1、中药抗心绞痛药效学研究,心绞痛指的是什么病？,冠心病的常见症状,原因：心肌供氧=需氧,表现：胸骨后阵发性压榨性绞痛或闷痛，放射至左上肢,心 绞 痛,冠 脉 痉 挛,心肌缺血缺氧,心 肌 耗 氧 量 增 加,冠 脉 狭 窄,乳酸、丙酮酸、组胺 k+等刺激神经末梢,心室壁张 力,冠 脉 粥 样 硬 化 或 血 栓,心率心收缩 力,每分射血 时间,冠脉循环特点,The right and left coronary arteries, the first branches of the aorta, carry blood to most of the myocardium.,影响心肌供氧的因素 1
2、、冠脉血流量 2、冠脉灌注压 3、侧枝循环 . . . . . .,影响心肌耗氧的因素 1、室壁肌张力 心室内压，心室容积，心室壁厚度 2、每分射血时间=每博射血时间心率 3、收缩力 4、心肌基本代谢 三项乘积收缩压心率左心室射血时间 二项乘积收缩压心率,如何观察中药抗心绞痛药效？,实 验 动 物,以家猫、犬、猪、大鼠、家兔等最为常用 犬和小型猪是建立心绞痛模型最常用的动物，其体积大小适中、性情温顺、易于训练，其心脏解剖及生理特点与人相似。 缺血再灌注性心律失常还经常用小鼠、豚鼠等，偶有用狒狒、猩猩、猴,动 物 模 型,（一）冠状动脉阻断或缩窄形成心肌缺血和心肌梗死模型,1、原 理,阻断或缩窄
3、冠状动脉方法减少或停止供应区的血流形成心肌缺血、心肌缺氧而发生代谢紊乱以至发生心肌坏死建立动物模型。 阻断或缩窄冠状动脉方法：如结扎、电刺激、气囊法、血管内异物及注入凝血酶或ADP法等,2、方 法,体重1015kg健康雌雄成年犬或小型猪 经戊巴比妥钠静脉麻醉 手术台固定分离气管并插管 连接电动呼吸机 左侧第四肋间胸，暴露心脏 分离冠状动脉左前降肢中段（一般相当于第三分支根部），可用以下几种方法阻断冠状动脉，形成心肌缺血。,（1）冠状动脉结扎法,在冠脉分离处穿一34丝线以备结扎，或用动脉夹临时夹闭阻断 多用于急性心肌炎缺血实验,（2）冠状动脉血栓形成法,将弧型针状电极（刺激电极）置于分离的冠状动
4、脉下， 另一电极（参考电极）距刺激电极0.6处置于心外膜下，两电极分别连接电刺激仪的隔离器正负极， 以2.5V、1mA直流电刺激冠状动脉30分钟左右，冠状动脉内血栓形成，阻断冠状动脉血流，诱发心肌缺血。,（3）冠状动脉气囊压迫法,压迫环由有机玻璃外套和可膨胀的乳胶小囊构成，外套长5，侧面1的缝隙，血管由此进入腔内，小囊长34，一端密闭，一端与直径1、长40的塑料管相连，并充满蒸馏水，经塑料管注3040l使小囊膨胀以压迫套内的血管，当压力去除时，小囊恢复原状，冠状动脉重新通畅，适用于急性和慢性心肌缺血或再灌实验。,（4）Ameroid缩窄环法,为了形成慢性冠状动脉闭塞、心肌缺血或观察冠状动脉侧枝
5、循环的变化，可将一具有吸水性的塑料环（Ameroid环）套在冠状动脉左旋支根部，关闭胸腔后，由于塑料环吸收组织水分膨胀，环外壳系硬质材料做成，限制环的外展，结果压迫冠状动脉，形成心肌缺血，环植入4周，血管内经可缩小80%90%。,（5）清醒动物心肌缺血试验,可将气囊压迫环固定在冠状动脉适当部位，然后缝合心包，放置心包膜电极，气囊的导管和电极的导线分别穿过胸壁引出皮外，逐层缝合关闭胸腔。实验时可注入蒸馏水，使气囊膨胀，压迫冠状动脉造成心肌缺血，同时测量心外膜电图和其它观察指标，本法可反复阻断冠状动脉，进行多次清醒动物的心肌缺血实验及再灌注损伤实验。,（6）缺血再灌注损伤,在心肌缺血一定时间造成心
