1、第十章 其 他 检 测第二节 基因诊断第三节 流式细胞术及其临床应用第一节 染色体检测第四节 床旁检测重点难点熟悉了解掌握掌握基因诊断的含义、分子杂交技术、聚合酶链反应、流式细胞术的定义。基因诊断、流式细胞术、染色体核型分析在临床中的应用。POCT的概念和临床应用。染色体检测第一节 诊断学（第9版）一、染色体检查、染色体命名和书写方法1.染色体检查 将待分析的细胞进行短期培养后，经过特殊制片和显带技术，在光学显微镜下观察分裂中期的染色体，确定染色体的数目及结构是否发生畸变，是确诊染色体病的基本方法 染色体检查的标本除常用外周血外还可以用骨髓细胞、皮肤细胞、黏膜和羊水中的细胞等 诊断学（第9版）
2、2.染色体命名 根据人类细胞遗传学命名的国际体制（ISCN），人类46条染色体按其长短和着丝粒的位置编为AG7组，包括122号及X和Y染色体。男性为46，XY；女性为46，XX 根据各染色体上显带特点，将染色体划区分布，p表示短臂，q表示长臂。“2P35”则表示2号染色体短臂3区5带一、染色体检查、染色体命名和书写方法 诊断学（第9版）3.核型分析及其书写 核型书写有统一格式，其书写顺序为：染色体数目、性染色体、染色体异常。t表示易位：in表示倒位，iso或i表示等臂染色体，ins表示插入，del表示缺失，r表示环状染色体。“-”表示丢失，“+”表示增加等，第一括号内是累及染色体的号数，第二括
3、号内是累及染色体的区带，其中p表示短臂，q表示长臂。一、染色体检查、染色体命名和书写方法 诊断学（第9版）二、染色体异常及染色体病1.染色体异常包括染色体数目异常和结构异常。2.根据先天性和获得性分为先天性和获得性染色体异常。3.根据常染色体和性染色体分为常染色体病和性染色体病。诊断学（第9版）病名染色体变化频率主要症状常染色体异常 Down综合征211/1000智能障碍、短头Edwards综合征+181/12000发育障碍、小头Patau综合征+131/5000小头、小眼球，兔唇性染色体异常 Turner 综合征XO，xpXO/XX1/10000矮小、性发育不全Klinefeter综合征XX
4、Y1/1000女性样乳房、小睾丸YY综合征XYY1.5/1000身材特别高、睾丸功能轻度障碍先天性染色体病病例二、染色体异常及染色体病基因诊断第二节 诊断学（第9版）一、基因诊断的含义 基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断。它是以遗传物质（如DNA或RNA）为检查对象，利用分子生物学技术，通过检查遗传物质结构或表达量变化与否来诊断疾病的方法。内容评价基因突变检测如点突变、基因片段的缺失或插入、基因重排等不同类型基因突变的检测基因连锁分析临床的一些疾病的致病基因尚不清楚，很难用基因突变的检测诊断，对这些遗传疾病采用基因连锁分析基因表达分析如mRNA拷贝定量检测及mRNA长度分析等。m
5、RNA检测在基因表达水平上为基因功能是否正常提供了直接依据病原体诊断外来入侵病原微生物遗传物质的检测 基因诊断的主要内容 诊断学（第9版）一、基因诊断的含义 诊断学（第9版）二、基因诊断在诊断学中的地位传统的疾病诊断方法：主要是以疾病的表观改变为依据，不能及时作出明确的诊断。基因诊断：病因的诊断，既特异又灵敏。（1）可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态；（2）可以对表观异常不明显或不特异的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测；（3）对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。诊断学（第9版）三、基因诊断的常用技术（一）核酸分子杂交技术1.核酸分子杂交：两
6、条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程。2.分子杂交方法的共同点（1）应用了核酸序列的复性原理。（2）采用了标记探针：同位素或非同位素标记的短片段特异DNA或RNA。方法评价Southern印迹杂交 一种特定检测DNA片断的方法。Southern印迹的转印方法有毛细管虹吸印迹法、电转法、真空转移法临床上主要用于进行疾病的RFLP连锁分析、基因缺失诊断Northern印迹杂交一种研究RNA的方法，可用于测定细胞的总RNA或mRNA分子量的大小斑点杂交一种快速、简便、既可检测DNA又可检测RNA的方法，可同时检测多个样品，既可进行定性还可以进行半定量 原位杂交
7、（ISH）在保持细胞基本形态的情况下，用同位素或非同位素标记的探针与细胞内的DNA或RNA进行杂交。可同时检测多种DNA或RNA的情况原位杂交由于是原位检测，因此在对特定DNA或RNA进行检测的同时还可对其进行细胞及基因组内定位常用的核酸分子杂交技术与评价 诊断学（第9版）三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）（二）DNA测序1.DNA测序：测定DNA一级结构2.临床意义（1）DNA测序能直观地反映出DNA序列的变化（2）是诊断未知突变基因的最直接的方法（3）在遗传病和肿瘤的诊断、法医学的鉴定中具有非常重要的意义三、基因诊断的常用技术方法评价双脱氧链终止法目前应用最多的快速测序技术化学降解法
