1、 第三讲第三讲 分子生态学实验方法与技术分子生态学实验方法与技术 分子生态学是上世纪分子生态学是上世纪90年代初新兴的一门生态学分年代初新兴的一门生态学分支学科，应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统支学科，应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学，与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学，阐明自然种群和引进种群与环境之间的联系，评价重组阐明自然种群和引进种群与环境之间的联系，评价重组生物体释放对环境的影响（生物体释放对环境的影响（Smith,1993)。分子生态学主要研究内容：物种起源与进化、转基分子生态学主要研究内容：物种起源与进化、转
2、基因生物的生态学效应评估、濒危物种的保护、有害动物因生物的生态学效应评估、濒危物种的保护、有害动物的控制、医学方面的应用等。的控制、医学方面的应用等。分子生态学的研究方法分子生态学的研究方法 主要包括两大类：主要包括两大类：基于基于DNA层次层次的研究方法和基于的研究方法和基于蛋白质层次蛋白质层次的研究方的研究方法。法。DNA层次的主要研究对象是线粒体层次的主要研究对象是线粒体DNA、叶绿体、叶绿体DNA、核糖体、核糖体DNA、基因组、基因组DNA；蛋白质层次的研究多采用多位点等位酶技术。蛋白质层次的研究多采用多位点等位酶技术。分子标记的种类与历史分子标记的种类与历史蛋白质：同工酶蛋白质：同工
3、酶(等位酶等位酶)：六：六十年代以来十年代以来核苷酸序列和片段核苷酸序列和片段：tRNA（1965）1980年以来：年以来：RFLP(限制性片段长度多态）限制性片段长度多态）1984年以来：年以来：SSR(短重复序列标记短重复序列标记)1990年以来：年以来：RAPD(随机扩增长度多态随机扩增长度多态)1993年以来：年以来：AFLP(扩增片段长度多态扩增片段长度多态)一一 等位酶技术等位酶技术 酶是基因编码的产物，在电场中迁移率的改变可反酶是基因编码的产物，在电场中迁移率的改变可反映酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编映酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编码码DNA 顺序
4、上的变化，通过分析酶谱的变化可获得所需顺序上的变化，通过分析酶谱的变化可获得所需的遗传信息。的遗传信息。在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。等位酶是同一基因位点的不同等位基因所编码的同等位酶是同一基因位点的不同等位基因所编码的同一种酶的不同形式，等位酶作为基因表达的产物间接反一种酶的不同形式，等位酶作为基因表达的产物间接反映酶基因位点及等位基因的变化，是衡量遗传变异的重映酶基因位点及等位基因的变化，是衡量遗传变异的重要遗传标记。要遗传标记。在种内水平上，在种内水平上，等位酶可作为一种稳定的遗传标等位酶可作为一种稳定的遗传标记。根据等位酶谱带的遗传分析确定
5、出每种等位基因记。根据等位酶谱带的遗传分析确定出每种等位基因在居群中的频率，从而计算出它们的在居群中的频率，从而计算出它们的遗传相似度或遗遗传相似度或遗传距离传距离，对种群的遗传学结构做出估计，对种群的遗传学结构做出估计，测量种群的测量种群的遗传多样性以及各种群间的遗传距离。遗传多样性以及各种群间的遗传距离。等位酶技术主要应用于居群的遗传结构及其时空等位酶技术主要应用于居群的遗传结构及其时空变化、居群分化和物种形成、种间关系、遗传育种、变化、居群分化和物种形成、种间关系、遗传育种、生物多样性、推断杂种或多倍体的亲本、生物多样性、推断杂种或多倍体的亲本、类群间的亲类群间的亲缘性等领域。缘性等领域
6、。等位酶技术等位酶技术优点：优点：操作相对简单，花费少，统计方法标准，并且有大量的操作相对简单，花费少，统计方法标准，并且有大量的前人资料可以借鉴。前人资料可以借鉴。缺点：缺点：但对一些狭域分布的地方种群，往往缺乏多态性的位但对一些狭域分布的地方种群，往往缺乏多态性的位点，无法进行等位酶分析（至少需分析点，无法进行等位酶分析（至少需分析10-20个独立分离的个独立分离的多态性位点，才能达到统计的可信度多态性位点，才能达到统计的可信度)。另外分析时一定要。另外分析时一定要保持酶的活性。保持酶的活性。材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的保存凝胶制备凝胶制备电泳电泳凝胶切片凝