6、肌损伤后，再供血一定时间，可加重心肌损伤而形成再灌注损伤的作用。,影响因素,1）动物冠状动脉分支及侧支循环有个体差异，对分支及侧支变异大的、不合标准的应剔除不用，各组动物模型心肌缺血程度和范围应接近 2）正式实验之前应熟练掌握动物开胸手术和冠状动脉应严格控制心外膜电极的位置、压力，心脏表面的温度、湿度及位置,影响因素,3）心外膜电极的位置，或反复测定的位置应准确固定，不应移位 4）电极对心脏表面不可压力过大，心脏表面的温度及湿度应稳定，其变化不应超过0.5，不可干燥，否则将影响实验的准确性,影响因素,5）口服中药应消化道给药，消化道给药又可灌胃给药或十二指肠给药，灌胃给药时，注意动物提前812
7、小时禁食 6）在进行本项实验一定要严格控制实验条件，排除干扰因素，确保实验结果的可靠性，必要时应同步监测血氧、pH值等。,（二）药物诱发心肌缺血模型,1、原理,近年研究认为冠状动脉痉挛是导致心肌急性缺血的主要原因之一，可致心绞痛、心肌梗死和猝死。通过药物诱发冠状痉挛法，如垂体后叶素、麦角新碱在整体动物（犬、小型猪、兔、豚鼠、大鼠）心脏上造成冠脉痉挛，急性心肌供血不足，及外周阻力增加，导致心脏负荷加重，形成心肌缺血，建立动物模型，评价抗心肌缺血药物的疗效。,2、方 法,1）脑垂体后叶素诱发心肌缺血模型,取大鼠麻醉仰卧固定将针状电极插入四肢及胸前心尖搏动处皮下同时连接心电示波器连续观察心电图变化，
8、记录胸前导联或导联心电图。 根据所试药物特点选择适当给药途径和间隔时间，静脉给药后15分钟，腹腔注射后1530分钟，灌胃后12小时，经舌下静脉或尾静脉注射脑垂体后叶素0.5（或0.7）u/kg，注射后即刻、5、10、15及30秒、1分钟、2分钟及5分钟，重复记录心电图（记录时间可据示波器所示异常情况决定）。 正常大鼠注射脑垂体后心电图变化可分两期：注射后即刻至30秒，T波升高，ST段抬高（超过0.1mV），尤以10秒左右变化最为明显。注射后至30秒至数分钟，T波低平，双相、倒置，心率变慢，P-R及Q-T间期延长。判定标准：以出现第一期或第二期缺血性变化为阳性，否则为阴性，比较各组的差异，并做统
9、计学处理。,（2）异丙肾上腺素诱发心肌缺血模型,健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、猫或犬均可。经心电图检查，弃去心电图有异常改变或心律失常者。 大鼠、豚鼠和犬每天皮下注射异丙肾上腺素28mg/kg，家兔1016mg/kg连续两天，第一次和第二次异给丙肾上腺素后30分钟内每隔5分钟记录心电图一次，第二次给药后24小时记录心电图后杀死动物，取心脏做病理切片检查。异丙肾上腺素可引起T波倒置或双相，拌有ST段抬高，窦性心动过速（心率明显加快），早搏或拌有其它心律失常。心肌病理观察可见；白细胞和巨噬细胞浸润，心肌纤维肿胀、断裂、横纹消失、甚至溶解、发生玻璃样变和脂肪变性等。比较各组心电图和病理变化，以判断药效
10、。,（3）麦角新碱诱发缺血模型,健康犬、体重1020kg，戊巴比妥钠30mg/kg注射麻醉，自右侧股动脉插入导管至左冠脉主干口内，以麦角新碱0.20mg/kg（溶于生理盐水10ml中），1分钟内注入，可形成冠脉痉挛及心肌缺血。,注意,脑垂体后叶素能收缩全身（特别是内脏）小血管，其作用是非特异性的 异丙肾上腺素为受体兴奋剂，其诱发心肌缺血模型适用于调节心肌代谢、氧供需平衡及作用于受体药物的研究 麦角新碱可诱发明显的冠状动脉痉挛和血流动力学改变，其造成的心肌缺血模型可用于评价通过缓解冠状动脉痉挛、改善血液流变性等多种途径防治心肌缺血的药物,（三）心肌缺血再灌注损伤模型,1、原理,心肌经一定时间缺血
