1、中药药效毒理学 浙江中医药大学药理教研室,中药药效毒理学总论,一、中药药效毒理学概念及意义 二、中药药效学 三、中药毒理学 四、中药新药临床前研究概论,一、中药药效毒理学概念及意义,中药药效毒理学是在中医药理论指导下，运用多种现代科学技术研究中药药效与毒理及其作用机制的一门学科。,中药药效毒理学意义,中药 药效学 有效性 毒理学 安全性 药学 质量可控性 中药现代化要求现代中药必须有的“安全、有效、稳定、 可控”的要求，同时尽可能在一定程度上保持复杂体系的特性。,二、中药药效学,正确认识中药的药效:,中药的药效,中医理论中药 传统特色,中药药效的现代药学性,复杂体系,整体-系统-器官-细胞-分
2、子-靶点 单靶点、局部治疗方法,西药,中药要在继承和创新的基础上发展现代化与国际化，必须抓好现代药物和中药双重特性研究。,1、现代药学性（相似于西药）： 快、强、单靶点（少靶点）局部作用、对症,（1）中药单体 延胡素乙素 止痛 青藤碱 抗炎 小檗碱 抗痢疾杆菌 青蒿素 抗疟疾 (2) 中药成分有效部位 银杏叶片 银杏总黄酮 扩张血管 雷公藤总苷片 （3）复方 速效救心丸 (川芎、冰片) 冠心病 复方丹参滴丸（丹参、三七、冰片），连续9年销售额10亿，09年14.6亿。 清开灵颗粒（胆酸、猪去氢胆酸、珍珠母、生栀子、水牛角 板蓝根、黄芩苷、银花）。,2.中药双重特性 特殊性：复杂体系特性,（1）
3、作用的多效性（多系统、多环节、多靶点发挥作用 ） 中药成分复杂，甚至单味中药就相当于一个小复方。成分的复杂性导致作用的多效性。 人参的成分有人参皂甙、挥发油、多种有机酸、糖类、多种微量元素等，单就皂甙而言就有二十余种。它们的作用并不相同。 人参全药:对中枢神经系统、免疫系统、消化吸收、物质代谢等均可产生影响。,养心氏片 处方： 党参、黄芪、灵芝、淫羊藿、当归、葛根、丹参、山楂、延胡素、地黄、黄连、珍珠、人参、甘草。 功效：扶正固本，益气活血，行脉止痛。 主治：用于气虚血淤性冠心病、心绞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等症。,大多数中药起效较慢，有些中药需经多次给药才显现其药理作用。 钩藤煎剂给
4、自发性高血压大鼠连续灌服5周才见血压明显下降。 黄芪、党参等药的增强免疫功能、提高应激能力等作用，大多需经连续多次给药后才能见效应。 中药的作用还多表现温和，作用持续时间相对 较长。 人参虽能增强心肌收缩力，但与西药强心甙类药相比，作用慢，时间长。 生脉饮增强心肌收缩力。,（2）作用相对缓慢、温和、持久,（3）量效关系的复杂性 西药药理效应一般表现为在一定的范围内随着剂量的增加而增强（典型的量效关系）。 中药 典型的量效关系 不典型量效关系 无量效关系 小剂量和大剂量作用相反 如木香总生物碱在小剂量时使离体兔耳血管扩张，大剂量时却起收缩反应。 如枳实对肠平滑肌低浓度时在短时间抑制后呈兴奋作用，
5、而高浓度时又呈抑制作用。,（4）作用的相对不稳定性 品种与产地 采收季节 贮藏条件 炮制方法 工艺,品种 12000余种中药，常用药500余种 同名异物，同物异名者很多 大青叶和板蓝根，来源于5个不同科属，药 典正品十字花科植物菘蓝 金钱草 文献记载其品种有9科14种，正品 应为报春花科植物过路黄 来源不同-化学成分、药理作用差异很大,品种与产地,结合型蒽苷大黄致泻成分 正品大黄结合型蒽苷含量高 泻下作用明显 ED50为326-493mg/kg 混杂品种结合型蒽苷含量低 泻下作用差。 ED50为3579-5000mg/kg,产地 中药生长分布的区域性很强 自然环境对植物药成分影响很大 金银花：
6、绿原酸含量 道地产品（河南、山东）为4%-7.59%，其他大多在3%以下。 野山参与园参：人参总皂苷含量 总量、皂苷种类及含量均不同。,“道地药材” -特定产地-名贵药材 四川贝母 附子 黄连 内蒙甘草 云南三七 茯苓 木香 山西黄芪 党参 西藏红花 吉林人参 浙江浙八味 白术、白芍、浙贝母、杭白菊、 延胡索、玄参、笕麦冬、温郁金,采收与贮藏 中药品质 与采收季节密切相关。根、茎、叶、花、果实、种子或全株的生长和成熟期各不相同，中药材的采收时节也随入药部位的不同而异。,“当季是药，过季是草” “三月茵陈四月蒿 五月砍来当柴烧”,采收季节 人参八月采收，其人参皂甙的含量高达22.6%，而一月采收