7、胶切片酶的组织化学染色酶的组织化学染色酶谱的记录与分析酶谱的记录与分析数据分析数据分析等位酶分析的过程等位酶分析的过程1材料采集和提取液的选择材料采集和提取液的选择 植物体任何有活性的部位都可用来进行等位酶分析，植物体任何有活性的部位都可用来进行等位酶分析，因幼嫩组织酶活性最高，故一般采集幼嫩叶片进行实验。因幼嫩组织酶活性最高，故一般采集幼嫩叶片进行实验。进行等位酶分析首先要把有功能的可溶性酶蛋白质从植进行等位酶分析首先要把有功能的可溶性酶蛋白质从植物细胞中提取出来，物细胞中提取出来，并保证这些酶的活性。并保证这些酶的活性。常用提取液：常用提取液：简单磷酸提取缓冲液简单磷酸提取缓冲液和和复杂磷
8、酸提取缓冲液复杂磷酸提取缓冲液。多数栽培植物和花粉可用简单缓冲液提取，而大多数野多数栽培植物和花粉可用简单缓冲液提取，而大多数野生植物由于含有较多酚类等有害于酶蛋白质的物质，生植物由于含有较多酚类等有害于酶蛋白质的物质，一般一般用复杂提取缓冲液。其中，用复杂提取缓冲液。其中，Tris-HCl 提取缓冲液最常用提取缓冲液最常用。当研磨植物样品材料时，细胞结构被破坏，许多影响酶活性的干当研磨植物样品材料时，细胞结构被破坏，许多影响酶活性的干扰物质，如酚类、萜类、果胶、树脂、香豆素和一些色素等释放出来扰物质，如酚类、萜类、果胶、树脂、香豆素和一些色素等释放出来，与酶相互作用，导致酶失活。，与酶相互作
9、用，导致酶失活。因此在提取液中必须添加提取缓冲液因此在提取液中必须添加提取缓冲液(简称提取液简称提取液)，防止酶在提取过程中被破坏。，防止酶在提取过程中被破坏。其中，酚类物质的影响最大。酚类易被氧化成醌类，与蛋白质的其中，酚类物质的影响最大。酚类易被氧化成醌类，与蛋白质的硫氢基硫氢基(-SH)反应，发生褐变，此为提取样品时酶失活的一个标志。反应，发生褐变，此为提取样品时酶失活的一个标志。添加的保护物质多用来消除酚类物质对酶的破坏作用，一般用添加的保护物质多用来消除酚类物质对酶的破坏作用，一般用竞竞争性抑制剂争性抑制剂，如，如PVP、二硫苏糖醇、抗坏血酸钠、二硫苏糖醇、抗坏血酸钠(Vc钠盐钠盐)
10、和和-巯基乙巯基乙醇等，或抑制酚氧化酶活性的物质，如偏重亚硫酸钠和四硼酸钠等，醇等，或抑制酚氧化酶活性的物质，如偏重亚硫酸钠和四硼酸钠等，可抑制或逆转酚氧化成醌。另外，二乙基二硫代氨基甲酸可通过作用可抑制或逆转酚氧化成醌。另外，二乙基二硫代氨基甲酸可通过作用于含铜活性中心抑制酚氧化酶。于含铜活性中心抑制酚氧化酶。注意注意：并不是各种添加剂对酶都是有益的。如：并不是各种添加剂对酶都是有益的。如：二乙基二硫代氨基甲酸影响二乙基二硫代氨基甲酸影响SOD的铜的铜-锌辅酶，锌辅酶，偏重亚硫酸钠抑制某些脱氢酶系统，偏重亚硫酸钠抑制某些脱氢酶系统，PVP可能抑制谷氨酰胺合成酶可能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)。
11、因此，确定合适的保护物质时，最好先进行预备实验。因此，确定合适的保护物质时，最好先进行预备实验。如果材料宝贵又缺乏经验，使用复杂提取液比较保险。但如果材料宝贵又缺乏经验，使用复杂提取液比较保险。但如果材料所含干扰物质少，应尽量选用简单提取液，防止提取如果材料所含干扰物质少，应尽量选用简单提取液，防止提取液抑制酶的活性。液抑制酶的活性。复杂提取缓冲液以复杂提取缓冲液以Tris-HCl 提取缓冲液最常用提取缓冲液最常用，配方如下：，配方如下：0.01g 乙二胺四乙酸四钠盐乙二胺四乙酸四钠盐(EDTANa4)0.019g 氯化钾氯化钾(KCl)0.05g 氯化镁氯化镁(MgCl26H2O)15g 聚
12、乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.25 g 蔗糖蔗糖 25.00mL Tris-HCl 缓冲液缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.5)把把PVP 放入溶液搅拌溶解，放入溶液搅拌溶解，或者水合过夜。或者水合过夜。放入冰箱放入冰箱保存。使用前按保存。使用前按1-2%（v/v）加入加入2-巯基乙醇。巯基乙醇。2酶系统的选择酶系统的选择 酶系统的选择：酶系统的选择：对酶谱作正确的分析，必须了解该酶蛋白分对酶谱作正确的分析，必须了解该酶蛋白分子的四级结构。子的四级结构。对于酶分子结构清楚的电泳图谱，一般可以结合染色体的倍对于酶分子结构清楚的电泳图谱，一般可以结合染色体的倍性水平可靠地判定位点和等
13、位基因。许多种酶分子的亚基数目已性水平可靠地判定位点和等位基因。许多种酶分子的亚基数目已基本上清楚，而且在不同的类群中保持恒定。在选择酶系统时应基本上清楚，而且在不同的类群中保持恒定。在选择酶系统时应优先考虑植物系统学研究常选用的酶系统，这些酶的结构基本清优先考虑植物系统学研究常选用的酶系统，这些酶的结构基本清楚。楚。有些酶有些酶(如如ACP、EST、PER等等)的结构尚不清楚。这些酶系的结构尚不清楚。这些酶系统的位点数目很多，酶谱相当复杂，酶谱的解释如无可靠的遗传统的位点数目很多，酶谱相当复杂，酶谱的解释如无可靠的遗传分析为基础，会产生多种可能的解释，其结果往往不可靠。分析为基础，会产生多种