8、优点是模板不需体外酶促反应，只要末段标记的DNA片段，其缺点是方法复杂费时，末段标记比活性低“下一代”测序技术采用自动化测序仪进行，结果清晰、准确、分辨率高，大大提高了测序的速度和测序的功能 DNA序列测定常用方法与评价 诊断学（第9版）三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）（三）聚合酶链反应1.聚合酶链反应（PCR）是利用DNA聚合酶（如：Taq DNA）在体外催化一对引物间的特异DNA片断合成的基因体外扩增技术。反应特异性强，灵敏度高。2.临床意义（1）病原体DNA的检测、肿瘤微量残留细胞的检出、遗传病的基因诊断，法医学上嫌疑人或个体遗传物质的鉴定等。（2）应用RT-PCR还可对RNA病
9、毒如丙型肝炎病毒和待检基因的表达量进行检测。三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）（四）连接酶链反应1.连接酶链反应（LCR）是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。2.临床意义 LCR法可以进行单碱基遗传病多态性的快速筛选、单碱基遗传病的产前诊断、微生物亚种和亚型的鉴别、多态性的分析、法医学中个体DNA的准确鉴别。三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）（五）单链构象多态性分析1.单链构象多态性（SSCP）分析 是一种分析突变基因的方法。2.临床意义 SCP多与PCR技术联用（PCR-SSCP）检测基因突变，提高了基因突变检测的灵敏性，现已广泛用于遗传病及肿
10、瘤基因的分析。三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）（六）限制性片段长度多态性分析1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析 是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针杂交技术的综合应用。2.临床意义（1）广泛地应用于遗传病的连锁分析，（2）还可用于基因组同源性分析以及个体识别。三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）（七）单核苷酸多态性（SNP）分析内容评价密度高在基因组中的分布较微卫星标记广泛，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记具有代表性某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质的结构或表达水平，其本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点，可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素
11、遗传稳定性具有更高的遗传稳定性，尤其是处于编码区的SNP（cSNP）自动化分析由于SNP是双等位基因标记，容易进行自动化批量检测，分析也相对简单SNP的特性三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）（八）基因芯片技术【原理】将大量已知的寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量 基因芯片技术集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术，使基因芯片具有微型化、集约化和标准化的特点，实现了对靶基因的快速检测三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）应用评价优生优育600多种遗传疾病与基因有关。
12、妊娠早期用DNA芯片做基因诊断，可以避免许多遗传疾病的发生疾病诊断由于大部分疾病与基因有关，且与多基因有关，利用DNA芯片可对一些疾病进行诊断器官移植可用于HLA分型病原体诊断 细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定环境的影响 花粉过敏等人体对环境的反应都与基因有关法医学DNA芯片较DNA指纹鉴定更有优点基因芯片在医学领域中的应用三、基因诊断的常用技术 诊断学（第9版）四、基因诊断在临床医学中的应用（一）遗传性疾病的基因诊断 镰刀状红细胞贫血、血友病、地中海贫血、脆性X综合征等均可应用分子生物学技术对其进行基因诊断。诊断学（第9版）四、基因诊断在临床医学中的应用（二）感染性疾病的基因诊断 可检出的病原
