1、专题专题5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术 课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 栏栏目目链链 接接 栏栏目目链链 接接蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作取、
2、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作 栏栏目目链链 接接请思考：请思考：1怎样从血细胞中提取血红蛋白呢？怎样从血细胞中提取血红蛋白呢？2用猪血和鸡血提取血红蛋白，效果一样吗？用猪血和鸡血提取血红蛋白，效果一样吗？栏栏目目链链 接接 栏栏目目链链 接接一、凝胶色谱法一、凝胶色谱法血红蛋白的分离方法血红蛋白的分离方法 1 概念概念 _ 凝胶色谱法凝胶色谱法 是根据是根据 _ 相对分子质量的大小相对分子质量的大小 分离蛋白质的分离蛋白质的有效方法，也称作分配色谱法。有效方法，也称作分配色谱法。2 原理原理?形态：微小的形态：微小的 多孔球体多孔球体 (1)凝胶凝胶?组成：大多数由组成：大
3、多数由 多糖类化合物多糖类化合物 构成构成?结构：内部有许多结构：内部有许多 贯穿的通道贯穿的通道 栏栏目目链链 接接(2)分离原理：分离原理：相对分子质量较小的蛋白质：容易进入相对分子质量较小的蛋白质：容易进入_ 的通的通 凝胶内部凝胶内部 较长较长 _。相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内部的通相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内部的通 较长较长 ，移移动动速速度度较较慢慢，通通过过凝凝胶胶柱柱的的时时间间道道，路路程程_栏栏目目链链接接 较短较短 ，移动速度较快，通，移动速度较快，通道，只能在凝胶外部移动，路程道，只能在凝胶外部移动，路程_ 较短较短 。过凝胶柱的时间过凝胶柱的时
4、间_二、缓冲溶液二、缓冲溶液 1 作用作用 外界的酸和碱外界的酸和碱 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制在一定范围内，缓冲溶液能够抵制_对溶对溶液液pH的影响，维持的影响，维持pH基本不变。基本不变。2配制配制 通常由通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的的_ 使用比例使用比例 就可以制得在就可以制得在 不同不同pH范围内使用范围内使用 _的缓冲液。的缓冲液。栏栏目目链链接接 三、电泳三、电泳血红蛋白的分离或鉴定方法血红蛋白的分离或鉴定方法 1 概念概念 电场电场 迁移迁移 的过程。的过程。带电粒子在带电粒子在_的作用下发生的作用下发生_2原理原理
5、 栏栏目目链链 (1)许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有接接 可解离的基团可解离的基团 ，在在 一一 定定 的的pH下下，这这 些些 基基 团团 会会 正电正电 _带带 上上 负电负电或或 _ _。(2)在在 电电 场场 的的 作作 用用 下下，这这 些些 带带 电电 分分 子子 会会 向向 着着 与其所带电荷相反的电极与其所带电荷相反的电极 移动。移动。_ 目目 大小大小 、_ 形状形状 以及分子本身的以及分子本身的_的不同，使带电分子产生的不同，使带电分子产生链链接接 带电性质的差异带电性质的差异 栏栏(3)电泳利用了待分离样品中各种分子电
6、泳利用了待分离样品中各种分子_ 迁移速度迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。，从而实现样品中各种分子的分离。不同的不同的_四、蛋白质的提取和分离过程四、蛋白质的提取和分离过程 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理_ 、粗分、粗分离、离、_ 纯化纯化 和纯度鉴定。和纯度鉴定。栏栏目目链链 接接 栏栏目目链链 接接一、血红蛋白的提取和分离的原理一、血红蛋白的提取和分离的原理 1蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析 相对分子质量大相对分子质量大 相对分子质量小相对分子质量小 直径大小直径大小 大于凝胶颗粒空隙直大于凝胶颗粒
7、空隙直小于凝胶颗粒空隙直小于凝胶颗粒空隙直径径 径径 运动方式运动方式 垂直向下运动垂直向下运动 无规则的扩散运动无规则的扩散运动 运动速度运动速度 较快较快 较慢较慢 运动路程运动路程 较短较短 较长较长 洗脱顺序洗脱顺序 先从凝胶柱中洗脱出先从凝胶柱中洗脱出后从凝胶柱中洗脱出后从凝胶柱中洗脱出来来 来来 栏栏目目链链 接接2.电泳原理及方法电泳原理及方法 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的都具
8、有可解离基团，它们在某个特定的pH中会带上正电或负中会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。品进行分离、鉴定或提纯的目的。栏栏目目链链 接接琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺
9、凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 在凝胶中加入在凝胶中加入SDS，使蛋白，使蛋白由于琼脂糖本身不带电荷，由于琼脂糖本身不带电荷，质解聚成单链，与各种蛋白质解聚成单链，与各种蛋白各种分子在电场中迁移速度各种分子在电场中迁移速度质形成蛋白质质形成蛋白质SDS复合物，复合物，决定于所带电荷性质的差异决定于所带电荷性质的差异使其迁移速度完全取决于分使其迁移速度完全取决于分及分子的大小、形状的不同及分子的大小、形状的不同 子的大小子的大小 栏栏目目链链接接 例例1关于电泳的说法不正确的是关于电泳的说法不正确的是()A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程程 B带
10、电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少带净电荷的多少 D用用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小移率完全取决于分子的大小 栏栏目目链链 接接解析：解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白能与各种蛋白质形成蛋白质质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所带负