7、的人参，皂甙含量仅有7%，相差3倍以上。 青蒿素在7-8月花前叶盛期含量最高达6%。 药物采收时间对药品质量有重要的影响 人参、何首乌药材以生长年限长者为好。 白芍中芍药苷含量: 2年生者最高 4年生含量不到2年生含量的一半,炮制,炮制是中医长期临床用药经验的总结。 炮制前后，中药的化学成分，药理作用 及临床疗效均会发生改变。,（l）消除或降低药 物毒性或副作用 （2）增强疗效 （3）加强或突出某 一作用,乌头加热水解后，生成乌头碱，进一步水解为乌头原碱，其毒性仅为乌头碱的1/200-l/4000。 水飞雄黄可除去很大一部分有剧毒的三氧化二砷。 砂炒马钱子使其所含士的宁和马钱子碱减少。,延胡索
8、醋炮制 水煎液生物碱的溶出量增加近一倍。 苦杏仁炮制后，抑制酶活性，苷分解减少。煎出率提高1.73倍。,生大黄炮制后，游离型蒽苷含量增加，故制大黄则抗菌作用强。 何首乌炮制后结合型蒽醌衍生物水解，故补益作用增强。 炉甘石中碳酸锌经煅制生成氧化锌，可消炎收敛，收湿敛疮。,制剂与煎煮方法,中药制剂对药效的影响 丸药：大黄虫丸 散剂：川贝母粉 汤剂：常用,煎煮方法 分煎、合煎对药效的影响 桂枝汤抗流感病毒性肺炎、抗炎、镇痛等作用，合煎优于分煎。 煎煮方法除影响药物有效成分的溶出外，药物在共煎的 过程中还可能有新的成分产生。 将生脉散合煎，以制剂作为一个整体进行复方化学研究，从合煎液中分离得到一个新的
9、成分，经鉴定为5-羟甲基-2-糠醛。这种新成分与该方药效直接相关，而在该方单味药（人参、麦冬、五味子）分煎液中未见有这一成分。,（5）某些作用的双向调节性 同一中药，既可使机能亢进状态向正常状态转化，又可使低下的机能状态向正常状态转化，即调节截然相反的两种病理状态，称为双向调节作用。 双向调节的机理： 与机体的机能状态和中药多成分性具有密切关系。 当作用相反的两种成分作用于机体时，机体的反应在很大程度上取决于当时的机能状态。如当时的机能状态偏于兴奋，则引起兴奋的成分产生的反应较弱，而抑制性成分产生的反应增强；反之，抑制性成分产生的作用减弱，而兴奋性成分产生的作用增强。,人参能使低血糖升高，又能
10、使高血糖降低； 三七既具有活血功能，又有止血效应，见瘀血则能散，遇出血则能止； 苦参对急性感染疾病出现的白细胞升高，有抑制炎症，降低白细胞的作用，而对于因化疗引起骨髓抑制出现的白细胞降低，又有保护骨髓，升高白细胞的作用；,在中药中，有时存在作用相反的两种成分。 人参皂甙Rb类 镇静作用 Rg类 兴奋作用 人参对中枢神经系统既可产生兴奋，也可产生抑制效应，它能使过度的兴奋或抑制两种过程得以恢复平衡，使中枢神经系统功能趋于正常。 当归挥发油阿魏酸 抑制子宫平滑肌 水溶性或醇溶性的非挥发性物质 兴奋子宫平滑肌 当归对子宫平滑肌亦可呈现双向调节作用。,3.中药药效学研究特点,一、中药药效学研究以中医药
11、基本理论为指导，注意结合中药功效设计药理试验 比如：清热解毒 解热、抗炎、抗菌、抗病毒、抗内毒素 增强免疫,二.传统中药及其方剂，其成分复杂，往往是多成分、多环节、多靶点的整合作用, 抗菌、抗炎, 清除氧自由基,三.整体与离体实验相结合，注意中药多种成分和多方面药理作用 1. 中药作用起效往往较慢，药理试验常常要多次给药或预防给药才有效，有些成分是在体内经过化学变化才发挥作用。 2. 体外试验专一性强，能够观察药物对某一器官、组织、细胞的作用，可以排除体内各种复杂因素的干扰，获得准确、精细的结果。 缺点:失去了机体完整统一的内环境和神经体液调控作用，某些药物经体内代谢成活性物质才有药理作用。,
12、四.合理处置试验中药，注意避免中药药理研究出现假阳性或假阴性结果 影响中药药理作用的因素: 中药品种、产地、采收季节、贮存保管、炮制方法、提取方法和工艺。 杂质及各种无机离子:干扰均影响实验结果。即使是中药中提取出有效部位或单一成分，在进行药效试验时，也要根据研究的目的，合理处理试验材料，正确设计试验方法，才能正确反映中药药效。,证,症,证-外在表现（在外可察的表现） 症- 内在的病 通过对证的诊察可认识和掌握症 通过对证治疗消除病症、整体康复,五.建立“证”动物模型以研究中药药效,我国已经研制建立了“阴虚”、“阳虚”、“气虚”、“血虚”、“血瘀”、“脾虚”、“肾虚”、“厥脱症”等许多“证”的