13、体有：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒、EB病毒、疱疹病毒、结核分枝杆菌、产毒性大肠杆菌、奈瑟淋球菌、肺炎支原体、疟原虫、利什曼原虫、白色念珠菌等。诊断学（第9版）（三）肿瘤的基因诊断1.癌基因：指能参与或直接导致细胞发生恶性转化的基因。（1）肿瘤非特异性癌基因 如H-ras、K-ras、c-myc等基因。（2）瘤特异性癌基因 如c属于非特异性癌基因；c-sis与淋巴结肿瘤转移有关，c-abl与慢性髓系白血病有关。2.原癌基因：指存在于正常细胞内，在一定的因素刺激下可转变为癌基因的基因序列。3.抑癌基因：是一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。抑癌基因的丢失或失
14、活可能导致肿瘤发生。四、基因诊断在临床医学中的应用 诊断学（第9版）（四）药物代谢基因诊断1.临床药物疗效与参与药物代谢的相关基因有密切关联。2.肿瘤抗药性研究显示肿瘤化疗的失败在很大程度上是由于肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药，如药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。四、基因诊断在临床医学中的应用 诊断学（第9版）（五）基因诊断在法医学中的应用 1983年Jeffreys等在人体基因组DNA中发现了高度可变的小卫星区域，同一个体不同组织来源的DNA被同一酶降解后的Southern印迹图上的条带完全一样，而不同个体之间（除非同卵双
15、生）的谱带都不相同，就像人的指纹具有高度个体特异性一样，因此这种Southern印迹图被称为DNA指纹。法医学常将此种技术用于刑事案件中的物证来源进行鉴定和民事案件中的亲子鉴定。四、基因诊断在临床医学中的应用流式细胞术及其临床应用第三节 诊断学（第9版）一、流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种集细胞生物技术、单克隆抗体技术、激光技术、流体力学、计算机于一体的检测技术；能够对细胞或生物微粒的生物物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测，并可以进行分类收集和分选的多参数检测细胞分析技术，所使用的仪器叫流式细胞仪（flow cytom
16、eter）。诊断学（第9版）二、流式细胞仪组成及其工作原理 1.流式细胞仪的组成 流动室及液流驱动系统、激光光源及光束形成系统、光电检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统等部分组成。诊断学（第9版）二、流式细胞仪组成及其工作原理2.流式细胞仪的工作原理（1）经荧光抗体染色的细胞或生物微粒在悬液中以单束细胞流通过用于激发荧光的激光聚焦点。（2）当细胞或生物微粒经过激光聚焦点时，细胞自身的物理特征如细胞大小和内容物会产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），同时结合在细胞上的荧光抗体上的荧光素会被激发产生荧光，荧光强度高低与抗原靶点在细胞上的数量有关。（3）不同的散射光和荧光经过滤光镜系统收集
17、到各自的光电检测器（光电倍增管）。（4）光电检测器把光信号转化成电信号，经数字转换器进行数字化处理，然后进行电子数据存储。（5）借助专用发流式细胞术分析软件数据可以调出数据，并以直方图、二维散点图、等高线图、灰度图以及三维图等多种形式显示、分析。诊断学（第9版）三、流式细胞术的临床应用（一）免疫学 1.免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细胞亚群与疾病关系的分析；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。2.检测T淋巴细胞表面的HLA-B27的表达强度以辅助诊断强直性脊柱炎，其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高。3.流式细胞术不仅能分析细胞膜免疫表型，也能通过抗体标记和细胞膜打孔技术测定
18、细胞质和细胞核内抗原成分，反映细胞的特征、功能和活性变化。诊断学（第9版）（二）血液学1.白血病多药耐药性的检测、血小板的研究、造血干/祖细胞的研究、白血病的分型、血液肿瘤微小残留病（minimal residual disease，MRD）的监测、血液肿瘤细胞的DNA分析、细胞凋亡及相关蛋白的研究等。2.MICM分型：形态学（M）分型、免疫学（I）分型、细胞遗传学（C）分型、分子生物学（M）分型。三、流式细胞术的临床应用 诊断学（第9版）（二）血液学 3.检测MRD是决定进一步治疗策略和选择采集外周血造血干/祖细胞自体移植及异基因造血干细胞移植时机的依据。4.用FCM检测阵发性睡眠性血红蛋白
