1、金黄色葡萄球菌检验与计数试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。25g(mL)检样+225mL稀释液，匀质接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要
2、的致病物质。金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球
3、菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表。若T或者N为0，报告1d-1 cfu/mL(g)。金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；PetrifilmTM测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释Baird-Parker平板，血平板结果如可疑，挑取营
4、养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18h48h，重复实验。固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。T=T1+T2=110+17=127检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液不要用力振摇试管，以免凝块振碎。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良
5、的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。-方便MPN表的查找。根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度分别吸取1ml接种到胰酪大豆肉汤管，每稀释度接种3管。B:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和；一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker平板5%氯化钠
6、肉汤：为葡萄球菌选择性增菌培养基，因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性，因而能在此增菌液中生长，除某些嗜高盐的海洋菌外，大多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制。样品的稀释样品的稀释增菌与分离培养增菌与分离培养金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌空白培养基空白培养基培养基培养基 用途用途 测试菌株测试菌株参考培养基参考培养基控制方法控制方法判定判定标准标准特性反应特性反应Baird-Baird-ParkerParker生长率生长率金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC6538ATCC6538；金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC25923ATCC25923 TSA TSA 定量定量PR0.PR0.5 5黑色黑色/灰
7、色菌灰色菌落带透明带落带透明带选择性选择性大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌ATCC25922ATCC25922或或87398739 -定性定性全部全部抑制抑制特异性特异性表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌ATCC12228ATCC12228 -定性定性-黑色黑色/灰色菌灰色菌落无透明带落无透明带血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 结果报告结果报告 。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。而其他细菌因不产生耐热DNA酶没有该反应。在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。Baird-Parker平板361培养18h24h或45h
8、48h。金黄色葡萄球菌将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液单位：cfu/g或者cfu/mL；接种Baird-Parker平板其他依次为D、C、B和E型。易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。血浆：血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔血浆。PetrifilmTM测试片法检验程序本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液本菌引起的食物中毒是因为食品污
9、染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的的样品匀液(液体样品可包括原液)，每个稀释度分别吸取1ml接种到胰酪大豆肉汤管，每稀释度接种3管。金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNA酶。增菌培养：吸取5mL上述样品匀液，接种于50mL 7.金黄色葡萄球菌计数金黄色葡萄球菌计数样品的接种、培养与典型菌落的确认样品的接种、培养与典型菌落的确认典型菌落计数与计算公式的应用典型菌落计数与计算公式的应用公式应用例一公式应用例一检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐
10、缓冲液361培养4548h。不要用力振摇试管，以免凝块振碎。分子量约为3000左右。361培养4548h。5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.4ml接种量，分别加入三块Baird-Parker平板，用L棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的边缘)。黑色/灰色菌落带透明带若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。-最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落；公式一：T=AB/Cd肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的肽链组成。金黄色葡萄球菌将所有紫红色菌落计数为金
11、黄色葡萄球菌用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。金黄色葡萄球菌的检测程序-最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落；在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。不要用力振摇试管，以免凝块振碎。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。公式应用例二公式应用例二 第二法第二法 MPN MPN法法接种和培养接种和培养大豆肉汤大豆肉汤管管结果报告结果报告用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环分别接种于Baird-Parker
12、平板361培养4548h。金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的溶血环。接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养。T1=18335=110 T2=2145=17这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。第三法PetrifilmTM测试片法4ml接种量，分别加入三块Baird-Parker平板，用L棒涂布整个平板，(注意不要触及平板的边缘)。25g(mL)检样+22
13、5mL稀释液，匀质T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。C:某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。用人血浆出现凝固的时间短，约93.若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。易溶于水，难溶于有机溶剂。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。T=T1+T2=110+17=127计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-
14、Parker平板金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。适用范围适用范围大肠埃希氏菌ATCC25922或8739样品的接种、培养与典型菌落的确认检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。培养温度与时间：361，4548h。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18h48h，重复实验。5%氯化钠肉汤
15、或10%胰酪胨大豆肉汤培养基内，361培养18h24h。361培养4548h。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。-方便MPN表的查找。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液典型菌落确认：从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，361培养1824h后进行血浆凝固酶试验。其他依次为D、C、B和E型。Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和
16、晕圈。若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。PetrifilmTM测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片BHI肉汤和营养琼脂小斜面本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液金黄色葡萄球菌计数T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之
17、和；公式一：T=AB/Cd若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），或生长不良，可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。第三法PetrifilmTM测试片法所有稀释度平板合计菌落数均在20200间：用于做血浆凝固酶菌落数5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.Baird-Parker平板，血平板B:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；其他依次为D、C、B和E型。25g(mL)检样+225mL稀释液，匀质第三法 PetrifilmTM测试片法单位：cfu/g或者cfu/mL；5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大豆肉汤培养基内，361培养18h24h。用于做血浆凝固酶菌落数同时以血浆凝固酶试验阳性
18、和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。培养温度与时间：361，4548h。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。最适生长温度37C，最适生长pH 7.选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker平板T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球
19、菌菌落总数之和；易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。公式一：T=AB/Cd接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)，通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养。血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液Baird-Parker平板，血平板耐热，经100煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。-方便MPN表
20、的查找。2m，大小不一，平均直径约为0.金黄色葡萄球菌检验与计数耐热，经100煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。“样品的最高稀释度，能达到获得阴性终点”的理解：计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。公式二的使用范围：平板菌落数均在20 cfu200 cfu之间。6%的阳性菌在1h内出现凝固。公式引用于ISO 6888-1:1999(E)4ml接种量，分别加入三块Baird-Parker平板，用L棒涂布整个平板，(注意
21、不要触及平板的边缘)。检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。易溶于水，难溶于有机溶剂。T:样品中金黄色葡萄球菌落数；A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。MPN法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。检样25g(mL)225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。血浆：血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔血浆。计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。T1=18335=110 T2=2145=175%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。典型菌落计数与计算公式的应用选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片T:样品中金黄色葡萄球菌落数；金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上呈溶血。谢谢观看！
