1、资料4质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法和相关情况说明4.1 质量规格要求4.2维生素K2（发酵法）生产工艺4.3生产使用工艺4.4食品中的检验方法和相关情况说明资料4.1质量规格要求19 / 24维生素K2（发酵法）质量规格要求，执行国家卫计委2016年第8号公告中附件3中规定。1 范围本质量规格要求适用于以大豆粉、白砂糖、葡萄糖经纳豆枯草芽孢杆菌发酵的发酵物，经提取精制而成的食品营养强化剂维生素K2（发酵法）。商品化的维生素K2（发酵法）包括：以食用油为辅料的维生素K2（发酵法）油剂和以变性淀粉或糊精、乳化剂、抗氧化剂等为辅料的维生素K2（发酵法）粉剂。2 分类
2、2.1 维生素K2（发酵法）油剂维生素K2（发酵法）油剂产品其主要成分为维生素K2族的七烯甲萘醌，辅料包括大豆油。2.2 维生素K2（发酵法）粉剂维生素K2（发酵法）粉剂产品其主要成分为维生素K2族的七烯甲萘醌，辅料含变性淀粉、淀粉、糊精、微晶纤维素、乳化剂、抗氧化剂等。3 分子式、结构式和相对分子质量3.1分子式C46H64O23.2 结构式3.3 相对分子质量649.00（按2007年国际相对原子质量）4 技术要求4.1 感官要求：应符合表1的规定。项目要求检验方法维生素K2（发酵法）油剂维生素K2（发酵法）粉剂取样品适量置于50mL烧杯中，于自然光下，用肉眼观察其色泽、形态、组织、杂质，
3、嗅其气味。色泽浅黄色白色至浅黄色滋味、气味本品特有的气味、滋味，无异味性状澄清或微混浊油状粉末状杂质无正常视力可见的杂质表1 感官要求4.2 理化指标：应符合表2的规定。表2 理化指标项 目指 标检验方法维生素K2 （发酵法）油剂维生素K2（发酵法）粉剂维生素K2的含量a/（g/g）15001000附录A中A.4酸价/（mg KOH/g）1.0-GB/T 5009.37过氧化值/（meq /kg）5.0-GB/T 5009.37水分，w/%-5.0GB 5009.3灰分，w/%-3.0GB 5009.4总砷（以As计）/(mg/kg)0.1GB 5009.11铅（Pb)/(mg/kg)0.1G
4、B 5009.12汞（Hg）/(mg/kg)0.05GB 5009.17镉（Cd）/(mg/kg)0.1GB 5009.15六六六/(mg/kg)0.05GB/T 5009.19滴滴涕/(mg/kg)0.05黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）/（g/kg ）5.0GB/T 5009.23a维生素K2的含量以七烯甲萘醌含量标示，七烯甲萘醌实际含量为标示量的95%110%。4.3 微生物指标：应符合表3的规定。表3 微生物指标项 目指 标（若非指定，均以/25g表示）检验方法维生素K2 （发酵法）油剂维生素K2（发酵法）粉剂菌落总数/(CFU/g)3001000GB 4789.2霉菌和酵母/(C
5、FU/g)25100GB 4789.15大肠菌群/(MPN/g)3.0GB 4789.3 大肠埃希氏菌/(MPN/g)3.0GB 4789.38 致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）不得检出GB 4789.4、GB 4789.105 其他要求产品应装于适宜的避光容器中充氮或真空保存，产品的最佳保存温度为20以下。附录A检验方法A.1 安全提示本质量规格要求试验方法中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，按相关规定操作，操作时需小心谨慎。若溅到皮肤上应立即用水冲洗，严重者应立即治疗。在使用易燃品时，严禁使用明火加热。A.2 一般规定本质量规格要求所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/
6、T6682中规定的一级水。试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。A.3 鉴别试验A.3.1方法提要试样用正己烷提取，按含量测定项下色谱条件进行高效液相色谱分析，与七烯甲萘醌标准品保留时间进行对照。试样色谱图的主峰应与标准品主峰保留时间一致。A.3.2试剂和材料A.3.2.1维生素K2标准品（七烯甲萘醌，MK-7）。A.3.2.2正己烷：分析纯。A.3.3分析步骤A.3.3.1试样溶液处理精密称取试样适量（精确至0.001 g）于10 m
7、L容量瓶中，加入正己烷超声提取30 min，定容至刻度，摇匀，过0.45 m滤膜，得上样试样。A.3.3.2试样检测按照含量测定项下方法，配制标准溶液。按照含量测定色谱条件将标准溶液和样品溶液10 L注入高效液相色谱仪中测定，以保留时间定性鉴别。A.4 维生素K2含量的测定A.4.1试剂和材料A.4.1.1维生素K2标准品（七烯甲萘醌，MK-7）。A.4.1.2异丙醇：分析纯。A.4.1.3甲醇：色谱纯。A.4.2仪器和设备A.4.2.1高效液相色谱仪。A.4.2.2紫外光检测器：可变波长。A.4.2.3数据处理系统：色谱工作站或数据处理机。A.4.3参考色谱条件推荐的色谱柱及典型操作条件如下