19、尿症患者血细胞细胞膜上的CD55、CD59和GPI比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度。5.FCM技术可以精确测定移植物供体中CD34+细胞数量，对于选择G-CSF动员外周血干细胞的采集时间和判断移植后的植活评估有重要指导意义。三、流式细胞术的临床应用 诊断学（第9版）（三）肿瘤学 流式细胞术可用于测定实体瘤标本、穿刺标本、体腔液、活检组织中可疑细胞的DNA倍体、分析细胞周期。三、流式细胞术的临床应用床 旁 检 测第四节 诊断学（第9版）一、POCT定义 床旁检测（point of care testing，POCT）又称为“即时检验”，是检验医学中快速发展的新领域之一。美国临床生物化学学
20、会（The National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）制定的POCT循证实践指南中，将POCT定义为“在患者就诊和治疗的地方，由没有受过检验医学专业训练的临床人员或者患者自己进行的临床实验室项目检测”。我国床旁检测管理办法（草案）规定：POCT是在医疗机构内，由实验室或非实验室的卫生保健人员，在临床实验室的质量管理体系指导下，在患者身旁进行的快速检测。如果检测不是在临床实验室内进行，并且它是一种移动性的系统，就可称为POCT。诊断学（第9版）二、POCT的临床应用 POCT涉及到的检测项目包括血糖、常规尿液分析、血气/电解质、凝血、各种病原体
21、、糖化血红蛋白、心肌标志物、激素和妊娠试验等。目前临床应用较为普遍的主要包括以下三方面：1.糖尿病 糖尿病患者常用的POCT包括空腹血糖、HbA1c、尿微量白蛋白检测等，扩展指标包括血气、乳酸盐、电解质检测等。2.心血管疾病 心梗、心衰的诊断和风险评估，以及口服抗凝剂监测等。3.感染性疾病 细菌性阴道炎、性传播疾病病原体的抗原、抗体检测，术前传染病的筛查及内窥镜检查前的肝炎、HIV感染筛查，C反应蛋白检测等。诊断学（第9版）三、POCT的基本技术1.理想的POCT系统应具有以下特点：（1）体积小巧，便于携带；操作简单，只需很少培训；（2）最低程度的常规和预防性维护；（3）试剂、标本和校准品多使
22、用条形码，无需人工输入；（4）试剂可在室温保存；标本不需预处理；（5）直接报告；（6）可与实验室信息系统（LIS）联网；（7）能自动校准及进行数据管理等。诊断学（第9版）2.POCT的发展分为3个阶段：（1）第一阶段为不依赖仪器的系统，一般不需要配套仪器，采用干片或浸渍试剂的纸条进行化学反应，通过肉眼即可判断结果。（2）第二阶段也即目前所采用的依赖仪器的POCT系统，采用微电极、传感器、计算机和网络技术，可对整个POCT的流程进行实时监控，通过微芯片和条形码将数字信息输入LIS。（3）第三阶段即未来的POCT，将着重于无创伤、少创伤技术；这类仪器采用了多种新技术，如红外分光光度法、结合信号分析
23、的近红外分光光度法、光-声学技术等。三、POCT的基本技术 诊断学（第9版）四、POCT的质量管理1.人员 POCT操作人员必须经规范化培训。未经培训人员或培训不合格者不得使用POCT系统。2.操作程序 建立标准操作程序（SOP）是控制POCT质量的基本保证。3.仪器选择 仪器的性能、价格、培训、维修等各方面，测量方法的简便快捷和测量结果的准确可靠是应考虑的主要内容。4.质量控制 有条件时还必须选用一定的控制物进行质控，并应定期与临床实验室的自动化仪器进行比对。不同的检测项目或不同的POCT仪对质量控制有不同的要求。诊断学（第9版）5.组织管理体系 （1）二级以上医疗机构应成立床旁检测管理的机
24、构，由主管领导和医务处牵头，护理、临床实验室等相关人员参与；（2）床旁检测管理机构指派一名具有中级以上或相当专业技术职称，并在实验医学方面经过正规培训的部门主任，监督床旁检测程序是否与国家、地区的有关规则及制度相符合；（3）床旁检测管理机构可以聘请有经验的医生或具有高级职称的检验医师（技师）担任顾问，负责协调床旁检测管理机构和临床之间的沟通，并负责解释检验结果；（4）床旁检测操作人员包括经培训的医生、护士、实验技术人员；（5）床旁检测管理机构主任可以任命一名具有全面的实验室技术知识，并有2年以上综合实验室工作经验的床旁检测协调员，协助床旁检测部门主任、各主管及检验人员的工作。四、POCT的质量管理1.基因诊断主要用于感染性疾病病原体诊断、先天性遗传性疾病诊断、基因突变性疾病诊断、产前诊断、亲子鉴定和法医物证检测。2.流式细胞术是基于细胞水平测试和分析的重要手段，目前广泛用于血细胞的检测，特别是血液肿瘤的分型诊断、预后观察、微量残留病监测。3.染色体检测是基于细胞分裂中期染色体状态的细胞核型分析，主要用于染色体病和血液肿瘤的分型诊断和优生优育、产前诊断。4.POCT是易于随时随地了解某机体特种检验指标生理状态的新兴检测技术，方便、快速，但由于可以是非专业人员测试，对其检测能力和结果可信程度有较高的要求。
