1、武汉科技大学制药过程与工艺第第3章章 基因工程制药工艺基因工程制药工艺武汉科技大学制药过程与工艺2本章内容3.1 基因工程制药微生物表达系统3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.4 重组人干扰素生产工艺武汉科技大学制药过程与工艺33.1 基因工程制药微生物表达系统武汉科技大学制药过程与工艺4基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。武汉科技大学制药过程与工艺5一 大肠杆菌表达系统1 大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征细胞：G，单细胞，杆
2、状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径23mm。武汉科技大学制药过程与工艺62 生化与遗传特性能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K12株的衍生菌株。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。武汉科技大学制药过程与工艺73 质粒载体复制起始点选择标记多克隆位点武汉科技大学制药过程与工艺8质粒类型严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101；松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1；克隆质粒：用于克隆和
3、扩增外源基因；测序质粒：用于基因测序；整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合；穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在；表达质粒：能表达基因产物武汉科技大学制药过程与工艺94 产物表达形式不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体；可溶性蛋白质：存在于细胞质；周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。武汉科技大学制药过程与工艺105 优点和不足发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，
4、细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。武汉科技大学制药过程与工艺116 应用大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂溶栓酶类：rPA白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。武汉科技大学制药过程与工艺12二 酵母表达系统1 形态特征细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产
5、生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。武汉科技大学制药过程与工艺132 生长与遗传特征孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因。武汉科技大学制药过程与工艺143 优点与不足优点五种类型的载体，安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点
6、酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。武汉科技大学制药过程与工艺154 应用1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类：高血糖素2种乙肝疫苗等。8种产品武汉科技大学制药过程与工艺163.2 基因工程大肠杆菌的构建技术武汉科技大学制药过程与工艺17一 工程菌构建流程目标基因克隆表达载体构建遗传转化与筛选工程菌PCR、文库、化学合成酶切、连接外源基因导入与培养武汉科技大学制药过程与工艺18二 表达载体构建表达载体设计目标基因的定位克隆酶切反应连接反应转化
7、筛选与鉴定武汉科技大学制药过程与工艺19三 基因工程菌的建立过程适宜宿主菌的转化筛选鉴定，遗传稳定性等。目标获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。武汉科技大学制药过程与工艺20表达筛选与产物鉴定不同菌种的表达筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选产物存在形式和存在场所的鉴定表达部位胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白表达产物结构与活性鉴定电泳，SDSPAGE，等电点电泳免疫杂交，末端测序，质谱分析分析与目标产物的同一性武汉科技大学制药过程与工艺213.3 基因工程菌的发酵培养与控制武汉科技大学制药过程与工艺22一 培养基组成与控制碳源氮源无机盐选择剂诱导物武汉科技大学制
8、药过程与工艺231 碳源大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源；酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。浓度稍高后就表现出底物抑制作用。葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。武汉科技大学制药过程与工艺242 氮源直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸为氮源武汉科技大学制药过程与工艺253、无机盐磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态基因工程菌生长提供必需的
9、矿物质。武汉科技大学制药过程与工艺264 选择剂selective agent维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌。为了保证质粒的稳定性、不丢失，根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。武汉科技大学制药过程与工艺27选择剂种类营养缺陷互补和抗生素抗性。工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂；工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。武汉科技大学制药过程与工艺285 诱导物诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻
10、译，生成产物。诱导物成为产物表达必不可少的。Lac启动子表达系统：IPTG诱导。甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导。武汉科技大学制药过程与工艺296 培养基组成对质粒稳定性的影响营养较丰富的培养基，质粒稳定性高于合成培养基；限制性基质对基因工程菌的比生长速率有不同影响；大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定；对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性；培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。武汉科技大学制药过程与工艺30二 培养工艺与控制温度溶解氧pH武汉科技大学制药过程与工艺311 温度对工程菌发酵的影响生长大肠杆菌和酿酒酵
11、母生长最低温度为10；大肠杆菌生长最适温度为37，最高温度为45；酿酒酵母生长最适温度为30，最高温度为40。生产生长与生产温度不一致；较高温度表达包涵体，较低温度下有利于表达可溶性蛋白质；对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。武汉科技大学制药过程与工艺32温度控制两段变温发酵培养：前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37，生产期提高温度42。武汉科技大学制药过程与工艺332 pH值对发酵的影响
12、细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.57.5，真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.06.0。影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。武汉科技大学制药过程与工艺34pH控制了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。武汉科技大学制药过程与工艺353 溶解氧控工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑
13、，使之需氧不超过设备的供氧能力。考虑溶氧对质粒稳定性的影响通过调节搅拌转速和通气量来调控武汉科技大学制药过程与工艺36三 终点控制根据目标基因产物的表达模式而定。适宜的诱导时间：非常重要诱导物的浓度及其发酵温度：影响表达量，产物存在形式在生产中应严格控制。武汉科技大学制药过程与工艺371 化学诱导表达化学诱导型启动子：lac、tac、T7等诱导时间：对数生长期细菌：IPTG诱导甲基营养型酵母：甲醇诱导。武汉科技大学制药过程与工艺382 温度诱导表达温度诱导型启动子：PL、PR启动子两段培养发酵：诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。武汉科技大学制药过程与工艺393.4 重组
14、人干扰素生产工艺武汉科技大学制药过程与工艺40一 干扰素概述概念：（interferon，IFN）机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子功能：干扰病毒在细胞内的繁殖天然干扰素分类：I干扰素：IFN、IFN、IFN、IFN、IFN II干扰素：IFN上市重组干扰素:2a、2b、1b、1b，研发中的重组干扰素：IFN，临床阶段武汉科技大学制药过程与工艺41重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFN）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rh
15、uIFN）多发性硬化症rhuIFN武汉科技大学制药过程与工艺42干扰素生产工艺路线体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞人源转化细胞系培养生产工艺基因工程大肠杆菌假或单胞杆菌发酵生产工艺动物无限细胞系培养生产工艺武汉科技大学制药过程与工艺43二 生产过程工程菌的构建发酵过程产物分离和纯化武汉科技大学制药过程与工艺441 工程菌的构建第一步：干扰素-2b基因的克隆第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建武汉科技大学制药过程与工艺452 干扰素的发酵工艺过程工作菌种库药瓶培养种子培养发酵培养菌体收集武汉科技大学制药过程与工艺463 干扰素的分离纯化工艺过程(1)菌体裂解裂解缓冲液：
16、纯化水，210（pH7.5）；使用保护剂：EDTA，PMSF；破碎20菌体：2厘米；搅拌：加裂解缓冲液，210，2h；冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。武汉科技大学制药过程与工艺47(2)预处理加絮凝剂聚乙烯亚胺:210，搅拌，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:210,搅拌，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。离心连续流离心机：210，16000 r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。武汉科技大学制药过程与工艺48(3)初级分离盐析:4M硫酸铵，210，搅匀静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min。保存：收集沉淀，粗干扰素，4。武汉科技大学制药过程与工艺49(4)干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装武汉科技大学制药过程与工艺50本章结束