13、动物模型，有些模型虽然还有待进一进研究，但这些动物模型对开展中药作用及作用机理起到积极作用。,三、中药毒理学,1、加强中药毒副作用的监测和研究是中医药的生存和发展,（1）马兜铃酸事件 比利时: 苗条丸 慢性肾功能衰竭 英国: 含马兜铃酸中药 肾功能衰竭 中国： 龙胆泻肝丸 慢性肾功能衰竭 关木通 广防己 马兜铃酸 青木香,马兜铃酸肾病临床特征及病理改变,临床特征：肾功能衰竭 血尿 蛋白尿 肾脏病理特点：肾小管间质纤维化，小管萎缩或缺失，肾皮质外层受损严重，而深层病变较轻。,引起马兜铃酸肾病的原因 a.剂量和疗程的不合理。大剂量或长期使用所致 属于药物毒性反应的范畴。 木通药典剂量为36克，在此
14、剂量罕见肾毒性的报道，国内报道引起急性肾功能衰竭的剂量范围较大，在15100克，多数为30克以上，甚至为60120克。 有患者长年服用如龙胆泻肝丸（最长20余年，累计近3000袋，6g/袋）。,动物实验实验证明 用药典法定剂量的关木通（1g/kg/d，相当于人用剂量0.1g/kg/d）给大鼠灌胃2个月，大鼠肾组织结构、肾功能、尿NAG、尿蛋白、尿糖等均无明显改变， 大剂量关木通（60g/kg/d）给大鼠灌胃3天则可引起急性肾功能衰竭， 北京协和医院肾内科用马兜铃酸5mg/kg/d给大鼠腹膜内注射，用药8周前大鼠肾脏无明显损害，而此后则可见到肾小管间质损害逐渐加重，24周时出现明显的慢性肾间质纤
15、维化病理改变,b.药物的误用 药用防己来源较多，名称亦较混乱。 粉防己（汉防己Stephania tetrandra）为防己科植物粉防己的干燥根 广防己（木防己 Arislochia fangchi Y.C）为马兜铃科植物广防己的干燥根 汉中防己 马兜铃科植物异叶马兜铃的根 在比利时等先后报道的误将木防己为汉防己使用所致。 在英国报道的2例患者将关木通（马兜铃科缠绕藤本植物木通马兜铃 Aristolochia manshuriasis Kom）当作川木通（毛莨科小木通Clematic armandii Franch）使用。,面对的问题 a.我国已批准上市的中成药中含有马兜铃酸的品种也较多，如处
16、方中含关木通的中成药41种，包括不同剂型共50余个;含青木香的中成药17种，包括不同剂型共20个;含马兜铃的中成药11种；含广防己的中成药5种等。因此，对该类品种的怎样保证其安全性。现在作为处方药管理。 b.对于申报含马兜铃酸的中药新药，应怎么办?,建议进行以下研究： （1）处方合理性研究。在目前基础研究还不深入的情况下，进行含马兜铃酸新药研究应慎重。在立项进行适应症选择时建议仅考虑疑难病证，组方时进行合理性论证，并进行必要的拆方试验，以证明其是处方中不可缺少的药味。建议在十分必要时才使用含马兜铃酸药材。,（2）药学研究。建议固定药材的品种、产地；考察炮制、制备工艺对马兜铃酸含量的影响；研究建
17、立药材及制剂中马兜铃酸的限量检查方法，提供详细的方法学研究资料（包括方法选择、最低检出限考察等），并将该检查项分别列入药材及制剂的质量标准。 （3）药理毒理研究。应加强安全性评价。 急性毒性试验 长期毒性试验 一般毒理学试验 血液学、血液生化学及组织病理形态学观察,（2）日本小柴胡汤事件 伤寒论 柴胡、黄芩、半夏、大枣、人参、甘草、生姜 在19981999年，日本出现在服用小柴胡汤的肝病患者中有50人引发了间质性肺炎，其中8人死亡，临床表现为发热，干咳，呼吸困难，胸部X线检查有间质性阴影，淋巴细胞刺激试验（出现阳性。2000年，日本厚生省宣布，禁止慢性肝病患者使用小柴胡汤。,（3）新加坡的黄连
18、毒性事件 辅酶 G6PD 先天缺乏 GSSG 还原酶 GSH 红细胞正常代谢和膜的完整 （氧化型谷光甘肽） （还原型谷光甘肽）,20世纪七十年代，新加坡出现孕妇或新生儿服用黄连或含小檗碱的中药时发生新生儿溶血性黄疸，在80例服用含小檗碱中药的新生儿中近70%出现黄疸，临床表现为皮肤、巩膜黄染，血清胆红素增高。 1978年，新加坡政府卫生部宣布黄连或小檗碱为毒品，全国禁止使用和买卖黄连及含小檗碱的药物。,（4）中药注射剂不良反应事件 刺五加注射液 茵栀黄注射液 双黄连注射剂 痰热清注射剂 清开灵注射液 鱼星草注射剂 过敏反应（过敏性休克最严重） 胸闷、心悸 呼吸困难,鱼星草注射剂（鱼腥草素钠、合