14、可能的解释，其结果往往不可靠。3 电泳胶的制备电泳胶的制备 酶电泳的介质有多种，最常用：酶电泳的介质有多种，最常用：淀粉凝胶淀粉凝胶和和聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶。与聚丙烯酰胺比较，淀粉无毒，且显色效果和聚丙烯酰胺胶与聚丙烯酰胺比较，淀粉无毒，且显色效果和聚丙烯酰胺胶显色效果差不多。显色效果差不多。1）制备淀粉胶）制备淀粉胶 淀粉胶通常用煮沸水解淀粉和相应的缓冲液的混合物配制。淀粉胶通常用煮沸水解淀粉和相应的缓冲液的混合物配制。电泳缓冲系统包括两种缓冲溶液：电泳缓冲系统包括两种缓冲溶液：胶缓冲液胶缓冲液:用于胶的制备；用于胶的制备；电极缓冲液电极缓冲液:在电泳迁移的时候用来连接电极和胶。在电
15、泳迁移的时候用来连接电极和胶。制胶程序：制胶程序：1、在三角烧瓶里放入在三角烧瓶里放入 48g 水解淀粉和水解淀粉和 400ml 胶缓冲液，胶缓冲液，用保鲜膜盖住瓶口。用微波炉加热混合物，每间隔用保鲜膜盖住瓶口。用微波炉加热混合物，每间隔1020 秒摇一下，以防结块。胶粘稠之后，再继续煮会变得透明秒摇一下，以防结块。胶粘稠之后，再继续煮会变得透明、均一。连续煮开两次。、均一。连续煮开两次。2、接上真空泵抽气约接上真空泵抽气约20 秒。待胶稍冷后，将胶倒在调好秒。待胶稍冷后，将胶倒在调好水平的玻璃板上的框子里。约水平的玻璃板上的框子里。约30 分钟后胶冷却，即成淀粉分钟后胶冷却，即成淀粉胶。胶。
16、制好的胶若当时不用，最好用塑料保鲜膜将它覆盖起制好的胶若当时不用，最好用塑料保鲜膜将它覆盖起来，以防止水分蒸发后胶干裂。否则，蛋白在电泳迁移过来，以防止水分蒸发后胶干裂。否则，蛋白在电泳迁移过程中会产生变形。程中会产生变形。4 缓冲液系统的选择缓冲液系统的选择缓冲液系统的选择是等位酶电泳分析中的重要一缓冲液系统的选择是等位酶电泳分析中的重要一环。因为不同的酶蛋白的分子结构和电荷不同，使用环。因为不同的酶蛋白的分子结构和电荷不同，使用不同的缓冲液分离效果也不一样。不同的缓冲液分离效果也不一样。目前，用于淀粉凝胶电泳的缓冲液系统很多，常用目前，用于淀粉凝胶电泳的缓冲液系统很多，常用以下几种：以下几
17、种：TC(Tris-Citrate)缓冲液、缓冲液、TBE(Tris-Borate-EDTA)缓冲液缓冲液、TBE(Tris-Borate-NaEDTA)缓冲液、缓冲液、Borate-NaOH缓冲液缓冲液.TC(Tris-Citrate)缓冲液缓冲液：pH 值值7.0，适用于，适用于LDH，MDH，ME，IDH，EsD，6PGD，ACO，ADA，HBDH，HK，ACP，AK，CK，PER，GOT，PGM，ALD，CEs，GPI，SUDH，SOD等酶。等酶。电泳条件：恒流电泳条件：恒流3540mA，34 小时。小时。电极缓冲液：电极缓冲液：Tris（三羟甲基氨基甲烷）（三羟甲基氨基甲烷）16.3
18、5g+Citric acid（柠檬酸）（柠檬酸）9.04g加蒸馏水至加蒸馏水至 1 000ml，用，用 Tris 或柠檬酸调或柠檬酸调 pH 值至值至 7.0胶缓冲液：胶缓冲液：稀释稀释 66.7ml 电极缓冲液至电极缓冲液至 1 000mlTBE(Tris-Borate-EDTA)缓冲液缓冲液，pH 值值8.6,适用于适用于CAR，CAT，Dia，FK，GDA，GLO等酶。等酶。电泳条件：恒流电泳条件：恒流60mA，5 小时小时贮存液：贮存液：0.9moldm3Tris 109g0.5moldm3Boricacid（硼酸）（硼酸）30g0.02moldm3 EDTA（乙二胺四乙酸）（乙二胺四
19、乙酸）7.6g加蒸馏水至加蒸馏水至 1 000ml电极缓冲液：电极缓冲液：pH 值值8.61:4 稀释贮存液（用稀释贮存液（用3 次）次）用用 1moldm3 Tris 或或 1moldm3 硼酸调硼酸调 pH 值至值至 8.6胶缓冲液：胶缓冲液：pH 值值8.61:39 稀释贮存液稀释贮存液用用 1moldm3Tris 或或 1moldm3 硼酸调硼酸调 pH 值至值至 8.6III.TBE(Tris-Borate-NaEDTA)缓冲液缓冲液:pH 值值 8.0,适用于适用于 G6PD，NP，PK，ADH，GAPD，GPD，GLC，GLD，XDH，FUM，PEP-B，PEP-A等酶。等酶。电