11、（缺氧）后，突然恢复血（氧）供，会造成严重损伤，即“心肌缺血再灌注损伤”。其形成原因可能与钙离子超载、自由基损伤、中性粒细胞黏附浸润等有关。心肌缺血再灌注损伤模型既可用于整体动物，又能用于离体灌流心脏和体外培养心肌细胞。,2、方法,在体内心脏心肌缺血再灌注损伤模型。实验可用多种动物，如犬、小型猪、猫、大鼠等。 大鼠经戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉，呈背位固定，气管插管后连接人工呼吸机，胸部去毛、消毒后，沿左锁骨中线纵行切开皮肤，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏。在左耳和动脉圆锥之间表浅冠状静脉的下方结扎左冠状动脉前降支，结扎冠状动脉40分钟后打开
12、结扎，施行再灌注，造成急性实验心肌缺血再灌注损伤模型。,3、注意,整体动物实验应注意心肌缺血范围要适中，范围过大，再灌时易发生室颤而死亡。离体心脏实验时要严格控制灌流液温度及心脏环境温度变化在0.2， 所试药物pH值及各种无机离子浓度要在正常范围内， 中药粗制剂不宜作离体试验和试管内给药。,（四）离体心脏心肌缺血模型,1、原理,通过结扎离体心脏冠状动脉、离体心脏低氧或无氧灌流法形成心肌缺血，建立心肌缺血模型。,2、方法,实验一般用成年Wistar种雄性大鼠 腹腔大鼠戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉仰位固定分离一侧股静脉注入肝素125u/ml/只剪开胸壁，暴露心脏在主动脉第一头臂动脉发出处近端
13、横断，速将心脏投入4改良灌流液K-H液中，冲洗冠状动脉中的残留血液将心脏移到灌流装置下端，开始灌流。Langendorff灌流装置一侧为K-H液进行正常生理灌流；另一侧为含诱发心肌缺血的垂体后叶素（40u/L）及一定浓度药物的K-H液，同时进行造模及给药灌流。通过旋转三通变换灌流液。待心脏跳动规则后，在肺动脉起始处剪一小口，以利冠状血管回流液排出；将一蛙心夹夹在心尖部，连一机械电换能器，接载波放大器，连接记录仪，将心脏固定在灌流装置上，正常生理灌流3分钟后进行同步心率刺激（实验中持续进行），将心率调整为300次/分，10分钟后，调整记录仪，使心脏收缩幅度为20mm，进行给药灌流30分钟，记录给
14、药前、给药后5、10、20、30、分钟心率及心脏收缩幅度并测定冠流量。,3、注意,操作必须迅速准确，如摘除心脏、动脉插管等操作，要求处死动物至开始灌流要在2分钟内完成，防止缺血缺氧时间过长导致心肌损伤 灌流液必须新鲜配制；要严格控制灌流液温度及心脏环境温度变化在0.2，灌流液的氧分压必须控制在允许的范围内，所试药物pH值及各种无机离子浓度要在正常范围内 中药粗制剂不宜作离体试验和试管内给药。,（五）体外培养心肌细胞缺血样损伤模型,1、原理,利用体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞，通过暂时停止供应心肌细胞赖以生存的氧和葡萄糖，以及在一定时间后再恢复供糖供氧，即可造成心肌缺血缺氧和/或再灌注损伤模型。 该