11、电荷的量大大超过了所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。答案：答案：C 栏栏目目链链 接接1凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须分子之间必须()A具有相同的相对分子质量具有相同的相对分子质量 B相对分子质量不同，但都是相对分子量较大的分子相对分子质量不同，但
12、都是相对分子量较大的分子 C相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子子 D具有相对分子质量不同的蛋白质具有相对分子质量不同的蛋白质 栏栏目目链链 接接变式变式 训练训练 解析：解析：若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙不同的：分子较大的只能进入孔
13、径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大欠肿咏洗蟮南韧欠肿咏洗蟮南韧，这样，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队排队”，凝，凝胶表现出分子筛效应。胶表现出分子筛效应。答案：答案：D 栏栏目目链链 接接变式变式 训练训练 二、血红蛋白的提取和分离的实验操作二、血红蛋白的提取和分离的实验操作 1样品处理样品处理(1)红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋
14、白。采红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体栏栏目目链链接接 分离的效果。分离的效果。(2)血红蛋白的释放：红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破血红蛋白的释放：红细胞
15、在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看栏栏到试管中的溶液的分层情况：第到试管中的溶液的分层情况：第 3层的红色透明液体是血红蛋层的红色透明液体是血红蛋目目链链白的水溶液。白的水溶液。接接(4)透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质。透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质。2凝胶色谱操作凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦
16、发现存凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存在气泡，必须重装。在气泡，必须重装。栏栏目目链链接接 装填完后，立即用装填完后，立即用300 mL 20 mmol/L磷酸缓冲液充分磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。(2)样品的加入和洗脱：样品的加入和洗脱：加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。按正确方法加样，不能破坏凝胶面。按正确方法加样，不能破坏凝胶面。进行洗脱时，等红色蛋白质接近色谱柱底端时，采用进行洗脱时，等
17、红色蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。试管收集。栏栏目目链链接接例例2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是的作用是()A增大蛋白质的相对分子质量增大蛋白质的相对分子质量B改变蛋白质分子的形状改变蛋白质分子的形状C掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别D减少蛋白质分子的相对分子质量减少蛋白质分子的相对分子质量 栏栏目目链链 接接解析：解析：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子
18、的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂SDS后，分子后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白结合成蛋白栏栏目目SDS复合物，复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有链链接接的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。率完全取决于分子的大小。答案：答案：C 变变 式式 训训 练练 2下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是下列对凝胶电泳的相关认识，错误的是()A蛋白质
19、在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只取决于分子的大小分子的大小 B蛋白质在蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小取决于分子的大小 CSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅用于蛋白质相对分子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离子质量的测定，还可用于蛋白质混合组分的分离 D凝胶中加入凝胶中加入SDS可以消除净电荷对迁移率的影响可以消除净电荷对迁移率的影响 栏栏目目链链 接接变变 式式 训训 练练 解析：解析：电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品电泳技术就是在电场的作
20、用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，而使带电分子产生不同的迁移速度，而SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然 栏栏目目链链 接接蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的高低。高低。答案：答案：A 栏栏目目链链 接接变变 式式 训训 练练