19、成鱼腥草素钠、新鱼腥草素钠等） 截止到06年5月31日 不良反应报告5488例 严重病例258例 过敏性休克132例 死亡44例,2、毒性中药的化学成分 中药毒性的出现与药物化学成分的含量与种类关系密切。 （1）生物碱类 含乌头碱的中药 乌头碱 川乌、草乌、附子 毒性表现：损害中枢神经系统及周围神经系统 中毒机理：乌头碱先兴奋后麻痹各种神经末梢，刺激迷走神经中枢，甚至麻痹血管运动中枢、呼吸中枢，以致心源性休克、呼吸衰竭而致死。 含莨菪碱、东莨菪碱和阿托品生物碱 小天仙子 中毒机理： M一胆碱受体阻滞剂，对周围神经则为抑制交感神经机能，对中枢神经系统则为兴奋作用，严重者转入中枢抑制致嗜睡、昏迷。
20、,含士的宁和马钱子碱 马钱子 毒性主要作用于脊髓、大脑皮质或延脑等高级神经中枢，主要表现为脊髓反射性的兴奋显著亢进，引起特殊的强直性痉挛，常因呼吸肌强直性收缩而引起窒息死亡。 含雷公藤碱 雷公藤 对中枢神经系统的损害可引起视丘、中脑、延脑、脊髓的病理改变，肝脏、肾脏、心脏可发生出血坏死，中毒剂量可引起肾小管细胞变性坏死，肾曲小管上皮轻度脂肪变性，而稍小剂量的致死多以肾功能衰竭为主。,(2)苷类 强心苷 夹竹桃 对心肌有显著兴奋作用中毒后主要表现为胃肠道方面，严重时可出现传导阻滞、心动过缓、异位节律等，最后因心室纤颠，循环衰竭而致死。 氰苷(即苦杏仁苷) 杏仁、桃仁、批杷 在水中溶解度较大不稳定
21、，易被同存于种仁中的苦杏仁酶水解，苷元水解后可产生有毒的氢氰酸，可引起组织缺氧，并损害中枢神经，中毒后主要表现为中枢神经系统症状。 木通皂苷 水解后得长春藤皂苷元等，能损害肾小管，导致其上皮细胞坏死，严重者可导致肾功能衰竭。,(3)毒蛋白类 毒蛋白主要存在于植物的种子中，其毒理作用是对胃肠粘膜有强烈的刺激和腐蚀作用，能引起广泛性的内脏出血。 巴豆油毒性球蛋白 内服中毒后主要症状为急性胃肠炎，有服巴豆油20滴而致死者，致死原因可能是对对血球及中枢神经系统有原浆毒作用。 苍耳子含苍耳子毒蛋白 能损害心、肝、肾等内脏及引起脑水肿，尤以肝损害为甚，继发引起脑水肿而致的惊厥可能为死亡的直接原因。 蓖麻子
22、毒蛋白 7 mg即可使人中毒死亡，易使肝肾等发生损害。,(4)金属元素类 矿物类药物 砒石(红砒、白砒)成分为三氧化二砷，急性中毒主要是胃肠症状及神经系统症状，急性中毒可并发肾衰、中毒性肝炎、心肌炎，严重者可引起脱水、酸中毒、休克、昏迷，最后可因呼吸中枢麻痹死亡。 水银、轻粉等含有汞，汞化合物能抑制酶的活性，引起中枢神经和植物神经功能紊乱，如中毒后可出现精神失常，胃肠道刺激症状和消化道出血，严重时刻发生急性肾功能衰竭而死亡。 含铅类中药有铅丹、铅粉等，可作用于全身各个系统，主要损害神经、造血、消化和心血管系统。,3、正确对待中药的毒副作用 其实作为药物，不管是中药还是西药，都存在毒副反应的问题
23、。 （1）西药都经过严格的毒理学试验，药品说明书上一般都详细列出可能出现的不良反应及注意事项。 （2）对于中药，虽然古代中医学家早已认识毒性是中药药性的组成部分，中药学记载的毒副作用-这只是对中药临床毒理学的宏观认识，缺乏微观研究。 （3）中药的毒性成分与药效成分并不一致，中药的药效、毒性发生缓慢，不易观察。中药的毒性除其本身的化学成分外，还有中药种植和生产过程中带来的农药残留等问题。,中药毒副作用小的前提是 治疗剂量药典规定量 细辛不过钱-散剂或末 剂型汤剂（水提取液） 给药途径-口服 （“中药安全，没有副作用” 的误区） 中药毒性的改变 板蓝根注射剂-过敏性休克、荨麻疹 大剂量、久服- 肾
24、毒性,阐明毒性及毒性机理-控制毒性 雷公藤对心脏有毒 雷公藤片控制其用量-防止对心脏的毒性，饮片中含量不稳定，难以掌握其用量 附子：乌头碱煎煮（加热）乌头碱分解破坏，毒性下降，有效成分去甲乌头碱保留。 生半夏大毒-制半夏无毒，生半夏含3、4二羟基苯甲醛刺激粘膜（眼：充血、水肿、起泡；胃：呕吐；声音：失音；咽：口腔-麻辣感、起泡)。,国外对中药的接受和认同的差异 a.在欧美发达国家，对于药品的三个特性最重视的就是安全性，安全的前提下才可使用，安全性是第一位的，有效性是程度问题，第三则考虑可控性。 b.欧美发达国家药品说明书把毒副反应以及在什么情况下不能使用罗列得非常详细，而我国则尽量少提毒副反应
