1、动物检疫专业方法标准验证动物检疫专业方法标准验证 马贵平马贵平2013年年6月月内内 容容 动物检疫标准专业委方法标准验证方案动物检疫标准专业委方法标准验证方案 动物疫病诊断方法标准验证程序动物疫病诊断方法标准验证程序 内内 容容 动物检疫标准专业委方法标准验证方案动物检疫标准专业委方法标准验证方案 1选定试行验证的标准选定试行验证的标准 2标准验证工作要求标准验证工作要求 3验证时间验证时间 4备选标准的验证备选标准的验证 内内 容容 动物疫病诊断方法标准验证程序动物疫病诊断方法标准验证程序 1 适用范围适用范围 2 术语和定义术语和定义 3 方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的
2、验证活动 4 标委会的验证或标委会的验证或/和审定活动和审定活动动物检疫标准专业委方法标准验证方案动物检疫标准专业委方法标准验证方案1选定试行验证的标准选定试行验证的标准 云南检验检疫局负责起草制定的云南检验检疫局负责起草制定的“猴猴T淋巴细胞白淋巴细胞白血病检疫技术规范血病检疫技术规范”（2011B018）中国检科院负责起草制定的中国检科院负责起草制定的“牛及其产品中特定牛及其产品中特定转基因成分定性转基因成分定性PCR检测方法检测方法”（2012B398）。）。前者涉及的技术方法有前者涉及的技术方法有 ELISA 和和PCR，后者涉，后者涉及的技术方法是及的技术方法是PCR。动物检疫标准专
3、业委方法标准验证方案动物检疫标准专业委方法标准验证方案1 选定试行验证的标准选定试行验证的标准 备选了备选了2个正在起草制定的标准：个正在起草制定的标准：天津检验检疫局承担的天津检验检疫局承担的“口蹄疫非结构蛋白抗体口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范检疫技术规范”（2012B031）福建检验检疫局承担的福建检验检疫局承担的“牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻/粘膜病检粘膜病检疫规范疫规范”（2011B464r）。）。备选验证标准按照被选定验证标准的要求进行验备选验证标准按照被选定验证标准的要求进行验证准备。证准备。2 标准验证工作要求标准验证工作要求标准起草人按照标准起草人按照“动物疫病诊断方法标准验证程
4、序动物疫病诊断方法标准验证程序”对起草制定的对起草制定的标准送审稿进行验证。验证方法敏感性和特异性的阳性样品、阴性样标准送审稿进行验证。验证方法敏感性和特异性的阳性样品、阴性样品量根据被验证标准能达到的参数而定。品量根据被验证标准能达到的参数而定。注：假定方法标准注：假定方法标准DSe为为98%、DSp为为95%，置信区间为，置信区间为95%，DSe和和DSp的错估率为的错估率为5%。阳性样品不应少于。阳性样品不应少于30份，份，阴性样品不应少于阴性样品不应少于73份。份。标准起草人完成验证试验并取得满意的结果后，向动检标准专业委秘标准起草人完成验证试验并取得满意的结果后，向动检标准专业委秘书
5、处提交书处提交标准送审稿及标准验证文字材料标准送审稿及标准验证文字材料。特定置信区间下不同的特定置信区间下不同的DSe和和DSp要求要求的已知样品的理论数量的已知样品的理论数量来自来自OIEOIEManualManual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2012 of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2012：C H A P T E R 1.1.5 PRINCIPLES AND METHODS OF VALIDATION OF DIAGN
6、OSTIC ASSAYS FOR C H A P T E R 1.1.5 PRINCIPLES AND METHODS OF VALIDATION OF DIAGNOSTIC ASSAYS FOR INFECTIOUS DISEASESINFECTIOUS DISEASES2 标准验证工作要求标准验证工作要求 动检标准专业委秘书处收到标准送审稿及其验证材动检标准专业委秘书处收到标准送审稿及其验证材料后，指派料后，指派2名专家对有关材料进行审查。名专家对有关材料进行审查。审查合格的，秘书处指定审查合格的，秘书处指定3个独立实验室进行验证。个独立实验室进行验证。标准起草人向独立实验室提供验证所需的