20、泳条件：恒压电泳条件：恒压250V，3 小时小时电极缓冲液：电极缓冲液：Tris 60.6g+硼酸硼酸 40g+NaEDTA 6g加蒸馏水至加蒸馏水至 1 000ml，pH 值值8.0胶缓冲液：胶缓冲液：Tris 6.06g+硼酸硼酸 6g+NaEDTA 0.6g加蒸馏水至加蒸馏水至 1 000ml，pH 值值 8.0Borate-NaOH缓冲液缓冲液:pH 值 8.7,适用于适用于 Tf，AIB，ALP(AKP)，Sa，PA，Es电泳条件：恒压电泳条件：恒压250V，4 小时小时电极缓冲液：电极缓冲液：pH 值值870.3mol/dm 硼酸硼酸 18.6g0.005mol/dm NaOH 2
21、4g加水至加水至 1 000ml，用，用 NaOH 调调pH 值至值至 87胶缓冲液：胶缓冲液：pH 值值7.5Tris 9.4g柠檬酸柠檬酸 1.05g硼酸硼酸 2g加水至加水至 1 000ml，调，调pH 值至值至 7.5 缓冲条件的选择对电泳的效果有较大的影响，其中缓冲条件的选择对电泳的效果有较大的影响，其中pH 值与值与离子强度是两个重要因素。只有离子强度是两个重要因素。只有pH 值和离子强度条件选择合适值和离子强度条件选择合适，才能既得到较好的分辨率又不降低酶的活性。，才能既得到较好的分辨率又不降低酶的活性。pH 值值 提高缓冲系统的提高缓冲系统的pH 值，可加快电泳速度，使凝胶的值
22、，可加快电泳速度，使凝胶的pH 值值与电极缓冲液的与电极缓冲液的pH 值之间有一定差距，使电泳时跑在后面的蛋值之间有一定差距，使电泳时跑在后面的蛋白质分子因电泳基质环境的白质分子因电泳基质环境的pH 值先降低而前进速度减慢，而在值先降低而前进速度减慢，而在前面的蛋白质分子仍以高速前进，从而拉开距离以提高分辨率。前面的蛋白质分子仍以高速前进，从而拉开距离以提高分辨率。离子强度离子强度 增加离子强度，会使酶蛋白离子因吸引缓冲液中电荷相反的增加离子强度，会使酶蛋白离子因吸引缓冲液中电荷相反的离子而降低泳动速度，形成较窄的条带，有利于提高分辨率；反离子而降低泳动速度，形成较窄的条带，有利于提高分辨率；
23、反之，则泳动速率快，分辨率不高。之，则泳动速率快，分辨率不高。5 染色方法的选择染色方法的选择 酶的染色原理基于酶的组织化学法，常用酶的染色原理基于酶的组织化学法，常用液染液染和和胶染胶染两种方两种方法。常用染料为噻唑蓝法。常用染料为噻唑蓝(MTT 1%)或吩嗪钾硫酸或吩嗪钾硫酸(PMS 1%)。液染是传统的染色方法，将胶浸泡在配制好的染液中。这种液染是传统的染色方法，将胶浸泡在配制好的染液中。这种染色方法使凝胶与染液充分接触，染色效果好，但药品用量大。染色方法使凝胶与染液充分接触，染色效果好，但药品用量大。胶染是在少量染液中加入受热溶解的琼脂或琼脂糖溶液，混胶染是在少量染液中加入受热溶解的琼
24、脂或琼脂糖溶液，混匀后将混合液平铺并固定在淀粉凝胶的表面，从而大大节省了化匀后将混合液平铺并固定在淀粉凝胶的表面，从而大大节省了化学药品的用量学药品的用量(常为液染的三分之一常为液染的三分之一)，且铺盖的热染液有利于加，且铺盖的热染液有利于加快酶的反应。胶染时，使用琼脂较好，因为琼脂价格便宜，谱带快酶的反应。胶染时，使用琼脂较好，因为琼脂价格便宜，谱带不易扩散，反应速度和酶的活性也没有明显的降低。不易扩散，反应速度和酶的活性也没有明显的降低。电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽6 电泳电泳7 酶谱分析酶谱分析 等位酶分析的关键是通过对电泳后所获得的酶谱等位酶分析的关键是通过对电泳后所获得的酶谱的分析来推断
25、和确定基因位点和等位基因。的分析来推断和确定基因位点和等位基因。酶谱照片酶谱照片二二 DNA分析技术分析技术特点：特点：具有更丰富的变异，多态性高，且所需材料少，具有更丰富的变异，多态性高，且所需材料少，在生物体的在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，但但取材时需严格控制取材时需严格控制DNA的污染，否则分析结果误差较大。的污染，否则分析结果误差较大。基本过程包括：基本过程包括：DNA提取、限制性酶切、提取、限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、基因文库构扩增、分子杂交、基因文库构建、建、DNA测序或指纹谱带测定。测序
26、或指纹谱带测定。RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、AFLP(Amplified fragment length polymorphisms)、SSR(Simple sequence repeats)、STS(Sequenc-tagged Site序列位点标记序列位点标记)、SNP(Single Nucleotide Polymorphism单核苷酸多态性单核苷酸多态性)、GISH(Genomic in situ hybridization-基因组原位杂交