25、，似乎一个药品不良反应越少越好，实际上这是一个误区。当然，外国药厂有医疗保险的责任问题，需要这样写明，反过来，也说明我国对此问题重视不够。,4、借鉴先进方法，提升中药标准 国外对中药安全性的评价方法大体通过四种模式进行评价。 （1）美国评价模式 要求药物的化学成分基本清楚，作用机理基本明确。从药物的化学成分、药效角度进行评价。 （2）欧洲评价模式 对于化学成分不清楚的，不做成分、机理要求，但要求安全有效，质量可控。 （3）药物流行病学研究方法 研究人群的中药作用与效应，通过收集用药人的安全性资料，分析用药过程中发生的不良反应和药物之间的内在联系，保证中药安全性评价的先进性。,四、中药新药临床前
26、研究,中药新药临床前研究的重要性,（一）动物试验可获得大量在人体无法获得的信息 （二）确保其有效性及安全性,中药新药评价的核心 毒 理 学 药 理 学 药 学,安全,有效,质量可控,有效或高于有效 是否有效 吸收 剂量对主要生理 为何有效 分布 系统的影响 （协同、相加） 转化、排泄 其它药理作用 量效关系 体内变化规律 发现新用途 时效关系 优选给药方案 毒理研究参考 作用机理 临床合理用药 毒理研究参考 药理毒理研究参考,药理学,一般/安全药理学,主要药效学,药代动力学,- 致癌性 遗传毒性 生殖毒性 局部耐受性、过敏、 依赖性、免疫毒性 光敏和其它试验等 了解毒性反应剂量、时间、强度、症
27、状、靶器官及可逆性等， 为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护 措施、保证受试者用药安全,毒理学,局部用药毒性,全身用药毒性,急性毒性,长期毒性,特殊毒性,目的,中药新药药效学研究,一、基本目的确定有效性 是否有效、作用的强弱、优缺点和特色，确定有无开发前景。 重视前期药效的筛选，力求得到较准确的药效评价。 设法找出主要药效学的特点、有效作用剂量范围（量效关系）、有效作用时间长短（时效关系）。,二、基本要求,试验负责人 受试药物 研究单位 实验动物 试验记录 统计处理,三、方法及注意事项,药效研究参考资料: 1、中药新药研究指南（药学 药理学 毒理学）中华人民共和国卫生部药政管理
28、局，1994：66-67 2、中药新药研制开发技术与方法 王北婴、李仪奎主编 上海科学技术出版社2001.12 3、中药药效研究思路与方法 陈奇主编 人民卫生出版社（2005.12) 4、中药药理研究方法学 陈奇主编 人民卫生出版社（2006.1) 5、中药药理实验方法学 李仪奎主编 上海科学技术出版社（2006.10） 6、国内外研究论文,1、实验设计 符合中药特点； 符合国家新药研究申报的有关规定； 符合随机、对照、重复原则； 重视中药复方配伍规律性的研究。,(1)单味研究法 (2)药对研究法 (3)药物组间关系法 (4)撤药分析法 (5)正交设计法 (6)均匀设计法 (7)量效关系法,撤
29、药分析法: 从复方中撤出一味或一组药进行实验 黄芩汤:黄芩、芍药、甘草、大枣 结果：减黄芩显著影响药效，分别减芍药、甘草、大枣变化不大。说明君药在全方中起主导地位。,量效关系法： 四君子汤：党参、白术、茯苓、甘草 1 ： 1 ： 1 ：0.5 巨噬细胞吞噬功能增强，调整甘草到1/3，功能减弱。 当归补血汤: 黄芪、当归 5 ： 1 免疫增强作用，调整黄芪剂量（1/2、2、4倍）均作用不明显。,2、动物选择 种类：实验常用小鼠和大鼠 、豚鼠 、家兔 、狗 等级：二级动物即清洁动物（CL） 性别：一般试验选用雌雄各半动物。 数量：一般小鼠不得少于10只，大鼠为8只，狗为4只以上,3、方法的选择 （
