1、第三讲 细胞凋亡 apoptosis,apoptosis,概述,凋亡过程与调控,发生机制,凋亡与疾病,凋亡在疾病防治中的意义,apoptosis,研究历史 定义 与死亡的区别 功能,概 述,概 述,apoptosis,早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是创新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）。,概 述,细胞凋亡异常,apoptosis,定义,概 述
2、,Apoptosis,PCD（programmed cell death）,由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程,apoptosis,细胞坏死,概 述,特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应,一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。,8,核固缩或碎裂 凋亡小体形成 (apoptotsis body),细胞皱缩 出芽 染色质边集,apoptosis,细胞肿胀 细胞结构全面破坏,细胞凋亡与坏
3、死形态学改变的差别,细胞凋亡与坏死的区别,坏死 凋亡,apoptosis,概 述,1.性质,2.诱导因素,强烈刺激，随机发生,较弱刺激，非随机发生,3.生化特点,4.形态变化,5.DNA电泳,6.炎症反应,7.凋亡小体,8.基因调控,被动过程，无新蛋白合成，不耗能,主动过程，有新蛋白合成，耗能,细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀,胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,弥散性降解，电泳呈均一DNA片状,DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带,溶酶体破裂，局部炎症反应,溶酶体相对完整，局部无炎症反应,有,病理性，非特异性,生理性或病理性，特异性,无,有,无,细胞凋亡的生理意义, 确保
4、正常发育、生长 维持内环境稳定 发挥积极的防御功能 所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。,apoptosis,概 述,apoptosis,概述 凋亡过程与调控 发生机制 凋亡与疾病,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,凋亡时细胞的主要变化,凋亡的调控,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程可大致分成4个阶段：,凋亡信号转导,凋亡基因激活,凋亡的执行,凋亡细胞的清除,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,+受体,cAMP Ca2+ 神经酰胺,凋亡诱导因素,死亡信号,凋亡相关基因激活,DN
5、ase激活 Caspases激活,巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞,基因激活,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,受体,cAMP Ca2+ 神经酰胺,凋亡相关基因激活,信号转导,细胞膜,细胞核,Dnase激活 Caspases激活,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,DNase激活,Caspases激活,凋亡细胞的清除,凋亡执行,apoptosis,生化改变,凋亡过程与调控,凋亡时细胞的主要变化,形态学改变,apoptosis,凋亡时细胞的形态学改变,凋亡过程与调控,空泡化,固缩,出芽,边集,凋亡小体,形态学特征：,生化特征：,胞浆内Ca2+浓度升高。 细胞内活性氧增多。 质膜通透