27、基因组原位杂交)、mRNA DD(mRNA Differential Display-mRNA差别显示差别显示)、SSH(Suppression Subtraction Hybridization-抑制差减杂交抑制差减杂交)、AP-PCR(Arbitray-primer PCR任意引物任意引物PCR)、DAF(DNA amplified fingprintingDNA扩增指纹扩增指纹)、SPARs(Single primer amplification reactions)、AMO(Anchored Microsatellite Oligonucleotides-加锚微卫星寡核苷酸）加锚微卫星
28、寡核苷酸）目前，常用分子标记技术包括目前，常用分子标记技术包括:1 DNA的提取的提取 1)核酸的理化性质核酸的理化性质 A.DNA为白色类似石棉样的纤维状物，为白色类似石棉样的纤维状物，RNA纯品呈白色粉末纯品呈白色粉末或结晶。或结晶。B.DNA、RNA一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，在酸性溶液中，它们的钠盐比游离酸易溶于水，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。C.天然状态的天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细
29、胞形式存在于细胞核中。从细胞中提取核中。从细胞中提取DNA 时，先把时，先把DNP抽提出来，除去蛋抽提出来，除去蛋白白，再除去细胞中的糖、，再除去细胞中的糖、RNA 及无机离子等，分离及无机离子等，分离DNA。DNA的变性与复性的变性与复性 DNA变性：在某些理化因素作用下，变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之分子互补碱基对之间的氢键断裂，使间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。监测指双螺旋结构松散，变成单链。监测指标为标为A260增加，并与解链程度有一定的关系。增加，并与解链程度有一定的关系。常用的变性方法为加热。常用的变性方法为加热。解链温度：解链温度：DNA变性从
30、开始到完全解链是在一个相当窄的范围变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围内完成内完成 的。这一范围内的。这一范围内A260达到最大值的达到最大值的50%时的温度称为解时的温度称为解链温度，又称为融解温度（链温度，又称为融解温度（melting temperature，Tm）。）。复性复性:变性变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，称为复性。热变性双螺旋构象，称为复性。热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，也称为退火（也称为退火（annealing）。）。DNA复性速度受温度的影响，复性时温度缓慢下降才可使其复性
31、速度受温度的影响，复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性；如加热后将其迅速冷却至重新配对复性；如加热后将其迅速冷却至4 以下，则不可能以下，则不可能发生复性。发生复性。2)材料的选择与提取方法材料的选择与提取方法*DNA分子在生物体内的分布及含量不同。一般来说植物种子分子在生物体内的分布及含量不同。一般来说植物种子的胚的胚DNA含量丰富。也可选用幼嫩的叶片进行提取。含量丰富。也可选用幼嫩的叶片进行提取。*不同材料提取不同材料提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。方法不同，分离提取的难易程度也不同。*DNA 分子量较小的低等生物的分子量较小的低等生物的DNA提取比较容易，提取时易提取比较
32、容易，提取时易保持其结构完整性。保持其结构完整性。*从高等动植物中提取从高等动植物中提取DNA难度大一些。其难度大一些。其DNA 分子量较大，分子量较大，因此易被机械张力剪断。细菌的因此易被机械张力剪断。细菌的DNA，除核，除核DNA 外，还有质外，还有质粒粒DNA 等。等。高等动植物高等动植物DNA 主要存在于细胞核与线粒体和叶绿体主要存在于细胞核与线粒体和叶绿体中，在提取时有两个困难：中，在提取时有两个困难：破碎细胞难；从处死动物、分离组织器宫到破碎细胞破碎细胞难；从处死动物、分离组织器宫到破碎细胞费时长，在此时期间费时长，在此时期间DNA 可能会被可能会被DNase降解，而动物组降解，而