30、一）根据主治，参考功能，选择试验方法 针对性强、重点突出、主次分明。,中药治疗缺血性中风主要药效学研究方案 1.对脑缺血试验 选用大鼠大脑中动脉血栓模型和双侧颈总动脉阻断致不完全性脑缺，观察连续给药2-3天对局部脑缺血和不完全性全脑缺血性损伤的保护作用。,评价指标,（1）脑梗死范围 （2）神经症状 （3）脑血流量（CBF）或区域性脑血流量（ICBF） （4）脑组织含水量 （5）脑内神经递质,（6）脑组织生化指标：包括能量代谢和毒性产物，如三磷酸腺苷（ATPase）、磷酸肌酸（Per）、乳酸（LA）、乳酸脱氢酶（LDH）、自由脂肪酸（FFA）、脂质过氧化物（LPO）、兴奋性氨基酸（EAA）及基因
31、表达等。 （7） 神经细胞病变程度：应进行定性、定量组织学观测。,2.结合功效选做内容,益气活血 微循环试验 血小板聚集性试验 血栓形成试验 凝血时间、凝血因子的测定 血液流变学试验 清热解毒 脑组织炎性因子,（二）采用反映中药特点的试验方法及动物模型,抗病毒感染中药复方研究实验设计 1、对病原体的抑制作用 2、对症治疗 退热作用 抗渗出抗炎作用 抗肺纤维化作用,（1）流感病毒所致小鼠肺炎的保护作用；选择流感病毒肺炎模型，以肺指数、死亡率、血清NO含量为观察指标 （2）抗高热作用 *对毒素所致家兔发热模型的退热作用 *酵母所致大鼠发热模型的退热作用 （3）抗渗出、抗炎：选择油酸致呼吸窘迫症模型
32、观察所选药物对呼吸功能的影响。,（4）对吸入性肺炎的保护作用：选择内毒素吸入性肺炎损伤模型，以BALF中弹性蛋白酶、蛋白含量为观察指标 （5）抗炎作用（急性炎症） 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响（常规药理试验） 对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响（常规药理试验） （6）对内毒素所致大鼠多脏器衰竭的保护作用：选择内毒素或角叉菜胶多脏器损伤模型观察所选药物对重要脏器的保护作用。 评价指标：生化指标（ALT、AST、GREA、BUN ），脏器指数（心、肝、脾、肺、肾），血象测定（WBC及分类、RBC、PLT、凝血时间）,（三）整体和离体方法选择 中药由于成分复杂，特别是复方粗制剂，为多种化学成分(或有效部
33、位)的混合体，除有效成分外，尚有一些无关成分及干扰成分。因此，药效学试验应以体内试验为主，体外试验为辅；以消化道给药为主，其他给药途径为辅。 若为中药有效成分(或部位)制剂较纯者，或临床为注射给药者，可用体外试验或注射给药进行主要药效学试验。,4、指标的选择 （一）特异性强 （二）敏感性高 （三）重现性好 （四）客观性 （五）定量指标 （六）多指标综合运用 ：生理、生化、形态等各类指标合理搭配，综合运用,5、试验组给药剂量 （一）根据半数致死量(LD50)计算 凡是能够测出LD50者，可用其1/10、1/20、1/30、1/40等相近剂量，作为药效学试验的高中低剂量组。 （二）根据临床用量计算
34、 其粗略的等效倍数为1（人）、3（狗、猴）、5（猫、兔）、7（大鼠、豚鼠）、1011（小鼠） （三）根据文献估计剂量 （四）根据体表面积估计剂量 根据体表面积折算法换算的同等体表面积（m2、cm2）单位时的剂量,6、给药方式 7、对照药的选择 （一）阳性对照药 1.可比性：其功用、主治、剂型、给药途径应与新药相似 2.合法性：阳性药应是国家中国药典或部颁标准，或新批准生产的合法药物 3.择优选用：学术界或社会公认有效的、有代表性的“好”药 （二）原剂型对照 改剂型新药的阳性对照药 （三）空白对照品,中药复方药效研究的创新思路和方法,（一）建立中医药信息系统，将大大提高中药复方药效的研究效率 中
35、医药信息系统：药用植物库、方剂库、中药有效成分三维结构数据库。,（二）引入基因组学、蛋白质组学、代谢组学及基因芯片技术 中药复方突出的特点是活性多组分、作用多靶点、多途径；突出多层次、多脏器、多水平调理过程。（复制证的动物模型） 基因芯片对中药复方研究和中药药物筛选,指通过用药前后表达谱的变化,找出靶基因及受靶基因调控的基因 。 培养的人细胞(细胞水平)和动物模型(整体水平)两种方法 相互参照和比较。,中药新药毒理学研究 一、研究目的 1、阐明人体安全用药的剂量和时程：包括中毒剂量、安全剂量范围、服药周期。 2、阐明毒性反应的表现和特点（急性毒性反应、慢性毒性反应、蓄积性，毒性反应可逆与否等）
