1、第三章 酶学,主要内容：介绍酶的概念、作用特点和分类、命名，讨论酶的结构特征和催化功能以及酶专一性及高效催化的策略，进而讨论影响酶作用的主要因素。对酶工程和酶的应用作一般介绍。,返回,思考,目 录,第一节 酶的概念及作用特点 第二节 酶的命名和分类 第三节 酶催化作用的结构基础和 高效催化的策略 第四节 酶促反应的动力学 第五节 重要的酶类及酶活性的调控 第六节 酶工程简介,第一节 酶的概念及作用特点,一 、酶及生物催化剂概念的发展, 极高的催化效率 高度的专一性 易失活 活性可调控 有些酶需辅助因子,四、 酶专一性类型,二、 酶作用的特点,三、 酶的化学本质,酶及生物催化剂概念的发展,克隆酶
2、、遗传修饰酶蛋白质工程新酶,蛋白质类： Enzyme,(天然酶、生物工程酶),核酸类：Ribozyme ; Deoxyribozyme,模拟生物催化剂,酶专一性类型,1 结构专一性 概念：酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的特殊要求和选择 类别：绝对专一性和相对专一性 2 立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性,绝对专一性和相对专一性,绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。 相对专一性 有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能
3、作用于一类化合物或一种化学键。 1） 键专一性 有的酶只作用于一定的键，而对键 两端的基团并无严格要求。 2）基团专一性 另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。,消化道内几种蛋白酶的专一性,（芳香）,（硷性）,（丙）,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,弹性蛋白酶,羧肽酶,胰蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶,消化道蛋白酶作用的专一性,据酶分子组成分类,单纯蛋白质酶类,结合蛋白质酶类,酶蛋白质,辅助因子,金属离子 金属有机物 小分子有机物,据酶蛋白特征分类,单体酶 寡聚酶 多酶复合体,酶的化学本质及类别,第二节 酶的命名和分类（略讲）,
4、一、 命名：习惯命名；系统命名 二、 国际系统分类法及编号 *国际生物化学会酶学委员会（Enzyme Commsion）将酶分成六大类：1.氧还原酶类，2.移换酶类，3.水解酶类，4.裂合酶类，5.异构酶类，6.合成酶类 * 每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 大类 亚类 亚亚类 序号,第三节 酶催化作用的结构基础和 高效催化的策略,一、 酶催化的中间产物理论 二、 酶的活性中心 三、 酶作用专一性机理 四、 酶高效催化有关的策略,酶催化的中间产物理论,酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，
5、降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。,二、酶的活性中心,1、酶的活性中心和必需基团 酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（active center）或活性部位（active site），参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶分子的必需基团。 实例；胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 羧肽酶（ribonuclease）,2、酶的活性的研究 活酶的专一性研究 酶分子的化学修饰：差示标记法，亲和标记法 X-射线衍射法,Asp,His,Ser,胰凝乳蛋白酶的活性中心,活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195,为Tyr
6、248 为Arg 145 为Glu 270 为底物,差示标记法图解,R,A.非差示标记,B. 差示标记,R,亲和标记法,根据酶与底物特异结合的性质，设计或合成一种含有反应基团的底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。这种试剂象底物一样进入活性部位，接近结合位点，并以其活泼的化学基团与活性部位的某一基团共价结合，而指示出酶活性部位的特征。,+,X-Y,三、酶作用专一性机理,锁钥学说(lock and key th0ery)：将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。 诱导契合学说(induced-fit hypothesis)：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近
7、活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。,酶专一性的“锁钥学说”,酶专一性的“诱导契合学说”,四、酶高效催化的策略,1、 邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化 4、 酸硷催化 5、微环境影响,实例: lysozyme chymotrypsin carboxypeptidase RNase,酶分子中可作为亲核基团和酸硷催化的功能基团,Glu270,Tyr248,Arg145,底物,羧肽酶结合底物前后构象变化,差示标记法图解,R,A.非差示标记,B. 差示标记,R,溶菌酶催化的反应,NA
8、G:N-乙酰氨基葡萄糖 NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸,溶菌酶-底物复合物,A,B,C,D,E,F,酶切位点,溶菌酶活性中心与底物结合示意图,AsP52,Glu35,（极性区）,（非极性区）,溶菌酶底物D环变形模型,溶菌酶催化反应机理,C1+,非极性区,极性区,HO - E环,H,H2O,（广义酸碱催化）,羧肽酶活性中心Zn2+的中心作用,羧肽酶活性中心必需基团与底物间的结合,羧肽酶结合底物前后构象变化,羧肽酶活性中心的共价催化机理,羧肽酶活性中心的共价催化机理,RNase-底物复合物,RNase活性中心的酸硷催化机理,核糖核酸链受Rnase水解的位点,Py为嘧啶，B为嘌呤,胰凝乳蛋白酶分子中