33、动物组织，特别是肌肉组织很难破碎，即使是较易破碎的肝、肾等织，特别是肌肉组织很难破碎，即使是较易破碎的肝、肾等组织也往往因使用组织匀浆器，易造成组织也往往因使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。断裂。分子量大：一般比细菌的大分子量大：一般比细菌的大23个数量级，比病毒的个数量级，比病毒的大大45个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。的分离提取方法。3)DNA提取方法提取方法(1)浓盐法浓盐法 DNP在在1M NaCL溶液中溶解度较大，而在溶液中溶解度较大，而在0.15 mol/L NaCl溶液中溶解度很低溶液中溶解度很低(几乎
34、不溶几乎不溶)；但；但 RNP的溶解度受盐的溶解度受盐浓度影响较小，在浓度影响较小，在0.15mol/L NaCl溶液中溶解度仍较大，溶液中溶解度仍较大，故可利用故可利用0.15 M NaCL液反复洗涤细胞破碎液除去液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以再以1M NaCL提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿-异戊醇法除异戊醇法除去蛋白。去蛋白。提取提取DNA 时，加入适量去污剂，如时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白可有助于蛋白质与质与DNA 的分离。的分离。（2）阴离子去污剂法）阴离子去污剂法:细胞中细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离与蛋白质之间常借静电
35、引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用子去污剂能够破坏这种价键，所以常用SDS或二甲苯酸钠等去污或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。（3）苯酚抽提法）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键断裂，蛋白分子表面联结键断裂，蛋白分子表面含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，
36、多次重复操作，再合并含溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。DNA呈十分粘稠状，可用玻璃慢慢绕成一团取出。此法的呈十分粘稠状，可用玻璃慢慢绕成一团取出。此法的特点是使提取的特点是使提取的DNA保持天然状态。保持天然状态。好的好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得）所得DNA纯度应满足下游操作要求：用于纯度应满足下游操作要求：用于RFLP分析的分析的DNA，其纯度要求可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到，其纯度要求可用限制性内切酶完全
37、酶解并可成功地转移到膜上进行膜上进行Southern杂交；用于杂交；用于PCR分析的分析的DNA则不应含干扰则不应含干扰PCR反应的污染物。反应的污染物。（2）所得）所得DNA应当完整，电泳检查时可出现精确性高、重复性应当完整，电泳检查时可出现精确性高、重复性好的迁移带型。好的迁移带型。（3）所得的）所得的DNA应有足够的量。如研究多个遗传标记在某一植应有足够的量。如研究多个遗传标记在某一植物居群中的分离情况，要求单株植物中提取的物居群中的分离情况，要求单株植物中提取的DNA可作可作100次分析；而从大量植株中筛选一个单一遗传标记时，只需在次分析；而从大量植株中筛选一个单一遗传标记时，只需在一
38、个一个Eppendorf管中微量提取得到的管中微量提取得到的DNA就足够。就足够。如果进行大规模筛选，操作程序还应当快速、简便、价格低如果进行大规模筛选，操作程序还应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。廉，并尽可能避免使用有毒试剂。在野外时，常常采用脱水处理来保存植物材料的在野外时，常常采用脱水处理来保存植物材料的DNA。最常用的是用硅胶快速干燥保存样品，并且干燥后的组。最常用的是用硅胶快速干燥保存样品，并且干燥后的组织很容易研磨成粉。织很容易研磨成粉。植物材料中，特别是老的或是经逆境处理的材料，含植物材料中，特别是老的或是经逆境处理的材料，含有大量的酚类化合物，这些酚类化合物氧