7、样品，独标准起草人向独立实验室提供验证所需的样品，独立实验室也可以用自己拥有的经确认的已知样品。立实验室也可以用自己拥有的经确认的已知样品。审查不合格的，要求标准起草人继续完善相关材料。审查不合格的，要求标准起草人继续完善相关材料。独立实验室按照独立实验室按照“动物疫病诊断方法标准验证程序动物疫病诊断方法标准验证程序”对指定的标准送审稿进行验证。并将验证结果及相对指定的标准送审稿进行验证。并将验证结果及相关验证记录提交给秘书处。关验证记录提交给秘书处。2 标准验证工作要求标准验证工作要求 秘书处指定至少秘书处指定至少3名专家与标准起草人对独名专家与标准起草人对独立实验室的验证结果进行分析、判定
8、。验立实验室的验证结果进行分析、判定。验证结果符合证结果符合“动物疫病诊断方法标准验证动物疫病诊断方法标准验证程序程序”相关要求及被验证标准适用目的的，相关要求及被验证标准适用目的的，推荐进行会议审定。推荐进行会议审定。验证结果不符合验证结果不符合“动物疫病诊断方法标准动物疫病诊断方法标准验证程序验证程序”相关要求及被验证标准不适用相关要求及被验证标准不适用目的的，不推荐进行会议审定，要求标准目的的，不推荐进行会议审定，要求标准起草人继续完善后再验证。起草人继续完善后再验证。2 标准验证工作要求标准验证工作要求 负责负责“猴猴T淋巴细胞白血病检疫技术规范淋巴细胞白血病检疫技术规范”验证验证工作
9、的三个独立实验室：工作的三个独立实验室：广西检验检疫局动检实验室广西检验检疫局动检实验室 广东检验检疫局动检实验室广东检验检疫局动检实验室 上海检验检疫局动检实验室上海检验检疫局动检实验室 负责负责“牛及其产品中特定转基因成分定性牛及其产品中特定转基因成分定性PCR检检测方法测方法”验证工作的三个独立实验室：验证工作的三个独立实验室：珠海检验检疫局动检实验室珠海检验检疫局动检实验室 山东检验检疫局动检实验室山东检验检疫局动检实验室 福建检验检疫局动检实验室福建检验检疫局动检实验室2 标准验证工作要求标准验证工作要求 本次标准验证工作总负责人为孙颖杰本次标准验证工作总负责人为孙颖杰 责任人为马贵
10、平责任人为马贵平 验证工作组专家为郑腾、薄清如、林志雄、验证工作组专家为郑腾、薄清如、林志雄、岳志芹。岳志芹。责任人和专家负责本次标准验证试验材料责任人和专家负责本次标准验证试验材料的审核的审核。3 验证时间验证时间 起草制定标准的实验室须于起草制定标准的实验室须于2013年年8月底完月底完成验证工作。成验证工作。指定的独立实验室须于指定的独立实验室须于2013年年9月底完成验月底完成验证工作。证工作。4 备选标准的验证备选标准的验证 指定指定北京检验检疫局、中国检科院、辽宁检验北京检验检疫局、中国检科院、辽宁检验检疫局、深圳检验检疫局动检实验室检疫局、深圳检验检疫局动检实验室验证天津验证天津
11、检验检疫局起草制定的检验检疫局起草制定的“口蹄疫非结构蛋白抗口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范体检疫技术规范”（2012B031）、福建检验）、福建检验检疫局承担的检疫局承担的“牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范粘膜病检疫规范”（2011B464r）。）。标准制定实验室和独立实验室进行的验证工作标准制定实验室和独立实验室进行的验证工作要求与本方案第要求与本方案第2条的要求相同。条的要求相同。内内 容容 动物疫病诊断方法标准验证程序动物疫病诊断方法标准验证程序 1 适用范围适用范围 2 术语和定义术语和定义 3 方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 4 标委会的验证或标委
12、会的验证或/和审定活动和审定活动动物疫病诊断方法标准验证程序动物疫病诊断方法标准验证程序1 适用范围适用范围 本程序规定了动物检疫方法标准制修订过本程序规定了动物检疫方法标准制修订过程中的验证要求及程序。程中的验证要求及程序。本程序适用于出入境动物检疫方法标准制本程序适用于出入境动物检疫方法标准制修订过程中的验证活动。修订过程中的验证活动。2 术语和定义术语和定义 方法标准方法标准(standard)：为实现特定检测目的，对所：为实现特定检测目的，对所采取的途径、步骤和手段的规定要求所做的统一认采取的途径、步骤和手段的规定要求所做的统一认定。它以科学、技术和实践经验的综合成果为基础，定。它以科