9、催化三联体构象,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）,结合底物,His57 质子供体,形成共价ES复合物,C-N键断裂,底物,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2）,氨基产物释放,四面体中间物的瓦解,水亲核攻击,羧基产物释放,H2O,R-NH2,第四节 酶促反应的动力学,二、影响酶作用的因素 1、酶浓度 2、底物浓度 3、pH 4、 温度 5、激活剂 6、抑制剂,一、酶的活力与测定,酶促反应速度的测定与酶的活力单位,1、酶促反应速度的测定 初速度的概念 2、酶活力,3、酶活力的表示方法 4、酶活力测定方法：终点法 动力学法,检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、 浓度）来表示，而常用酶催化
10、某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。,酶促反应初速度的概念,酶活力测定方法,终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。 动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。,酶活力的表示方法,活力单位（active unit） 习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1moL变化量 / 分钟 Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒,转换系数（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每个酶分
11、子,比活力（specific activity）,2、底物浓度对酶反应速度的影响,酶反应速度与底物浓度的关系曲线 （MichaelisMenten曲线） 米氏方程的提出及推导 米氏常数的意义 米氏常数的测定,单分子酶促反应的米氏方程及Km,推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照 “稳态平 衡”假说的设想进行推导。,米氏方程:,米氏常数:,酶反应速度与底物浓度的关系曲线,米氏方程的推导,令：,将（4）代入（3），则：,ES生成速度：,，ES分解速度：,即：,则：,由于酶促反应速度由ES决定，即,将（2）代入（1）得：,(3),当酶反应体系处于恒态时：,当Et=ES时，,米氏常数的意义,* 当v
12、=Vmax/2时，Km=S（ Km的单位为浓度单位） * 是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。 * 可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。 在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意s时的v，或任何v下的s。（用Km的倍数表示） 练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80时底物的浓度应为多少？,米氏常数的测定,基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。 例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 米氏方程的双倒数形式：,1
13、Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,酶动力学的双倒数图线,3、pH对酶反应速度的影响,过酸过硷导致酶蛋白变性 影响底物分子解离状态 影响酶分子解离状态 影响酶的活性中心构象,pH,最适 pH,v,4、温度与酶反应速度的关系, 在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快 酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快 酶的最适温度不是一个固定不变的常数,v,温度,5、激活剂对酶作用的影响,类别 金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br- 有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：ED
14、TA,凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂（activator）,6、抑制剂对酶作用的影响,凡是使酶的必需基因或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶完全丧失活性的物质，叫酶的抑制剂（inhibitor） 。 类型：可逆抑制剂 不可逆抑制剂 应用：研制杀虫剂、药物 研究酶的作用机理，确定代谢途径,抑制剂类型和特点,竞争性抑制剂 可逆抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂,非专一性不可逆抑制剂 不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂,+ I,EI,ES,P+ E,E+S,竞争性抑制作用,非竞争性抑制作用,+ I,EI+S,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,实例：重金属离子（Cu
15、2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）,反竞争性抑制作用,ESI,ES,P+ E,E+S,+ I,竞争性非竞争性抑制作用机理示意图,竞争性抑制曲线,非竞争性抑制曲线,反竞争性抑制曲线,有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程,非专一性不可逆抑制剂,抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。,类型：,专一性不可逆抑制剂,这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。 实例：有机磷杀虫剂,-Ser-OH,第五节 重要的酶类及酶活性的调节控制,一、多酶体系(multienzyme s
