1、栏目栏目导引导引第第3节测定微生物的数量节测定微生物的数量栏目栏目导引导引学习导航学习导航1.概述微生物计数的基本方法。概述微生物计数的基本方法。2.运用稀释平板法测定样品中微生物的数量。运用稀释平板法测定样品中微生物的数量。重、难点重、难点栏目栏目导引导引新知初探思维启动新知初探思维启动一、直接计数法一、直接计数法1.常用方法：常用方法：显微镜直接计数法。显微镜直接计数法。2.具体步骤：具体步骤：将待测样品制成悬液将待测样品制成悬液取一定取一定量的悬液放在显微镜下进行计数量的悬液放在显微镜下进行计数观察并计观察并计算出单位体积内的微生物总数。算出单位体积内的微生物总数。栏目栏目导引导引3.优
2、点优点4.缺点：缺点：难以计数难以计数_的细菌。的细菌。5.适用范围：适用范围：一般适用于纯培养悬浮液中各种一般适用于纯培养悬浮液中各种_的计数。的计数。二、间接计数法二、间接计数法1.常用方法：常用方法：_。所需设备所需设备_，可迅速得到结果，可迅速得到结果能观察到微生物的能观察到微生物的_简单简单形态特征形态特征微小微小单细胞菌体单细胞菌体稀释平板计数法稀释平板计数法栏目栏目导引导引2.具体步骤：具体步骤：需要将待测样品配制成均匀的需要将待测样品配制成均匀的_并使其均匀分布于平板中的培并使其均匀分布于平板中的培养基内，经过培养后，统计培养基中出现的养基内，经过培养后，统计培养基中出现的_,
3、即可推算出检测样品中的活菌数。即可推算出检测样品中的活菌数。3.优点：优点：在样品中含菌数在样品中含菌数_的情形下也的情形下也可以完成计数。可以完成计数。系列稀释液系列稀释液菌落数菌落数较少较少栏目栏目导引导引判一判判一判(1)在用直接计数法测量培养瓶中酵母菌时，在用直接计数法测量培养瓶中酵母菌时，应在培养液静置一段时间后，从瓶底部吸取应在培养液静置一段时间后，从瓶底部吸取液体样本。液体样本。()(2)用稀释平板计数法，通过观察菌落，得出用稀释平板计数法，通过观察菌落，得出的数值往往比实验值要大。的数值往往比实验值要大。()(3)在计数时，用于培养的器皿要进行灭菌。在计数时，用于培养的器皿要进
4、行灭菌。()栏目栏目导引导引三、间接计数法实例三、间接计数法实例1.土壤中好气性细菌的计数土壤中好气性细菌的计数(1)制备土壤稀释液制备土壤稀释液取土壤表层取土壤表层_处的土样。准确称处的土样。准确称取取1 g土样，放入盛有土样，放入盛有_ mL无菌水的锥形瓶无菌水的锥形瓶中，振荡中，振荡20 min后制成后制成102倍的稀释液。然后倍的稀释液。然后进行系列稀释，得到进行系列稀释，得到103、104、105、106的系的系列稀释菌液。列稀释菌液。5 cm10 cm99栏目栏目导引导引(2)取样及倒平板：每个号码设置取样及倒平板：每个号码设置_个重复。个重复。(3)培养。培养。(4)观察记录观察
5、记录计数时对于细菌、放线菌、酵母菌以每个计数时对于细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有培养皿内有_个菌落为宜。霉菌以个菌落为宜。霉菌以每个培养皿内有每个培养皿内有_个菌落为宜。个菌落为宜。33030010100栏目栏目导引导引栏目栏目导引导引2.检测天然水源中细菌总数和大肠菌群数检测天然水源中细菌总数和大肠菌群数(1)细菌总数通常是指细菌总数通常是指1 g或或1 mL检测样品中所检测样品中所含含_的总数的总数,单位用单位用cfu/g(mL)表示。表示。细菌菌落细菌菌落栏目栏目导引导引(2)大肠菌群数通常是指每大肠菌群数通常是指每100 g或或100 mL检测检测样品中所含大肠菌群的实验数值，以
6、样品中所含大肠菌群的实验数值，以(MPN)表表示。大肠菌群是指在示。大肠菌群是指在_条件下，条件下，24 h内能内能发酵发酵_，产酸产气的一类，产酸产气的一类_氧或氧或_氧型革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。大肠菌群氧型革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。大肠菌群数的检测，常用数的检测，常用_法，使用乳糖胆盐法，使用乳糖胆盐蛋白胨培养基、蛋白胨培养基、_琼脂培养基琼脂培养基(EMB培养基培养基)和乳糖发酵管。和乳糖发酵管。37 乳糖乳糖需需兼性厌兼性厌多管发酵多管发酵伊红美蓝伊红美蓝栏目栏目导引导引3.土壤中分解尿素细菌的计数土壤中分解尿素细菌的计数有些细菌含有有些细菌含有_酶，能将尿素琼脂酶，能将尿素琼脂