36、、毒性的靶器官及作用机理。,3、阐明毒性成分的体内过程或毒代动力学。 4、探索毒理学方法学研究。 5、毒性反应的预防、治疗。,如何将动物毒理学数据外延或推论到人体？ 啮齿（鼠）和非啮齿（狗）两种动物进行毒理学试验，它们所表现出来的毒性反应和人体的毒性反应之间的一致性有约70%的概率；而单用啮齿动物所作的毒性试验，其和人的一致性概率仅为43%；单用非啮齿动物的一致性概率为63% 。,急性（单次给药）毒性 长期（重复给药）毒性 致突变（遗传毒性） 生殖毒性 致癌性 其它毒性（过敏性、溶血性、光毒性、免疫毒性、药物依赖性等试验）,二、毒理研究范围,三、毒性安全性评价中的注意事项,一般药理学试验研究
37、（安全性药理） （Safety pharmacology）,研究目的,1.确定受试物非期望出现药物效应的情况，它可能关系到人的安全性； 2.评价受试物在毒理学或临床研究中观察到的药物不良反应或病理生理作用；研究所观察到的或推测的药物不良反应机制。 3.为长期毒性试验设计提供参考，为临床研究和安全用药提供信息，为开发新的适应症提供信息。,一、受试物： 采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容积或给药方法限制，可采用原料药（提取物）进行试验。,二、剂量设置 中、高剂量
38、应高于药效学的有效剂量，并与低剂量呈倍数关系 ，应设至少3个剂量组。 三、试验指标的选择 （一）心血管系统 测定并记录给药前后血压（包括收缩压、舒张压和平均压）、心电图（包括QT间期、PR间期、QRS波、ST段和QRS波等）和心率等的变化。治疗剂量出现明显血压或心电图改变时，应进行相应整体或离体的进一步研究。,（二）呼吸系统 测定并记录给药前后的呼吸频率、节律和呼吸深度。治疗剂量出现明显的呼吸兴奋或抑制时，应进行相应整体或离体进一步研究。 （三）精神神经系统 动物自主活动、平衡能力、与戊巴比妥钠的协同 。,四、结果及分析 应根据详细的试验记录，对结果进行定量和定性统计分析，说明具体的统计方法和
39、选择理由，同时应注意对个体试验结果的评价。根据统计结果，分析受试物的一般药理作用，结合非临床药效学、毒理学及临床试验结果，综合分析这些药理作用所提示的临床意义。,补充的安全药理学研究,泌尿系统：观察药物对肾功能的影响，如对尿量、比重、渗透压、pH、电解质平衡、蛋白质，细胞和血生化（如尿素氮、肌酐、蛋白质）等指标的检测。 自主神经系统：观察药物对自主神经系统的影响，如与自主神经系统有关受体的结合，体内或体外对激动剂或拮抗剂的功能反应，对自主神经的直接刺激作用和对心血管反应、压力反射和心率的影响。 胃肠系统：观察药物对胃肠系统的影响，如胃液分泌量和pH、胃肠损伤、胆汁分泌、体内转运时间、体外回肠收
40、缩的测定。 其它器官系统：当出于对安全性的关注时，在其它有关研究中尚未研究药物对下列器官系统的影响，如潜在的依赖性、骨骼肌、免疫和内分泌功能等的影响，则应考虑药物对这方面的影响。,急性毒性试验 （Acute toxicity testing） 指在一日内一次或多次应用受试药物给予动物后，短期内所产生的毒性反应及死亡情况。,一、受试物： 建议受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。,（一）动物 啮齿类-小鼠或大鼠 非啮齿类-犬或其它 一类药至少必须用二种动物(啮齿类及非啮齿
41、类各一种, 其中非啮齿类宜用Beagle犬); 其它类酌情用二种动物 小鼠18-22g, 同次体重相差不超过4g; 大鼠120-150g, 同次体重不超过20g; 犬用成年犬 各半 （二）给药途径、给药容量 拟临床给药途径和静脉注射 常用：大鼠 1020ml/kg、小鼠 2040ml/kg,（三）剂量和试验周期 1.找出0%及100%估计致死量。 2.以一定的剂距（10.60.85）上下各推二组确定预试验的剂量分组。,指动物单次给药后引起50动物死亡的剂量。 LD50值的意义是：LD50越小表示药物的急性毒性越大。 动物：小鼠、大鼠等 动物与分组：一般5组；每组10只 雌、雄各半。试验前禁食