15、模型可用于观察不同药物和处理方式对细胞生理功能、生化代谢、能量代谢、形态结构等变化的影响，从细胞水平评价药物的保护作用。,2、方法,取新生14天的Wistar种大鼠乳鼠，雌雄不限，无菌条件下开胸取心脏，剪去心房取心室肌，用Hanks液洗净组织上残留积血，将其剪成1mm3大小的碎块，用胰蛋白酶或胶原酶消化分离心肌细胞，以含20%小牛血清的培养基混匀，制成细胞悬液，根据实验要求调整细胞浓度为5105106/ml，接种于培养瓶或培养板中，置CO2培养箱中培养。每23天更换细胞培养基，取培养38天的单层细胞进行实验。培养好的用缺氧的Tyrods洗液3遍，加入缺氧的Tyrods液，移入缺氧室,持续一定时
16、间即可造成心肌缺血样损伤。或缺氧培养一定时间后，换用混合空气饱和的培养基正常培养一定时间，即可造成氧损伤。,3、注意,细胞培养期间需要密切注意pH值变化 培养瓶或培养板放入培养箱的前12小时尽量避免移动，否则会影响心肌细胞贴壁生长,（六）对心脏血流动力学及心肌耗氧量影响的研究,1、原理,心肌缺血往往伴随心脏血流动力学改变，大部分治疗缺血性心脏病有效的药物，均可明显改善血流动力学而发挥作用。因此，心脏血流动力学指标作为主要药效学研究内容。实验动物可用犬、小型猪、猫、大鼠，但后两种心脏较小，某些指标不宜直接观察，而犬和小型猪应作为首选动物。,2、方法,健康犬、小型猪，雌雄兼用，体重1215kg。实
17、验动物用戊巴比妥钠（30 mg/kg）静脉麻醉，手术固定，分离气管并插管，连接电动呼吸机，调节潮气量300600ml，动脉分压维持在90100mmHg，血pH在正常范围；左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包；分离冠状动脉左旋支及主动脉根部。放置相应直径电磁流量计探头，分别测量冠脉血流量及新输出量。左心室尖部插管，连接压力换能器，测定左室内压，再经微分器测定左室内压上升最大速率。劲外静脉插管，以血氧测定仪或血气分析仪测定冠状静脉窦血氧含量及动脉血氧含量。股动脉血氧含量。股动脉插管测定动脉血压，以肢体导联观测标准导心电图并计算心率。公式计算其它血流动力学指标：心搏出量、耗氧指数、心脏指数、冠脉阻力
18、、总外周阻力及氧利用率等。,3、.注意,本实验难度较大，要具备成套精密仪器设备。 实验人员要经过严格训练，手术期间尽量减少对心脏功能的影响。 分离主动脉根部及冠状动脉、放置相应电磁换能器、冠状静脉窦插管、心尖部插管等是手术成功的关键。,（七）冠脉循环实验,1、原理,冠脉流量是评价防治心肌缺血药物的重要指标，虽然能增加冠脉血流量的药物很多，但不一定都有防治心肌缺血的作用。因此，应以多种指标综合分析，了解供需平衡两方面的变化，特别是净效应，才能获得准确的结论。,2、方法,（1）犬冠脉循环实验法 手术方法和步骤同心脏血流动力学试验。实验动物开胸手术完成后，分离主动脉根部、冠状动脉左旋支。放置适宜电磁
19、流量计探头，测量心输出量、冠脉血流量，同时测定动脉血压。实验结、结束后，取下心脏称重，以1/3心重作为冠脉左旋支血流供应区域，计算每100g心肌每分钟血流量。,2、方法,（2）心肌营养学流量测定 取体重2124g的健康小鼠随机分组，给药或对照后隔一定时间，根据待试药物的药代动力学过程确定，从尾静脉注射Rb86Cl生理盐水0.1ml（400010000脉冲/分钟）5秒注入，注射后30秒，立即处死动物，开胸取出心脏，用生理盐水冲洗4次，每次10ml。然后将心脏置玻璃研伯钵内，磨成匀浆，放于特制铝箔小皿内，在普通灯下烘干，用-射线自动定标器记数。以每个心脏放射性占注入总放射性的百分数为指标，观察小鼠