16、ystem) 二、别构酶(allosteric enzyme) 三、共价调节酶(covalent regulatory enzyme) 四、酶原(enzymogen或proenzyme)的激活 五、同工酶(isoenzyme) 六、抗体酶(abzyme),一、多酶体系和多酶复合体,细胞中的许多酶常常是在一个连续的反应链中起作用，即前一个反应的产物是后一个反应的底物，在完整细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的反应体系，称为多酶体系（multienzyme system）。 如果体系中几种酶彼此有机地组合在一起。精巧地镶嵌成一定的结构，即形成多酶复合体。这种结构即能提高反应途径的效率，又能增强调
17、控的准确性。,分散多酶体系与中间物示意图,多酶复合体示意图,二、酶的别构（变构）效应和别构酶,概念：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节(allosteric regulation)，具有这种调节作用的酶称别构酶(allosteric enzyme)。别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线。 凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(effector)，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(positive effector)或别构激活剂，反之称负效应物(negat
18、ive effector)或别构抑制剂。 别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。 实例：天冬氨酸转氨甲酰酶 （anspartate transcarbamoylase，ATCase） 别构酶活性调节机理：序变模型和齐变模型,酶的别构（变构）效应示意图,别构酶的反馈调控机理,别构酶与米氏酶的动力学曲线比较,正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较,ATCase,ATCase所催化的反应,氨甲酰磷酸,天冬氨酸,氨甲酰天冬氨酸,E.coli的ATCase的亚基排列,催化(C)亚基（catalytic subunit）,调
19、节(R)亚基（ regulative subunit）,ATCase的半分子结构,ATCase半分子（C3R3)的结构,CTP site,catalytic site,ATCase alone,ATCase -PALA complex,ATCase的别构过度作用,PALA,PALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)结合到ATCase活性中心的模型,ATCase变构效应的动力学特征,Vmax,1/2Vmax,Km,别构酶的序变模型,别构酶的齐变模型,三、酶的共价修饰,某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发
20、现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。 由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。,A,P1,G,E,D,C,B,H,Ea-b,Ec-d,Ec-g,关键酶（限速酶）,P2,蛋白质的磷酸化和脱磷酸化,第一类：Ser/Thr型 第二类：Tyr型,第一类：Ser/Thr型 第二类：Tyr型 第三类：双重底物型,反应类型 共价修饰 被修饰的氨基酸残基,共价修饰反应的例子,磷酸化,腺苷酰化,尿苷酰化,Tyr,Ser,Thr.His,
21、Tyr,Tyr,甲基化,Glu,S-腺苷-Met,S-腺苷-同型 Cys,级联系统调控糖原分解示意图,意义：由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应。这种调节方式快速、效率极高。,肾上腺素或胰高血糖素,1、腺苷酸环化酶（无活性）,腺苷酸环化酶（活性）,2、ATP,cAMP,R、cAMP,3、蛋白激酶（无活性）,蛋白激酶（活性）,4、磷酸化酶激酶（无活性）,磷酸化酶激酶（活性）,5、磷酸化酶 b（无活性）,磷酸化酶 a（活性）,6、糖原,6-磷酸葡萄糖,1-磷酸葡萄糖,葡萄糖,血液,（极微量）,（
22、大量）,四、酶 原 的 激 活,体内合成出来的酶，有时不具有生物活性，经过蛋白水解酶专一作用后，构象发生变化，形成活性中心，变成有活性的酶。这个不具活性的蛋白质称为酶原（zymogen或proenzyme），这个过程称为酶原的激活。 该变化过程，是生物体的一种调控机制 。这种调控作用的特点是，蛋白质由 无活性状态转变成活性状态是不可逆的。 实例：消化系统蛋白酶原的激活 凝血机制（自学）,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,肠激酶,活性中心,胰蛋白酶原的激活示意图,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,肠激酶,胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用,五、酶的多种分子形式同工酶,概念：存在于同一种属或不同种属，同一个体