13、学、技术和实践经验的综合成果为基础，经有关方面协商一致，由主管机构批准，以特定形经有关方面协商一致，由主管机构批准，以特定形式发布，作为共同遵守的准则和依据。式发布，作为共同遵守的准则和依据。验证（验证（Verification）：通过提供客观证据对规定要：通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定。求已得到满足的认定。确认确认(Validation)：通过提供客观证据对特定的预期：通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定。用途或应用要求已得到满足的认定。2 术语和定义术语和定义 样品（样品（SampleSample）：）：取自某一整体的一个或多个部分，取自某一整体的一个或多
14、个部分，旨在提供该整体的相关信息，通常作为判断该整体旨在提供该整体的相关信息，通常作为判断该整体的基础。的基础。临界值（临界值（Cut-off valueCut-off value）：）：区分阴性和阳性结果区分阴性和阳性结果的试验数值，是连续的检测结果中间的一个值。的试验数值，是连续的检测结果中间的一个值。重复性（重复性（RepeatabilityRepeatability）：）：是指在相同的检测条是指在相同的检测条件下，对同一样品的同一目标分析值进行连续多次件下，对同一样品的同一目标分析值进行连续多次测量，所得结果之间的一致性。测量，所得结果之间的一致性。敏感性（敏感性（Sensitivit
15、ySensitivity）：）：指检出的阳性样本占被指检出的阳性样本占被检阳性样品总数的百分比。也就是指诊断检阳性样品总数的百分比。也就是指诊断/检测疾病检测疾病时不漏诊时不漏诊/不漏检（假阴性）的机会有多大（小）。不漏检（假阴性）的机会有多大（小）。2 术语和定义术语和定义 特异性（特异性（Specificity）：指检出的阴性样本占被检阴：指检出的阴性样本占被检阴性样品总数的百分比。也就是指诊断性样品总数的百分比。也就是指诊断/检测疾病时不误检测疾病时不误诊（假阳性）的机会有多大（小）诊（假阳性）的机会有多大（小）。线性范围（线性范围（Linear range）：）：检测结果或检测结果的检
16、测结果或检测结果的转换值和目标检测物的浓度呈线性关系的数值范围。转换值和目标检测物的浓度呈线性关系的数值范围。在线性范围内，检测结果准确度高在线性范围内，检测结果准确度高,重复性好重复性好,结论可结论可信度高。信度高。再现性（再现性（Reproducibility）：）：就是当一个方法被不就是当一个方法被不同实验室应用于同一样品的不同重复的检测时，能够同实验室应用于同一样品的不同重复的检测时，能够给出相同结果的能力。给出相同结果的能力。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 验证时应考虑所有影响方法标准和检测结果的因素。验证时应考虑所有影响方法标准和检测结果的因素。如果所制
17、修订的方法标准等同采用了知名的技术组如果所制修订的方法标准等同采用了知名的技术组织或刊物认可或发布的方法，或者是国际标准方法，织或刊物认可或发布的方法，或者是国际标准方法，在被证实适用于规定的检测在被证实适用于规定的检测/诊断目的之前，都应进诊断目的之前，都应进行验证。行验证。如果所制修订的方法标准采用的是非标准方法、实如果所制修订的方法标准采用的是非标准方法、实验室设计（制定）的方法、超出其预定范围使用的验室设计（制定）的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法，在被证实适标准方法、扩充和修改过的标准方法，在被证实适用于预期的检测用于预期的检测/诊断目的之前，应进行确认。诊
18、断目的之前，应进行确认。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 应记录验证活动所用的方法及获得的结果。应记录验证活动所用的方法及获得的结果。选择样品时，应注意的因素：质量和数量。选择样品时，应注意的因素：质量和数量。选择试剂时，应注意的因素：标准化，保质选择试剂时，应注意的因素：标准化，保质 方法标准的敏感性的验证：筛查方法要求敏方法标准的敏感性的验证：筛查方法要求敏感性必须高。感性必须高。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 方法标准特异性的验证方法标准特异性的验证：1 如果是用于确诊的，方法标准应具有足够的特异性，如果是用于确诊的，方法标准应具有足
