1、王迪,Mar. 5, 2013,Email: jluwangdi,T淋巴细胞转化试验,主 要 内 容,实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定,实验分组及材料,分组：每组4人,原 理,Lymphocytes(B/T),mitogens,Specificity Ag,Proliferation transformation,lymphoblast,Nucleic Acid Protein ,T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体， 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。,有丝分裂原,有丝分裂原（mitogen）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类
2、及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂。 T和B细胞表面都有分裂素受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细胞向淋巴母细胞转化。这种转化细胞DNA合成增加，出现细胞体积增大，胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。,常用的丝裂原,T cell proliferation 植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)(人T） 刀豆素A（concanavalin, ConA）（鼠T） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) B cell proliferation 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)(鼠B） 金黄
3、色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM),常用的检测方法,形态学观察法 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法） 本次实验采用 MTT法,形态学检测方法,淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的34倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式
4、计算转化率：,3H-TdR掺入法,G0,G1,有丝分裂原,特异性抗原,S,Pr,RNA,DNA 前体物质,DNA,New DNA,3H-TdR,TdR,3H-TdR,cpm,T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对数量（以脉冲数cpm表示）可用来表示转化率的高低。 测定低能量3H的放射性需用液体闪烁计数器。,MTT法,MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二
5、甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜颗粒，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，通过检测490nm处光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。,活/增殖 期的细胞,线粒体 能量代谢,琥珀酸脱氢酶,MTT,MTT掺入,还 原,甲臢颗粒 formazan,细胞内/周围,溶解,测OD490值,DMSO,操作流程,第一天 1. 杀鼠、 取脾、捣碎、 获得细胞、 计数 2.
6、细胞稀释（1107）， 上样 （100ul/孔） 3. ConA 的梯度稀释，上样 （100ul /孔） 4.将96孔板置于细胞培养箱，做好标记，5%CO2 37 培养48小时。 第三天 1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值,1W,无菌取脾 研磨成单细胞悬液+1640 （无FBS),细胞计数【?/ml】 取20ul细胞+980ul的16
7、40 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝,加板(三复孔) (加法见附图),调细胞浓度 1107个 /ml,5%CO2 37培养48小时,培养终止前2小时加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔,5% CO2 37 继续培养2小时,2000rpm 10min,小心弃去上清，加入100ul/ 孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解,酶标仪测吸光度值：OD490nm,结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值,操作流程,实验步骤,单细胞悬液的制备 小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml无血清1640培养液的平皿内。 用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，
8、用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱网。然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中，剩余3ml培养液备用。 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。 细胞计数 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 用含血清1640培养液调细胞浓度至1107/ml，每组所需总量为4ml（此步
9、可使用之前装无血清培养液的离心管）。,实验步骤,查出四个大方格（16个小方格/大格）的总细胞数(X)； 算出每个大方格的细胞数：A=X/4 每个大方格的体积为：V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=A 104稀释倍数(100),细胞培养 按图所示加板。 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%CO2培养箱中，培养48小时。 MTT掺入： 在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。 每孔内加入MTT（5mg/ml) 20ul，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。 在37 5%CO2培养箱中继续培养2小时，取出板，观察颜色
10、变化，然后离心2000rpm，10min，轻轻吸去上清，注意不要将孔底部的颗粒物吸出）观察板底是否有蓝色的颗粒。 加入100ul 二甲亚砜（DMSO)，轻轻晃板，将颗粒完全溶解。 结果测定： 结果测量：用酶标仪测定490nm处光密度值（OD490nm），记录结果。 结果判定： SI（刺激指数）=ConA刺激孔值 /对照孔值,ConA的倍比稀释,100L ConA 200ug/ml,400L 含10%血清的1640,1 2 3 4 5 6 7,900L 含血清的1640,20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0.157 ug/ml,0,400L 含10%血清的1640,1,2,3,5,4,7,6,0,1 1 1,每个样品设置三复孔,“0”为培养基对照孔，颜色应逐渐变浅,2 2 2,3 3 3,4 4 4,5 5 5,6 6 6,7 7 7,0 0 0,加 板 方 法,结 果 处 理,算出SI值，用Excel作图，横坐标为ConA的浓度，纵坐标为SI值，要求带标准误差线。 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用Excel作的图一起贴到实验记录本上。 要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。,Excel 作图,