6、性变大。 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成160180bp为基数的有序片段。 型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。,apoptosis,凋亡过程与调控,细胞凋亡的生化改变,内源性核酸内切酶的激活,DNA片段化,DNA双链在核小体连接区被核酸内切酶切割而断裂成180-200bp或其整倍数的片段。,电泳呈特征性的“梯”状条带(ladder pattern),核小体,30nm,染色质的基本结构,“梯”状条带(ladder pattern),坏死条带,细胞凋亡的生化改变:,内源性核酸内切酶的激活,凋亡蛋白酶caspase的激活,灭活凋亡抑制蛋白 分解与细胞
7、骨架构成相关的蛋白 直接作用于细胞结构使之解体 瓦解核结构成核碎片,含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶 (cysteine -containing aspartate-specific protease),使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD 破坏细胞结构，如Lamina 将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如Gelsolin,Caspase 如何杀死细胞？,细胞凋亡异常,29,细胞凋亡的过程与调控,apoptosis,细胞凋亡的调控,凋亡的调控,31,凋亡信号,生理性凋亡信号,激素或生长因子的直接作用,病理性凋亡信号,激素或生长因子的间接作用,apoptosis,细胞因子：IL-2，神经生长因子
8、 某些激素 某些二价金属阳离子、药物,凋亡的调控,凋亡相关因素,诱导性因素：,激素和生长因子失衡,理化因素：高温、强酸、强碱、抗癌药物,免疫性因素,微生物学因素：细菌、病毒,抑制性因素：,凋亡程序的执行者,apoptosis,凋亡信号的转导,凋亡的调控,特点： 多样性：不同种类细胞有不同的信号转导系统 偶联性：死亡信号转导系统与细胞增殖、分化过程 中的信号转导系统在一些环节上交叉、偶联 同一性：不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系 统引起细胞凋亡 多途性：同一凋亡诱导因素可经过多条信号途径触 发细胞凋亡,凋亡信号的转导,与凋亡有关的信号转导系统： 1.胞内Ca2+信号系统 Ca2+在细胞凋亡中
9、充当了传递凋亡信号的角色；胞内Ca2+浓度上升可激活Ca2+依赖的谷氨酰胺酶，活化核转录因子等触发细胞凋亡。 2.cAMP/PKA信号系统 3.Fas蛋白/Fas配体信号系统,Fas配体或抗Fas抗体与Fas蛋白结合,神经鞘磷脂 酶活性,神经酰胺途径 诱导细胞凋亡,激活ICE样 的caspase,降解H1组蛋白 暴露DNase 的酶切位点,通过Ca2+信号系统 传递死亡信号,3.Fas蛋白/Fas配体信号系统,4.神经酰胺信号系统 电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素 5.二酰甘油/PKC信号系统 6.酪氨酸蛋白激酶信号系统 负调控作用,38,细胞凋亡信号的转导(transduction
10、),死亡受体介导的凋亡通路,内质网介导的凋亡通路,线粒体介导的凋亡通路,39,死亡受体,-是一类通过与相应配体结合， 传递细胞凋亡信号的膜受体,配体：TNF-、FasL、TRAIL等,死亡受体介导的凋亡通路,40,死亡受体介导的凋亡通路,41,死亡受体介导的凋亡通路,42,Fas,细胞膜,肿瘤坏死因子受体家族,胞外,抗Fas抗体、免疫细胞表面的FasL及可溶性FasL等,43,线粒体介导的凋亡通路,由死亡受体非依赖的凋亡信号启动,44,Ca2+ 、 NO、缺血、缺氧及活性氧等,线粒体介导的凋亡通路,45,线粒体介导的凋亡通路,Ca2+ 、 NO、缺血、缺氧及活性氧等,46,线粒体介导的凋亡通路
11、,47,线粒体介导的凋亡通路,48,Ca2+ 、 NO、缺血、缺氧及活性氧等,死亡受体通路,线粒体通路,小结,49,凋亡相关基因的激活,-凋亡相关基因按预定程序激活执行凋亡所需的各种酶类,内源性核酸内切酶 凋亡蛋白酶Caspases 组织型转谷氨酰胺酶 需钙蛋白酶,可使肌动蛋白、纤维连接蛋白和粘附蛋白等交联形成僵硬不溶的蛋白，凋亡小体,参与酶的活化和膜的再塑,50,凋亡的调控基因,51,促凋亡基因,wtP53,“分子警察”,?,52,P53介导的凋亡反应模式,抑制凋亡基因,Bcl-2,抗凋亡机制:,抑制促凋亡性调节蛋白(Bax等),抑制caspases的激活,即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因 (