19、够的特异性，以将检测中产生的交叉反应降到最低。以将检测中产生的交叉反应降到最低。2 样品应包括含有目标分析物的样品和含有目标分析样品应包括含有目标分析物的样品和含有目标分析物的相似物的样品。物的相似物的样品。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动重复性的验证重复性的验证1.重复性所选择的样品应该是在方法的线性范围内具重复性所选择的样品应该是在方法的线性范围内具有代表性的样品。所用样品数量与前述敏感性和特有代表性的样品。所用样品数量与前述敏感性和特异性验证试验所用数量相同。设定相同的程序、相异性验证试验所用数量相同。设定相同的程序、相同的操作人员、在相同的条件下使用相同的仪器
20、、同的操作人员、在相同的条件下使用相同的仪器、相同的地点在相同的地点在3个不同的日期进行，以保证所有的检个不同的日期进行，以保证所有的检测是独立的。测是独立的。2.重复性的变异不能超过重复性的变异不能超过30%。如果超过。如果超过30%，就需，就需要进行更多的初步研究，以证明该方法是足够稳定要进行更多的初步研究，以证明该方法是足够稳定的。的。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 线性范围线性范围 临界值（临界值（cut-off 值）值）方法标准间的比较和协调方法标准间的比较和协调 方法标准间比较是为了方法标准间比较是为了证明新方法是现有证明新方法是现有技术的提高技术的提高
21、；方法标准间比较包括对方法；方法标准间比较包括对方法的的工作特性工作特性（如敏感性和特异性）或对方（如敏感性和特异性）或对方法的法的操作特性操作特性（如成本、所需环境、时间（如成本、所需环境、时间周期、检测量等）进行比较。周期、检测量等）进行比较。Robustness、RuggednessRobustness measure of a tests capacity to remain unaffected by small changes or variation introduced in test conditions to mimic anticipated routine labora
22、tory operation,part of optimization studies and reflected in repeatability assessments(e.g.incubation times,reaction temperatures,buffer pH/ionic strength,reagent dilutions,sample condition and/or preparation,etc.).测试一种试验能够保持不受小的变化或在试验条测试一种试验能够保持不受小的变化或在试验条件下模仿预期的常规实验室操作产生的变化、优件下模仿预期的常规实验室操作产生的变化、优化
23、研究部分内容产生的变化、重复性评估（如孵化研究部分内容产生的变化、重复性评估（如孵育时间，反应温度，缓冲液育时间，反应温度，缓冲液pH/离子强度，试剂离子强度，试剂稀释，样本条件和稀释，样本条件和/或制剂等反映的影响）中产生或制剂等反映的影响）中产生的变化的影响的能力。的变化的影响的能力。Ruggedness A measure of an assays capacity to remain unaffected by substantial changes or substitutions in test conditions anticipated in multi-laboratory
24、utilization,part of fitness studies and reproducibility assessments(shipping conditions,technology transfer,reagents batches,equipment,testing platform and/or environments).一种试验能够在多个实验室间使用、部分适应性一种试验能够在多个实验室间使用、部分适应性研究、再现性评估（运输条件，技术转移，试剂研究、再现性评估（运输条件，技术转移，试剂批次，设备，测试平台和批次，设备，测试平台和/或环境）等预期的试验或环境）等预期的试验