20、心肌摄取Rb86量的多少。,3、注意,分离主动脉根部及冠状动脉、放置相应电磁流量宜轻柔，尽量减少对心脏的刺激；为防止Rb86污染，全部操作应在磁盘内进行，实验结束后一并处理；Rb86量及动物处死时间要准确，并将心脏的动静脉全部剪掉；每只动物取心脏时所用剪刀、镊子各用一套，以防不同动物间互相干扰。,客 观 指 标,（一）心肌缺血与梗死范围的测量方法,1、形态学方法,测定心肌缺血与梗死范围常用的形态学方法主要有两种： 一是大体标本染色法，N-BT染色、TTC染色或双重染色，用病理图象分析软件加以分析，可以定量心肌缺血与梗死范围，目前该方法是国际上常用的、公认的测量方法。 二是组织切片法，该方法相对
21、费时费力，反能弥补大体染色法精确度不高的特点，光镜下可观测心肌病变程度和范围，电子显微镜可观察包括细胞膜、线粒体、内质网、细胞核及染色质等心肌细胞超微结构的改变。,2、心外膜电图标测法,阻断或缩窄冠状动脉形成心肌缺血与梗死，以多点心外膜电图标测心肌缺血与范围的变化。,3、酶学方法,测定血中磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）等与心肌损伤相关的酶类变化，动态观察心肌损伤情况，定量分离心肌损伤程度。,4、核示踪法,将对心肌坏死有亲和力的物质进行核标记来观察心肌缺血和梗死情况,5、荧光照相法,用表面荧光照相来分析缺血区情况。,6、其它分析方法和指标,心肌代谢指标，如心肌氧代谢、其它物质及能量
22、代谢（如FFA、ATP、PGI2、TXA2、cAMP/cGMP、NO、ET、SOD、MDA、乳酸、钠、钾、钙、镁离子、血凝状态及血液流变性）等。,（二）心脏功能及血流动力学,心功能及血流动力学试验观测指标应包括：,心电图、心率、动脉血压、冠脉流量、冠脉阻力、心输出量、心肌收缩力、左室内压、左室内压最大上升速率、中心静脉压、左室射血的张力指数、左室作功指数、心搏出量、心脏指数、心搏指数、总外周阻力等，并可同时测定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指数等。无创性心功能检查：如超声心动图、阻抗图、-照相等。,（三）心肌细胞缺氧损伤,1、形态学,在光学显微镜下可观测入伪足变化、胞浆空泡形成、胞浆颗粒增加、异形
23、（长形、纺锤形）心肌细胞的出现率等。在扫描或透射电镜下观察超微结构的变化。,2、心肌细胞搏动的变化,包括搏动的频率、节律及强度等。,3、胞浆酶的变化,如LDH、CPK、-羟丁酸脱氢酶、转氨酶等的变化。,（四）冠脉循环实验,冠脉循环实验主要考察指标为：,冠脉血流量、返流量、返流压、冠状静脉窦血流量、心肌营养血流量、心肌区域血流量、冠脉侧支循环情况等。,（五）心肌氧代谢情况,主要考察心肌氧耗量、心肌氧张力、张力-时间指数（TTI，PTI）、心肌耗氧指数、正性肌力作用等。,（六）与缺血性心脏病相关的分子生物学研究,随着现代生命科学的迅猛发展，缺血性心脏病的研究越来越深入，中药对目前发现的与缺血性心脏