39、化后易与有大量的酚类化合物，这些酚类化合物氧化后易与DNA共共价结合，使价结合，使DNA带棕色或褐色，并能抑制带棕色或褐色，并能抑制DNA的酶解反应的酶解反应。为防止这类情况出现，可以向提取缓冲液中加入。为防止这类情况出现，可以向提取缓冲液中加入2%（W/V）的聚乙烯吡咯烷酮（）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或抽提缓冲液中的巯基）或抽提缓冲液中的巯基乙醇的浓度可以提高到乙醇的浓度可以提高到25%。4)实验室常用实验室常用DNA提取方法提取方法（1）CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法（十六烷基三乙基溴化铵）法 CTAB可以溶解细胞膜，能与核酸形成复合物。可以溶解细胞膜，能与核酸形成复合物。CTAB核
40、酸复合物在高盐核酸复合物在高盐(0.7mM)浓度下可溶，在低盐浓度浓度下可溶，在低盐浓度(0.1-0.5mM)下下 因溶解度降低而沉淀。因溶解度降低而沉淀。植物材料研磨后，在植物材料研磨后，在 CTAB的处理下，的处理下，65水浴可使细水浴可使细胞裂解、蛋白质变性，胞裂解、蛋白质变性，DNA 被释放出来并被释放出来并 与与CTAB 形成复形成复合物。氯仿合物。氯仿/异戊醇异戊醇 (24:1)抽提可去除蛋白质、多糖、色素抽提可去除蛋白质、多糖、色素等。降低盐浓度时，等。降低盐浓度时，CTAB核酸复合物沉淀，而大部分的蛋核酸复合物沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶于溶液中。因此通过离心就可将其分开
41、。白质及多糖等仍溶于溶液中。因此通过离心就可将其分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，除去，除去CTAB。EDTA能螯合能螯合Mg2+或或Mn2+，抑制，抑制DNA酶的活性。酶的活性。PVP是酚的络合物，能与酚形成一种不溶的络合物质，是酚的络合物，能与酚形成一种不溶的络合物质，有效的去除多酚，减少有效的去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能与中酚的污染，同时它也能与多糖结合，有效的去除多糖。多糖结合，有效的去除多糖。-巯基乙醇是抗氧化剂，可有效的阻止酚氧化成醌巯基乙醇是抗氧化剂，可有效的阻止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。，避免褐变，使酚容易去除。用酚用酚-氯仿
42、抽提，去除蛋白、多糖、单宁、色素等氯仿抽提，去除蛋白、多糖、单宁、色素等杂质，得到的杂质，得到的DNA溶液经异丙醇沉淀。溶液经异丙醇沉淀。Tris(三羟甲基三羟甲基氨基甲烷氨基甲烷)-HCL是生物化学一种常用的缓冲液。是生物化学一种常用的缓冲液。NaCl可提供高盐环境，使可提供高盐环境，使DNP充分溶解，存在于充分溶解，存在于液相中。另外，高盐可溶解多糖。液相中。另外，高盐可溶解多糖。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外异戊醇有助于分相，使离心后的上层
43、含另外异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。乙醇洗剂主要用来除去盐离子，乙醇会夺取乙醇洗剂主要用来除去盐离子，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。母液配制母液配制（除标注外，均需高压灭菌）。（除标注外，均需高压灭菌）。1）1M Tris-HCl（pH8.0）12.11 g Tris 溶于溶于100ml H2O加浓加浓HCl调调pH至至8.0（约（约5.25ml 浓浓HCl）2）0.5M EDTA-Na2（pH8.0）23.26 g EDTA-N
44、a22H2O+100mlH2O（磁力搅拌）（磁力搅拌）加加NaOH（片状）调（片状）调pH至至8.0（约（约2.5gNaOH）在调在调pH至至8.0以前，以前，EDTA-Na2不溶解不溶解3）5M NaCl29.2 g NaCl+100mlH2O4）-巯基乙醇巯基乙醇（BME）通常为通常为14.4M（勿高压灭菌）（勿高压灭菌）配制配制10ml CTAB提取液提取液1M Tris-HCl1ml0.5M EDTA-Na20.4ml5M NaCl2.8mlCTAB0.2gBME20l（使用前加入）（使用前加入）ddH2O5.78ml配制配制30ml TE（pH8.0）（可防止）（可防止DNA发生酸解