8、表A.1，其他能达到同等分离程度的色谱柱和色谱操作条件均可使用。A.1色谱柱和色谱操作条件色谱柱C18 ODS柱，柱长150 mm，内径4.6mm，内装C18填充物，粒径5m或是相当者柱温/50流动相甲醇流速/ mL/min1.0检测波长/nm254进样量/ L10A.4.4分析步骤A.4.4.1 试样溶液处理精密称取试样适量（精确至0.001 g）于10 mL容量瓶中，加入异丙醇超声30 min，用异丙醇定容至刻度，摇匀，过0.45 m滤膜，得上样试样。A.4.4.2 标准品溶液配制精密称取七烯甲萘醌标准品适量，用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为20 g/mL的标准品溶液。A.4.4.3 试样
9、测定用标准品和试样溶液10 L注入高效液相色谱仪中测定，以保留时间定性，峰面积外标法定量。A.4.5结果计算维生素K2的含量w，单位为微克每克(g/g)，按式（A.1）计算：（A.1）式中：A1试样中维生素K2（七烯甲萘醌）对应峰面积；A2标准品中维生素K2（七烯甲萘醌）对应峰面积；c1进样标准品中维生素K2（七烯甲萘醌）的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V1供试试样定容体积，单位为毫升（mL）；m1试样的质量，单位为克（g）。试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10 %。_资料4.2维生素K2（发酵法）生产工艺维生素K2
10、（发酵法）生产工艺大豆粉、葡萄糖、白砂糖、纯水灭 菌发酵菌种活化、扩大培养酸处理陶瓷膜固液分离超滤浓缩上清植物油植物油萃取油层减压蒸馏维生素K2粗提油液分装过滤、除杂辅料制粒干燥维生素K2油维生素K2粉图1. 维生素K2（发酵法）生产工艺流程图资料4.3生产使用工艺一、 调制乳粉的生产工艺1. 调制乳粉的生产工艺流程图：预处理及标准化配料维生素K2（发酵法）均质杀菌原料乳验收浓缩喷雾干燥冷却筛分混合分装图2. 调制乳粉的生产工艺流程图2.调制乳粉的工艺说明2.1原料乳的验收2.2预处理及标准化：原料乳经过净化、冷却后，按照国家法定要求对原料乳进行标准化。2.3配料：按产品的要求添加甜味剂、微量
11、元素及维生素类（维生素K2）等。2.4均质：在强烈的机械力作用下，将乳液中大的脂肪球破碎成小的脂肪球，均匀一致的分散在乳中。2.5杀菌：利用蒸汽加热至125138，瞬时超高温灭菌（24秒）后冷却到4045以下。2.6浓缩：在双效浓缩设备除去水分，按要求达到相应的浓度。2.7喷雾干燥。2.8冷却筛分：冷却后的乳粉经振动筛过筛后,接入粉车。2.9混合：添加对热不稳定的维生素类。2.10分装。二、固体饮料生产工艺1.固体饮料生产工艺流程图：粉碎称量混合过筛原料领用分装固体饮料维生素K2（发酵法）图3. 固体饮料的生产工艺流程图2.固体饮料的工艺说明2.1原料领用2.2粉碎：粉碎至工艺要求粒度。2.3
12、称量：按照规定的配方量称取各种物质的重量（包括维生素K2）。2.4混合：将配方中的各种物质混合均匀。2.5过筛：按要求工艺要求粒度进行过筛。2.6分装：分装即成固体饮料三、风味发酵乳生产工艺1. 风味发酵乳生产工艺流程图：原料乳验收过滤配料预热均质杀菌冷却接入发酵剂灌装冷却冷却灌装冷藏后熟发酵罐中发酵发酵搅拌混合搅拌型酸奶冷藏后熟凝固型酸奶维生素K2（发酵法）维生素K2（发酵法）图4. 风味发酵乳的生产工艺流程图2. 风味发酵乳的工艺说明2.1凝固型风味发酵乳的工艺说明2.1.1原料乳验收2.1.2过滤、配料：首先将鲜奶加热到40 左右时加入奶粉，搅拌溶解，至温度达50 左右时加蔗糖溶化，待6
13、5 时，开始用循环泵过滤与净化。2.1.3预热2.1.4均质：在强烈的机械力作用下处理可使原料充分混匀，粒子变小，有利于提高酸乳的稳定性和稠度，并使酸乳质地细腻，口感良好。2.1.5杀菌：均质后的物料升温至135，加热2-3秒。2.1.6冷却：降温至41432.1.7接入发酵剂：加入发酵剂后要充分搅拌10min，使菌体能与乳品完全混匀。2.1.8灌装：添加香料、果粉及维生素类（维生素K2）后搅拌均匀后进行灌装。2.1.9发酵：发酵时间受接种量、发酵剂活性和培养温度的影响。2.1.10冷却：达到发酵终点的酸乳需进行迅速冷却，以便有效地抑制乳酸菌的生长，降低酶活力，防止产酸过度，减低和稳定脂肪上浮
14、和乳清析出的速度。2.1.11冷藏后熟2.2搅拌型风味发酵乳的工艺说明2.2.1原料乳验收2.2.2过滤、配料：首先将鲜奶加热到40 左右时加入奶粉，搅拌溶解，至温度达50 左右时加蔗糖溶化，待65 时，开始用循环泵过滤与净化。2.2.3预热2.2.4均质：在强烈的机械力作用下处理可使原料充分混匀，粒子变小，有利于提高酸乳的稳定性和稠度，并使酸乳质地细腻，口感良好。2.2.5杀菌：均质后的物料升温至135，加热2-3秒。2.2.6冷却：降温至41432.2.7接入发酵剂：加入发酵剂后要充分搅拌10min，使菌体能与乳品完全混匀。2.2.8发酵：发酵时间受接种量、发酵剂活性和培养温度的影响。2.