24、病相关的基因表达影响的研究正逐渐增多，但这些方面的研究应该慎重，最好能结合整体动物实验来说明问题。,（七）其它指标,（1）血小板聚集性 （2）血栓形成及溶栓情况 （3）血液流变学指标：血液黏度、血浆纤维蛋白原含量、红细胞压积、红细胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流变学指标等。,主要药效学研究,一、心肌缺血试验,1、阻断冠状动脉,结扎法、气囊压迫法、血栓或栓塞法、逐渐缩窄法。,2、药物法,诱发冠状动脉痉挛：垂体后叶素或麦角新碱。 增加心肌氧耗：异丙肾上腺素。,3、离体实验,离体心脏灌流：结扎冠状动脉，低氧或无氧灌流。 离体心脏、心肌片或培养心肌细胞的缺血样损伤。,4、再灌注损伤试验,整体试验，
25、离体心脏，心肌片或培养心肌细胞试验,动物选择：,首选犬或小型猪，其他如猫、大鼠等亦可选用,观测指标：,生理指标；心电图、心外膜电图、体表标测心电图等。 生化指标：磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶、乳酸、游离脂肪酸、钾、钙离子、自由基等。 形态学指标：大体标本及镜下或电子显微镜下的定量组织学观察，例如硝基四氮唑兰或双重染色显示梗塞区及缺血区等。,试验选择：,各类新药均应做一项阻断冠状动脉的心肌缺血试验。一类及二类新药另加一项其他试验。,药物及给药途径,应与临床一致,动物数及设组,用犬或小型猪作试验，每组510只，应设空白对照，阳性药对照及新药大小剂量组，至少四组。其他动物应酌情增加动物数及组数。,二、心
26、脏功能及血流动力学试验,动物,可用犬、小型猪、猫或大鼠，不宜用免。,观测指标,包括冠脉流量，心输出量、左室作功、左室内压、左室舒张末期压、左室内压最大变化速率、动脉血压、外周阻力等，进行连续动态观测。,试验分组,每组35只犬、猪或猫，或10只大鼠 应设空白对照，阳性药对照及新药大小剂量组，至少四组。,试验选择：,一二类新药应做本项试验。三类新药因药物制剂及给药途径问题，无法进行本项试验者，可用其他试验间接说明其药效。,三、心肌耗氧量试验,直接测定,心肌耗氧量测定，心肌组织氧分压测定（可多部位、多层次测定），离体心脏、心肌片或心肌细胞耗氧量测定。,间接测定,张力时间指数，心肌耗氧指数，正性肌力作
27、用。,耐缺氧试验,离体心脏或心肺灌流耐缺氧试验，心肌细胞培养耐缺氧试验及其他。,试验选择,上列方法中，以犬在位心的心肌耗氧量测定较为常用，其他直接测定方法亦可酌情选用。间接方法只可选作辅助试验，作为参考。 一二三类新药应进行本项试验，对药物及给药途径的要求同前项试验，确有困难无法完成本试验者，可选用其他试验间接说明之,四、其他,1、冠脉循环试验,如大冠脉血流量，返流量、返流压、心肌区域血流量，冠脉造型、造影，或高体冠状动脉条，心肌营养血流量等试验。,2、活血化瘀试验,如血小板、血栓、血凝、血液流变学及微循环试验等。,3、与冠心病有关的心律失常、心力衰竭、心源性休克、血脂代谢及动脉粥样硬化等试验
28、。,4、新药对各种离子通道、受体、酶等的影响。,注意事项,1、犬心肌缺血试验、心脏血流动力学及心肌耗氧量试验，为本类新药主要药效学研究的三项基本试验，一二类新药必需做，三五类新药也应尽量做，粗制剂确有困难者可免作心脏血流动力学试验。四类新药应作心肌缺血试验，并与原剂型对比。,2、新药给药途径应与临床相同，但有些试验消化道给药难于做出结果，可改用其他途径给药，制剂不合要求，干扰结果者，可酌情选作其他试验或免作。,3、为体现中药特点，应适当选作活血化瘀有关试验，并努力探索，建立适合中药特点的药效学研究方法。,4、新药常具有某些特色或优点，除进行上述三项基本试验外，应根据其作用特点，适当选作一些辅助试验加以证实。,