45、）发生酸解）1M Tris-HCl300l0.5M EDTA-Na260lddH2O29.64ml实验步骤：1取新鲜叶片放入研钵，加入液氮研磨成细粉状。转移至取新鲜叶片放入研钵，加入液氮研磨成细粉状。转移至1.5mlEppendorf管中，加入管中，加入0.5ml 65预热的预热的CTAB提取液提取液，65恒温水浴恒温水浴30-60min（CTAB在低于在低于15时会析出沉淀时会析出沉淀，因此在将其加入冷冻的植物材料中之前必须预热），其，因此在将其加入冷冻的植物材料中之前必须预热），其间不时轻缓颠倒混匀。如果降解严重或得率太低，可以使间不时轻缓颠倒混匀。如果降解严重或得率太低，可以使用用 37
46、 45区域水浴。区域水浴。2加入等体积加入等体积24:1 CHCl3/异戊醇，混匀，异戊醇，混匀，4冷藏静置冷藏静置10min。34，10000r/min 离心离心10min，取上清液至新，取上清液至新Eppendorf管中。再用等体积管中。再用等体积24:1 酚酚/氯仿氯仿/异戊醇抽提，取上清液。异戊醇抽提，取上清液。4.上清液至新的上清液至新的Eppendorf管中，加入管中，加入2/3倍体积预冷的异丙倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，醇，轻轻混匀，-20静置至沉淀析出。用玻璃棒静置至沉淀析出。用玻璃棒(细细)挑出成挑出成团的团的DNA。5将将DNA挑入挑入Eppendorf管中，用管中，用7
47、0%乙醇乙醇(或无水乙醇或无水乙醇)洗洗涤涤3次，风干。次，风干。6将将DNA溶于溶于1 ml TE中。中。7取取150l DNA溶于溶于20倍倍(或更高倍或更高倍)体积体积TE(或或ddH2O)中，中，用用TE(或或ddH2O)做空白校正。做空白校正。8测测260nm、280nm、310nm处的处的ODdsDNA=50(OD260 OD310)稀释倍数稀释倍数(g/ml)DNA OD260/OD280=1.8，大于，大于1.9表明有表明有RNA污染，小于污染，小于1.6表明有蛋白质或酚类污染。表明有蛋白质或酚类污染。（2）SDS法法 SDS可溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，溶解膜蛋白而破可溶解细
48、胞膜上的脂类与蛋白质，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合还能与蛋白质结合而沉淀。而沉淀。将分散好的生物组织细胞在含将分散好的生物组织细胞在含SDS和蛋白酶和蛋白酶K的溶液中的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的得到的DNA经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。相对而言经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。相对而言，过程长，纯度高。，过程长，纯度高。而而CTAB法相对简便、快速，法相对简便、快速，DNA 产量高产量高；但；但 纯度稍纯度稍次，适用于一般分子生
49、物学操作次，适用于一般分子生物学操作。q SDS SDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液2 RNA的提取的提取 RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的，也是最常使用的通过是必不可少的，也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表途径分析细胞基因表达的前提。达的前提。RNA分析其实是对组织细胞总分析其实是对组织细胞总RNA中的中的mRNA进行分析。进行分析。通常一个典型的
50、哺乳动物细胞约含通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5g RNA，但其中大部分为，但其中大部分为rRNA及及tRNA，而，而mRNA仅占仅占1%5%。由于由于mRNA分子的结构特点，容易受分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而酶的攻击反应而降解，加上降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。酶的污染，并设法抑制其活性。RNA酶酶 RNA实验的最关键因素是分离到全长的实验的最关键因素是分离到全长的RNA。而实。而实验失败的主要原因是验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于酶的污染。由于RNA