7、培养基中的尿素分解生成氨，氨溶于水变成培养基中的尿素分解生成氨，氨溶于水变成氢氧化铵，导致培养基变成氢氧化铵，导致培养基变成_性，使酚红性，使酚红指示剂呈现指示剂呈现_色。色。尿素分解尿素分解碱碱红红栏目栏目导引导引想一想想一想土壤有土壤有“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”之称，为什之称，为什么？么？【提示提示】由于土壤具备了各种微生物生长由于土壤具备了各种微生物生长所需的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压所需的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，是微生物生活的良好环境。和温度等条件，是微生物生活的良好环境。对微生物来说，是微生物的对微生物来说，是微生物的“大本营大本营”；对；对
8、人类来说，是最丰富的人类来说，是最丰富的“菌种资源库菌种资源库”。栏目栏目导引导引要点突破讲练互动要点突破讲练互动要点一直接计数法和间接计数法的比较要点一直接计数法和间接计数法的比较1.显微镜直接计数法显微镜直接计数法(1)原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。物的数量。栏目栏目导引导引(2)方法：用计数板计数。计数板是特制的载方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为玻片，其上有特定的面积为1 mm2，高为，高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成的计
9、数室，一个计数室又被分成25个个(或或16个个)中格，每个中格再被划分成中格，每个中格再被划分成16个个(或或25个个)小格，每个计数室都由小格，每个计数室都由400个小格组成。个小格组成。栏目栏目导引导引(3)操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数盖玻片，然后在显微镜下计数45个中格中个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的细菌数。细菌数。(4)计算公式计算公式每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每毫升原液所含细菌
10、数每小格平均细菌数40010000稀释倍数稀释倍数(5)缺点：不能区分死菌与活菌。缺点：不能区分死菌与活菌。栏目栏目导引导引2.间接计数法间接计数法(活菌计数法活菌计数法)(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。能推测出样品中大约含有多少活菌。栏目栏目导引导引(2)操作操作设置重复组设置重复组,增强实验的说服力与准确性。增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列将待测样品经
11、一系列10倍稀释，然后选择三倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。为使结果接近真实值，可将同计数菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上,经涂布、培养，计算出菌落平均数。经涂布、培养，计算出菌落平均数。栏目栏目导引导引为了保证结果准确，要选择一个合适的稀为了保证结果准确，要选择一个合适的稀释倍数，且同一稀释倍
12、数的各个重复组菌落释倍数，且同一稀释倍数的各个重复组菌落数要相近，若设置的重复组中结果相差太远数要相近，若设置的重复组中结果相差太远,意味着操作有误，需重新实验。意味着操作有误，需重新实验。(3)优点：能观察菌落特征。优点：能观察菌落特征。栏目栏目导引导引 在探究培养液中酵母菌种群数量变化在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜下观察的载玻片，样品就滴在计数室内。计下观察的载玻片，样品就滴在计数室内。计数室由数室由2516400个小室组成，容纳液体总个
13、小室组成，容纳液体总体积为体积为0.1 mm3。某同学操作时将。某同学操作时将1 mL酵母酵母菌样品加菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。例例1栏目栏目导引导引(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：这样的：从静置试管中吸取酵母菌培养液从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；加入计数板进行计数，并记录数据；把酵把酵母菌培养液放置在冰箱中；母菌培养液放置在冰箱