42、给药途径：临床给药途径 观察14天，进行大体解剖观察，如有改变 - 病理检查,毒理研究- 急毒,LD50试验,指动物单次大剂量给药或在24小时内接受多次大剂量受试药物后，动物在短期内出现的与药物相关的毒性反应，但是又不引起动物死亡的最大剂量 动物：小鼠、大鼠、犬等 动物数：小动物20只；大动物4只 雌、雄各半。试验前动物应注意禁食 给药途径：临床给药途径 观察14天，进行大体解剖观察，如有改变 - 病理检查,毒理研究- 急毒,最大耐受量试验（MTD）,该试验多用于中药和毒性较小的其它药物研究。 指药物以最高浓度和最大容积的给药，剂量可能并未达到最大耐受的剂量，所以该剂量被称为最大给药量。 具体
43、要求可参照最大耐受量试验。,毒理研究- 急毒,最大给药量试验,注意事项,1给药浓度、给药容量、给药途径 2观察期限 3. 非口服途径给药 4. 动物行为指标 5 有毒中药中毒症状要详细记录,长期毒性试验研究 （Chronic toxicity testing) 试验设计至关重要。试验设计应作到科学、周到、合理 。,一、试验动物 选用动物的生长敏感期阶段进行试验。即大鼠5-8周龄、体重80-100g左右，Beagle犬4-12月龄 二、剂量设置 高剂量应使动物出现明显毒性或严重的毒性反应，或个别动物出现死亡；中剂量应使动物出现轻微的或中等程度的毒性反应。,应注意的问题： （一）剂量设置较低，与药
44、效学剂量间无安全范围 （二）与药效学剂量的表示方法不一致 （1）参考急性毒性试验的LD50值：大鼠大、中、小三剂量一般为LD50值的1/10、1/50、1/100 （2）参考最大给药量 1、1/3、1/10,（3）参考拟用临床剂量 3个月 大鼠 50-100倍、25-50倍、10-20倍 狗 30-50倍、15-25倍、5-10倍,长期毒性试验的给药周期 临床疗程 长期毒性给药周期 啮齿类动物 非啮齿类动物 1周 2周 2周 2周 1个月 1个月 1个月 3个月 3个月 3个月 6个月 6个月 3个月 6个月 9个月,三、样品提供和给药途径 一次性提供中试样品，要求与临床拟用途径一致 。 四、
45、预试验 易被忽略。实验全程耗时耗力，一般重复不起。用少量动物进行预实验很有必要，其中重点解决最大给药量的问题。,给药剂量 一般3个给药剂量组 高剂量 - 动物应出现毒性和个别死亡（20%） 低剂量 - 等于或略高于有效剂量 ，无毒性 中剂量 - 介于以上两者之间 ，轻微毒性 或者按急毒结果： LD50法 (1/10, 1/50, 1/100) MTD法 (1, 1/3, 1/10),毒理研究- 长毒,试验方案设计- 给药方案,对照组的设置 - 通常给药组和对照组的动物数应基本相等 - 对照组可根据试验方案的具体要求和研究目的设立 阴性对照组、溶媒对照组 观察指标 全面、针对特点 一般体征、饮食
46、、体重变化；血尿常规、血液及血液生化指标、心电图，脏器/体重系数、重要组织器官的肉眼和病理组织学观察、死亡情况。应记录毒性症状出现、减轻或消失的时间。体重和进食量每周测1-2次。 周期3月的，1/3动物检查中期主要指标； 如发现异常可适当增加检查次数。,毒理研究- 长毒,试验方案设计- 给药方案,特殊毒理学研究 包括致突变性、致癌性、生殖毒性、致敏性、依赖性。,致突变（遗传毒性） 目前建立的遗传毒性试验是研究机体遗传物质受外源性化学物质或其它环境因素作用时对有机体产生的遗传毒性作用。 遗传毒性试验包括体外和体内检测系统。两者应结合进行研究。 体外检测系统包括细菌回复突变、微核试验、哺乳动物细胞
47、染色体畸变等；体内试验包括骨髓微核试验、显性致死试验等。,毒理- 致突变,生殖毒性试验 评价药物对哺乳动物生殖的影响，推测对人可能的生殖毒性 研究分为三段 I段（一般生殖毒性）：是评价对成年动物生育力和早期胚胎发育影响，评价药物对配子成熟，交配行为、受孕、胚胎着床前和着床的影响 II段（致畸敏感期毒性）：即妊娠动物在胚胎器官形成期给药，评价药物对亲体、胚胎、胎仔发育影响 III段（围产期毒性）：在妊娠动物分娩前后给药，评价胎仔出生前后的发育和孕鼠从妊娠后期至断奶期间给药对妊娠、分娩、哺乳、胚胎、胎仔发育的影响。 根据临床用药次数、适应证和拟用人群决定是否进行该试验 创新药，一般可在申报临床研究前先提供