12、B cell lymphoma /leukemia-2， Bcl-2),54,C-myc(癌基因),对细胞凋亡具有双向调节作用,无GF,双向调控基因,55,凋亡细胞的清除,吞噬细胞受体对凋亡细胞识别 （凋亡细胞有死亡标记）,凝集素：识别细胞表面糖类,Victronectin受体：由血小板反应蛋白介导,磷脂酰丝氨酸受体：磷脂酰丝氨酸,apoptosis,概述 凋亡过程与调控 发生机制 凋亡与疾病,氧化损伤 1.氧化应激（oxidative stress）的概念 -指机体活性氧产生过多或抗氧化能力下降，活性氧的清除不足，导致活性氧在体内积聚并引起氧化损伤的病理过程。 氧化损伤的后果之一就是诱导凋亡
13、。 2.氧化应激引起细胞凋亡的可能机制： DNA受损激活P53基因 膜通透性 Ca内流 DNase 生物膜损伤 m 脂质过氧化产物 多聚ADP核糖合成酶活化，NAD耗竭，ATP大量消耗 可活化NF-kB、AP-1，加速细胞凋亡相关的一些基因表达, 钙稳态失衡 Ca2作为许多细胞生命活动的第二信使，在细胞凋亡中的作用也倍受关注，凋亡发生时胞浆中Ca2 ，并激活凋亡过程中的关键酶类，其诱导细胞凋亡的机制为： 激活Ca2 /Mg2 依赖的DNase 激活谷氨酰胺转移酶（GTase），促进凋亡细 胞中蛋白广泛交联，有利于凋亡小体的形成 激活Ca2 敏感的蛋白酶 核骨架蛋白酶 核基质蛋白 丝氨酸蛋白酶
14、膜蛋白 激活核转录因子，加速促凋亡基因的转录, 线粒体损伤 目前证据显示，线粒体的功能改变在细胞凋亡 的发生中起重要作用 表现为 线粒体内膜通透性 线粒体内膜的跨膜电位m 能量合成水平 线粒体功能和结构破坏引起细胞凋亡的可能机制： 凋亡诱导因素作用于细胞后 线粒体内膜跨膜电位（m）下降， 线粒体内外膜之间的通透性转换孔PTP开放； 使细胞凋亡启动因子（Cyt.C）,凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡诱导因子（AIF）释放,apoptosis,发生机制,凋亡诱导因素,线粒体跨膜电位,线粒体PTP开放,Cyt.C,Apaf,等释放,AIF,潜在Dnase,活化Dnase,激活Caspases,细
15、胞凋亡,线粒体损伤,1.线粒体内的凋亡因子 在线粒体内外的腔隙中含有许多涉及细胞凋亡的因子， 包括其中特有cyt.c、AIF，以及与胞浆共有的Pro- Caspase-2、3、7、9，很多内外因素损伤线粒体膜的 完整性，促使线粒体释放这些凋亡因子，即可诱导细 胞凋亡。 cyt.c AIF-(+)DNase Apaf Apaf-1 与Ced-4同源 Apaf-2与cyt.c同源 Apaf-3与Pro-Caspase-9同源,2.线粒体膜通透性转变的影响因素 BcL-2基因家族 阻止线粒体膜通透性改变 PKC- Ca2+ 促进线粒体膜通透性改变 线粒体老化 3.线粒体跨膜电位（m）下降与细胞凋亡
16、以上介绍了细胞凋亡的发生机制 氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体损伤。三者既可单独启动，又可联合作用，三种机制互相联系，互为因果，是很多凋亡诱导因素的共同通路，也就是所谓细胞凋亡的恶性网络假说（deleterious network hypothesis),64,细胞凋亡异常发生机制,Mitochondria in Apoptosis,apoptosis,概述 凋亡过程与调控 发生机制 凋亡与疾病,67,细胞凋亡失调与疾病,细胞凋亡不足与过度并存,“该死的细胞没死”,“不该死的细胞死了”,apoptosis,细胞凋亡与疾病的关系 该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡
17、不足都可以导致疾病的发生。 细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病， 细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染 不足与过度并存：动脉粥样硬化,凋亡与疾病, 细胞凋亡不足 肿瘤：凋亡抑制基因Bcl-2基因过高表达-凋亡衰减（前列 腺癌） 促凋亡基因如p53基因突变或缺失，肿瘤发生率 自身免疫病 自身抗原受到自身抗体或致敏T淋巴细胞的攻击而损伤 T、B淋巴细胞通过正选择和负选择才能发育、分化成熟 负选择：凋亡清除针对自身组织抗原和TCR的双阳性细胞 正选择：保留能够识别自身组织抗原的T细胞，并增殖成熟,如果负选择机制失调，针对自身组织抗原的T细胞存活、增殖， 产生自身免疫病。, 细胞