23、的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）。乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。 生物学功能：遗传的标志 和个体发育及组织分化密切相关 适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要 在各学科中的应用,乳酸脱氢酶同工酶形成示意图,多肽,亚基,mRNA,四聚体,结构基因,a b,不同组织中LDH同工酶的电泳图谱,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,肠激酶,胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用,同工酶在各学科中的应用,(1) 遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。,(2) 发育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，
24、以及个体发育和系统发育的关系。,(3) 生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。,（4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。,六、抗体酶,抗体酶（abzyme）又称催化抗体（catalytic antibody）,是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。 抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度
25、态分子向结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。,B.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态,C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物,磷酸酯类似物(半抗原),对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体,免疫,免疫反应,诱导法制备具有酯酶活性的抗体,基因工程抗体酶的制备,对已产生的单抗，分析氨基酸的组成或相应基因的碱基序列，对抗体结合的部位的基因进行定位突变，在抗体结合部位换上有催化
26、活性的氨基酸，基因工程的技术使得建立抗体基因的组合文库，并根据需要构建适当程序的基因片段成为可能。,抗体酶的筛选,在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆，再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。主要筛选方法有生物学筛选法和纯化学筛选法。,抗体酶的研究和应用前景,催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。 目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应。有
27、可能成为抗体酶研究的新热点。 充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。 抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。,第六节 酶工程简介,一、化学酶工程 天然酶 固定化酶 化学修饰酶 人工模拟酶 二、生物酶工程 克隆酶 突变酶 新酶,将酶学和工程学相结合，产生了酶工程(enzyme engineering)这样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。,固定化酶,将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物
28、(或载体)上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形式，称固定化酶(immobilized enzyme)。,共价偶联法,交联法,溴化氰亚氨碳酸基偶联法,OH,OH,BrCN,H2O,O,O,C=N-E,O-CO-NH-E,OH,O-C-NH-E NH,OH,H2N-E,（多羟基载体）,O-CONH2,OH,（惰性）,O,O,C=NH,（活泼）,OC N,OH,戊二醛交联法,H2N-E,酶的改造和模拟,酶的改造：功能基团的化学修饰酶 酶蛋白侧链的化学修饰 酶分子内或间的交联反应 酶的模拟：根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理，用化学方法制备结构较简单,高效、高选择性、稳定性能好的新型催
29、化剂,可以是无机化合物、有机化合物或小肽。,人工模拟酶-benzyme,环糊精,催化侧链,催化侧链连接到环糊精上，可模拟胰凝乳蛋白酶,生物酶工程示意图,酶的蛋白质结构功能,新酶分子蓝图,选择性修饰方案,突变酶,新酶,克隆酶,产品,效用,发展,酶基因,遗传设计,遗传修饰,DNA重组技术,DNA重组技术,问答题,1、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？ 2、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。 3、什么是米氏方程，米氏常数Km的意义是什么？试求酶反应速度达到最大反应速度的99时，所需求的底物浓度（用Km表示） 4、什麽是同工酶？为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离？同工酶在科学研究和实践中有何应用？ 5、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。 6、称取25毫克某蛋白酶制剂配成25毫升溶液，取出1毫升该酶液以酪蛋白为底物,用Folin-酚比色法测定酶活力,得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯式定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分钟产生1微克酪氨酸的酶量为一个活力单位计算，根据以上数据，求出（1）1毫升酶液中含有的蛋白质和酶活力单位数；（2）该酶制剂的比活力；（3）1克酶制剂的总蛋白含量和酶活力单位数。 名词解释 活性中心 全酶 酶原 活力单位 比活力 米氏方程 Km 诱导契合 变构效应 ribozyme 辅酶和辅基 固定化酶,