15、2.9冷却：达到发酵终点的酸乳需进行迅速冷却，以便有效地抑制乳酸菌的生长，降低酶活力，防止产酸过度，减低和稳定脂肪上浮和乳清析出的速度。2.2.10搅拌、混合：通过机械力破坏凝胶体，使凝胶体的粒子直径达到0.010.4mm，并使酸乳的硬度和粘度及组织状态发生变化。在这一过程添加香料、果粉及维生素类（维生素K2）后搅拌均匀后进行灌装。2.2.11灌装2.2.12冷藏后熟：将灌装好的酸乳于冷库中07冷藏24h进行后熟，进一步促进芳香物质的产生和改善粘稠度。四、含乳饮料生产工艺1. 含乳饮料生产工艺流程图：原料乳验收原料乳预处理配料预热均质杀菌冷却灌装中性含乳饮料均质杀菌接种发酵调配均质灌装二次杀菌
16、冷却包装发酵型含乳饮料维生素K2（发酵法）维生素K2（发酵法）图5. 含乳饮料的生产工艺流程图2.含乳饮料的工艺说明2.1中性含乳饮料的工艺说明2.1.1原料乳验收2.1.2原料乳预处理：使原料乳符合相应的要求。2.1.3配料：首先将鲜奶加热到40 左右时加入奶粉，搅拌溶解，至温度达50 左右时加蔗糖溶化，待完全溶解后加入其它风味辅料及营养添加剂（维生素k2）。待65 时，开始用循环泵过滤与净化。2.1.4预热2.1.5均质： 在强烈的机械力作用下处理可使原料充分混匀，粒子变小，有利于提高酸乳的稳定性和稠度，并使酸乳质地细腻，口感良好。2.1.6杀菌：均质后的物料升温至135，加热2-3秒。2
17、.1.7冷却：冷却至41432.1.8灌装：灌装后成中性含乳饮料。2.2发酵型含乳饮料的工艺说明2.2.1原料乳验收2.2.2原料乳预处理：使原料乳符合相应的要求。2.2.3均质2.2.4杀菌：杀菌温度为8590，时间30分钟。2.2.5接种发酵：发酵温度为431，时间为912小时。2.2.6调配：按照规定的配方加入甜味剂、稳定剂及维生素类（维生素K2）等。2.2.7均质：均质使其液滴微细化，提高料液黏度，抑制粒子的沉淀，并增强稳定剂的稳定效果。乳酸菌饮料较适宜的均质压力为2025MPa。2.2.8灌装2.2.9二次杀菌：杀菌温度为8590，时间30分钟。2.2.10冷却2.2.11包装：包装
18、后成发酵型含乳饮料。资料4.4食品中的检验方法和相关情况说明食品中维生素K2的检测方法目前在国际上仍未有法典方法可以参考。由于维生素K2与维生素K1同属于维生素K族同系物，结构相似，大多文献方法参照食品中维生素K1检测方法进行。食品中维生素K2（发酵法）的检测方法参考GB 5413.10婴幼儿食品和乳品中维生素 K1的测定进行优化，使系统适应性达到分离要求。1. 原理用脂肪酶降解试样中的脂肪和不饱和脂肪酸，对于含淀粉试样需先用淀粉酶降解试样中的淀粉，经碱皂化后，用正己烷提取维生素 K2。通过液相色谱法分离，柱后还原维生素 K2，荧光检测器检测，外标法定量。 2. 试剂和材料除非另有规定，本方法
19、所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 2.1 氢氧化钠溶液（10mol/L）：临用前配制。 2.2 95 %乙醇。 2.3 饱和氯化钠溶液。 2.4 正己烷：色谱纯。 2.5 无水硫酸钠。 2.6甲醇：色谱纯。2.7 二氯甲烷：色谱纯。2.8冰醋酸。2.9 氯化锌。2.10 无水乙酸钠2.11 流动相：甲醇（2.6）900 mL，二氯甲烷（2.7）100 mL，冰醋酸（2.8）0.5 mL，氯化锌 1.5g（2.9），无水乙酸钠（2.10）0.5g，溶解后用0.45m滤膜过滤。2.12 淀粉酶：酶活力1.5U/mg。2.13 脂肪酶：酶活力700U/mg。 2.14 锌粉：
20、粒度 50m70m。 2.15 维生素 K2（七烯甲萘醌）标准溶液2.15.1 维生素 K2标准储备液（2 mg/mL）：称取0.05 g维生素 K2标准品（精确到0.1mg），于25mL容量瓶中，用正己烷溶解定容。 2.15.2 维生素K2标准中间液（20g/mL）：取标准储备液（2.15.1）1mL加正己烷定容至100mL。 3. 仪器和设备 3.1 高效液相色谱仪，带有荧光检测器。 3.2 天平：感量为0.1mg。 3.3 分液漏斗：250mL。 3.4 旋转蒸发器。 3.5 恒温空气浴振荡器。 3.6 离心机：转速3000转/分钟。 3.7 氮吹仪。 4. 分析步骤 4.1 试样处理