25、条件下维持其不受较大变化或替代影响的能力。条件下维持其不受较大变化或替代影响的能力。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 再现性的验证再现性的验证对再现性的评估最少需在对再现性的评估最少需在标委会的标委会的三个实验室三个实验室（或（或3名名实验员）进行，应对相同的样品组使实验员）进行，应对相同的样品组使用相同的方法进行检测。用相同的方法进行检测。理想状态下，这些样品应该是来自于目标动物理想状态下，这些样品应该是来自于目标动物群的独立样品，代表群体中的目标检测物的活群的独立样品，代表群体中的目标检测物的活性范围。如果这样的样品不可获得，那么对已性范围。如果这样的样品不可获得
26、，那么对已知阳性样品进行系列稀释以达到需要的活性范知阳性样品进行系列稀释以达到需要的活性范围也是可以接受的。围也是可以接受的。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 再现性的验证再现性的验证验证再现性所用的样品，应逐个进行分装、编验证再现性所用的样品，应逐个进行分装、编码、分发、运输到参加实验室或分发给实验员，码、分发、运输到参加实验室或分发给实验员，在相同的条件下储存。在相同的条件下储存。对参加实验室（或实验员）的检测数据进行收对参加实验室（或实验员）的检测数据进行收集、评估。这些数据包括：实验室（或实验员）集、评估。这些数据包括：实验室（或实验员）间平均值、标准偏差、每
27、个样品和对照的变化间平均值、标准偏差、每个样品和对照的变化范围。范围。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 再现性的验证再现性的验证 进行再现性评估时，建议每个实验室（或每个进行再现性评估时，建议每个实验室（或每个实验员）将每个样品做两个或三个重复，以进实验员）将每个样品做两个或三个重复，以进一步评估方法在实验室内部的重复性。一步评估方法在实验室内部的重复性。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 再现性的验证再现性的验证 将两个实验室（或实验员）的平均值进行比较，如将两个实验室（或实验员）的平均值进行比较，如果果 =重复性标准偏差=再现性标准偏差 认
28、为两个实验室检测结果的平均值在统计学上没有显著差异。认为两个实验室检测结果的平均值在统计学上没有显著差异。3方法标准制修订人员的验证活动方法标准制修订人员的验证活动 方法的应用方法的应用 只有那些表现出能够适应检测目的的方法才可以被应只有那些表现出能够适应检测目的的方法才可以被应用到实际检测工作中。在应用过程中得到行业、国用到实际检测工作中。在应用过程中得到行业、国家、地区或国际认可的方法才能够上升为标准。家、地区或国际认可的方法才能够上升为标准。方法有效性的控制方法有效性的控制 内部质量控制、外部质量控制内部质量控制、外部质量控制 方法方法/标准的文件化标准的文件化 提交验证材料提交验证材料
29、 验证试验结束后，须整理好相应的试验记录、试验验证试验结束后，须整理好相应的试验记录、试验结果报告，与有关方法标准审定申请一并提交给动结果报告，与有关方法标准审定申请一并提交给动物检疫标准化专业委秘书处待审定。物检疫标准化专业委秘书处待审定。4 标委会的验证或标委会的验证或/和审定活动和审定活动 秘书处指定进行再现性试验的三个实验室（或秘书处指定进行再现性试验的三个实验室（或3名实验员）名实验员）。秘书处指定不少于秘书处指定不少于3名专家对标准制名专家对标准制/修订人提交修订人提交的方法标准送审材料进行技术审定。的方法标准送审材料进行技术审定。有三分之二的审定专家认为需要进行再验证的，有三分之二的审定专家认为需要进行再验证的，标准制修订人须对拟审定的方法标准进行再验证。标准制修订人须对拟审定的方法标准进行再验证。验证结果符合要求的，经认监委标准化部批准后，验证结果符合要求的，经认监委标准化部批准后，才可参加出入境检验检疫动物检疫标准化专业委才可参加出入境检验检疫动物检疫标准化专业委组织的会议审定。组织的会议审定。
