常见问题实验材料不佳或量少实验材料不佳或
41、量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗涤时洗涤时DNA丢失丢失 尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料 动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PK的用量）的用量）低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒问题问题3：DNA提取量少。提取量少。对对策策 原因原因生
42、命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 制备制备RNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNase的作用的作用 1)RNase的特点的特点：抗酸抗碱：抗酸抗碱,具很广具很广pH作用范围作用范围;抗高抗高温严寒温严寒(065均具活性）；抗变性剂均具活性）；抗变性剂 2)解决办法解决办法：外源外源RNase高温，焦磷酸二乙酯高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有处理所有溶液（溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套除外）和器皿，操作者带手套 内源内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑抑制剂，蛋白酶制剂，蛋白酶K等等生
43、命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 总总RNA的提取的提取 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：方法：1）热苯酚抽提法）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法 其中以胍盐法最好，对于从那些其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组含量很高的组织（胰脏）中提取织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使特别有效，可使RNase迅速变性，迅速变性，制备的制备的RNA有较高翻译活性。在有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与制备中
44、，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。蛋白质变性是同步进行的。生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 RNA提取的通用方法提取的通用方法 异异硫氰酸胍硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 原理：原理：n细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；n释放出来的释放出来的DNA和和RNA由于在特定由于在特定pH下溶解度的不下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；以分离；n有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净有机溶
45、剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 RNA提取的通用方法提取的通用方法 异异硫氰酸胍硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 步骤步骤:n材料准备：尽量新鲜。材料准备：尽量新鲜。n裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放放RNA，有效抑制核酸酶。，有效抑制核酸酶。n纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提氯仿可抽提去除杂物。去除杂物。n洗涤：洗涤：70乙醇。乙醇。n沉
46、淀：异丙醇、无水乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。n乙酸钠（乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的）：维持变性的细胞裂解液的pH值，值，沉淀沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 影响影响RNA提取的因素提取的因素 材料：材料：n新鲜，切忌使用反复冻融的材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料n如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于或样品贮存液中，于70或或20保存保存n如要多次
47、提取，请分成多份保存如要多次提取，请分成多份保存n液氮长期保存，液氮长期保存，70短期保存短期保存生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法影响影响RNA提取的因素提取的因素 样品破碎及裂解：样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：根据不同材料选择不同的处理方法：u培养细胞：通常可直接加裂解液裂解培养细胞：通常可直接加裂解液裂解u酵母和细菌：一般酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁殊的材料可先用酶或者机械方法破壁u动植物组织：动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。先液氮研磨和
48、匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解为减少为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量污染，可适当加大裂解液的用量生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法影响影响RNA提取的因素提取的因素 纯化：纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；速；经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成作时间长，易造成 RNA 降解；降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能
49、有效去除影响柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 RNA提取常见问题提取常见问题 RNA 的降解的降解 OD260/OD280 比值偏低比值偏低 电泳带型异常电泳带型异常 下游实验效果不佳下游实验效果不佳生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法RNA提取常见问题提取常见问题 RNA 的降解的降解 新鲜细胞或组织：新鲜细胞或组织：裂解液的质量裂解液的质量 外源外源RNaseRNase的
50、污染的污染 裂解液的用量不足裂解液的用量不足 组织裂解不充分组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等如脾脏，胸腺等)，很，很难避免难避免 RNA RNA 的降解。的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液裂解液。生命科学学院生命科学学院二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法RNA提取常见问题提取常见问题 RNA 的降解的降解 冷冻样品：冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-7070冰箱保存。样品要相对小一点；冰箱