18、凋亡过度 心血管疾病 心力衰竭 心肌缺血与再灌注损伤 坏死与凋亡共存 发生机制：氧化应激；细胞内钙超载； Fas受体上调；p53基因转录增强 凋亡特点：早期凋亡为主，晚期坏死为主 梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主 慢性、轻度缺血以凋亡为主，急性、重度缺血则常常发生坏死 IR引起的细胞凋亡有时比单纯缺血更严重,神经元退行性疾病 特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer disease AD） AD主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失,病理切片上可见-淀粉样蛋白沉积和神经元缠结 机制： -淀粉样蛋白基因位于21号染色体，当钙超载、氧化应激或神经生长因子分
19、泌不足时， Ca2内流增加，激活与-淀粉样蛋白合成有关的基因，使-淀粉样蛋白含量增加，沉积于神经元内，进一步激活周围的M释放细胞因子和炎性介质促进凋亡的发生,病毒感染 病毒感染宿主细胞后有两种结局： 一是诱导细胞 凋亡从而限制病毒生长（肝炎病毒）； 二是由病毒基因表达的蛋白抑制宿主细胞凋亡，造成持续性感染或增加某些病毒的致癌可能性。 AIDS:由HIV感染引起，其关键是CD4+淋巴细胞被破坏，导致CD4+淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。 CD4+淋巴细胞与HIV感染者病情发生发展有密切关系，它决定感染者是否发病和发病的速度和严重程度。,HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡的相关因素： 1
20、）HIV的基因产物GP120能直接启动CD4+淋巴细胞的死亡程序 2）合胞体形成： 3）Fas基因表达上调 4）T细胞激活 激活诱导的细胞死亡 5）细胞因子 受感染的M释放TNF增多 6）tat蛋白： 诱导CD4+淋巴细胞产生OFR，增强 Fas表达 7）慢性感染时，受感染CD4+淋巴细胞作为效应细胞，可增强未感染的CD4+淋巴细胞对凋亡的敏感性, 细胞凋亡不足与过度并存,由于细胞类型的差异，各种细胞在致病因子作用下，有些可表现为凋亡不足，而另一些细胞可表现为凋亡过度，因此同一疾病或病理过程中两种情况也可同时存在。 例如：动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）,AS 血管内皮细
21、胞凋亡过度而血管平滑肌细胞凋亡不足 血脂（oxLDL） 血流动力学改变 动脉内膜功能受损 血管内皮解剖性损伤 单核C粘附、移行内膜下 内皮下胶原暴露 吞噬LDL成为泡沫C 血小板激活 释放GF （PDGF、FGF、TGF-、EGF） 刺激平滑肌C、成纤维C增生 刺激结缔组织形成、抑制平 滑肌C增生,76,细胞凋亡在疾病防治中的意义,防治思路,凋亡不足,凋亡过度,77,细胞凋亡在疾病防治中的意义,合理利用凋亡相关因素,用外源性TNF诱导白血病细胞凋亡治疗白血病,用神经生长因子治疗阿尔茨海默氏病,78,细胞凋亡在疾病防治中的意义,合理利用凋亡相关因素,干预凋亡信号转导,用阿霉素刺激肿瘤细胞表达Fa
22、s， 促使肿瘤细胞凋亡,用环胞霉素A阻抑线粒体跨膜电位下降 和防止PTP开放防止细胞凋亡,79,细胞凋亡在疾病防治中的意义,合理利用凋亡相关因素,干预凋亡信号转导,调节凋亡相关基因,向肿瘤细胞导入野生型p53基因， 促使肿瘤细胞凋亡,80,细胞凋亡在疾病防治中的意义,合理利用凋亡相关因素,干预凋亡信号转导,调节凋亡相关基因,控制凋亡相关的酶,用锌抑制核酸内切酶和caspases 的活性治疗AD和AIDS,用钙阻滞剂抑制核酸内切酶和 caspases 防治缺血再灌注损伤,附：细胞凋亡检测,一、Annexin V-FITC结合膜表PS实验 二、细胞培养液LDH活性检测 三、核DNA片段检测 1.DNA Ladder 2.Tunel 法 四、镜检凋亡小体 五、 细胞凋亡反应核心因子检测 六、 流式细胞术,(补充) 凋亡检测方法,(补充) 凋亡检测方法,(补充) 凋亡检测方法,(补充) 凋亡检测方法,(补充) 凋亡检测方法,(补充) 凋亡检测方法,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）,