21、4.1.1 含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g（精确到0.1mg）于三角瓶中，加入0.5g淀粉酶，用30mL温水溶解。 4.1.2 不含淀粉的试样 称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g（精确到0.1mg）于三角瓶中，用30mL温水溶解。 4.2 测定液的制备 向上述处理过的试样溶液中加入1g脂肪酶，于37 5 恒温空气浴振荡器中振荡过夜，使其充分酶解。取出酶解好的试样，加入2 mL氢氧化钠溶液，用 50 mL乙醇将溶液转入250mL的分液漏斗中，充分混匀（必要时加少量饱和氯化钠溶液）。加入50mL正己烷。充分振摇 2 min，静置分层。放出下层水相于
22、另一个 250 mL分液漏斗中，留下有机相。向水相中再次加入 50 mL正己烷再次萃取。合并有机相。用适量蒸馏水洗有机相两次。将有机相通过无水硫酸钠脱水过滤到一个 500 mL的烧瓶中，在旋转蒸发器上于 40 2 下蒸发至近干。用正己烷转移残留物到一个10 mL试管中，置氮吹仪上于40 2 下吹干，准确加入1 mL正己烷，充分振荡溶解残留物。将试管放入冰箱中在 0 以下冷冻 1 h备用。4.3 测定4.3.1 色谱条件4.3.1.1色谱柱：C18色谱柱，150 mm 4.6 mm，5 m，或具同等性能的色谱柱；4.3.1.2 锌还原柱：4.6 mm 50 mm4.3.1.3检测波长：激发波长为
23、 243 nm，发射波长为 430 nm；4.3.1.4 流动相：甲醇（2.6）900 mL，二氯甲烷（2.7）100 mL，冰醋酸（2.8）0.5 mL，氯化锌1.5g（2.9），无水乙酸钠（2.10）0.5g，溶解后用0.45m滤膜过滤；4.3.1.5 流速：1.0mL/min；4.3.1.6进样量：10L。4.3.2 维生素 K2标准曲线绘制 分别准确吸取标准中间液（2.15.2）0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL加正己烷定容至25 mL，此标准系列工作液维生素K2浓度分别为 0.00 g/mL，0.40 g/mL，0.80 g/mL，1.
24、20 g/mL， 1.60 g/mL，2.00 g/mL。将系列标准维生素K2工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。 4.3.3 测定液的测定 将制备好的测定液（4.2）在暗处放至室温，于离心机中在 3000转/分钟下离心 5 min，吸取上清液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高。从标准曲线上查得试样溶液中维生素K2的浓度或通过回归方程计算出试样溶液中维生素 K2的浓度（g/mL）。 5. 分析结果的表述 试样中维生素 K2的含量按下式计算： X= Ci Vin/ mi100式中： X维生素 K2的含量，单位为微克每百克（g/100 g）； Ci试样溶液的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； Vi试样溶液的体积，单位为毫升（mL）； mi试样的质量，单位为克（g）； n 样液稀释倍数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到小数点后一位。 6. 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。 7. 其他 7.1 由于维生素K2遇光易分解，整个操作应避光。 7.2 本标准检出限为 1g/100g。