14、中；第七天再取样第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。计数，记录数据，统计分析绘成曲线。请纠正该同学实验操作中的请纠正该同学实验操作中的3处错误：处错误：_；栏目栏目导引导引_；_。(2)在实验前应该对计数板、吸管等器具进行在实验前应该对计数板、吸管等器具进行_处理。处理。栏目栏目导引导引(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清,应采取的措施是应采取的措施是_。(4)如果观察到如图所示如果观察到如图所示a、b、c、d、e 5个大个大格共格共80个小室内共有酵母菌个小室内共有酵母菌48个，则上述个，则上述1 mL酵母菌样品中约有酵母菌酵母菌样品中约有
15、酵母菌_个；要个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？怎么做？_。栏目栏目导引导引栏目栏目导引导引【解析解析】(1)在从试管中吸取酵母菌之前在从试管中吸取酵母菌之前,应应将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在培将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在培养液中均匀分布。酵母菌的培养液应置于适养液中均匀分布。酵母菌的培养液应置于适宜温度下培养，并且每隔宜温度下培养，并且每隔24小时就要统计一小时就要统计一次菌落数目。次菌落数目。(2)为了避免杂菌污染，实验中为了避免杂菌污染，实验中所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理。所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理
16、。(3)、(4)解答时要注意以下两点解答时要注意以下两点:统一单位统一单位;注意体积的变化。注意体积的变化。栏目栏目导引导引400个小室共容纳液体总体积为个小室共容纳液体总体积为0.1 mm3，则，则80个小室容纳体积为：个小室容纳体积为：2102mm3，含酵母，含酵母菌菌48个，又因酵母菌培养液总体积为个，又因酵母菌培养液总体积为100 mL,统一单位后即可求出酵母菌个数。统一单位后即可求出酵母菌个数。栏目栏目导引导引【答案答案】(1)应将试管轻轻振荡几次再吸应将试管轻轻振荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数取酵母菌培养液进行计数应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养应将酵母菌培养液放置在适宜温度
17、下培养应连续七天，每天观察、取样计数并记录应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据数据(2)灭菌灭菌(3)适当稀释适当稀释(4)2.4108多次计数，求平均值多次计数，求平均值栏目栏目导引导引变式训练变式训练用稀释平板法测定同一土壤样品中的细菌数用稀释平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍数为在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是几种统计结果，正确的是()A涂布了涂布了1个平板，统计的菌落数是个平板，统计的菌落数是230B涂布了涂布了2个平板，统计的菌落数是个平板，统计的菌落数是215和和260，取平均值，取平均值238栏目栏目导引导引C涂
18、布了涂布了3个平板，统计的菌落数分别是个平板，统计的菌落数分别是21、212和和256，取平均值，取平均值163D涂布了涂布了3个平板，统计的菌落数分别是个平板，统计的菌落数分别是210、240和和250，取平均值，取平均值233栏目栏目导引导引解析：选解析：选D。在设计实验时，一定要涂布至。在设计实验时，一定要涂布至少少3个平板，作为重复组，才能增强实验的个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以说服力与准确性，所以A、B两项不正确。两项不正确。C项虽涂布了项虽涂布了3个平板，但是，其中个平板，但是，其中1个平板的个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过计数结果与另两个相差
19、太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用程中可能出现了错误，因此，不能简单地用3个平板的计数值求平均值。个平板的计数值求平均值。栏目栏目导引导引要点二间接计数法在统计微生物数目时的要点二间接计数法在统计微生物数目时的注意事项注意事项1.设置对照设置对照(1)目的：排除实验中非测试因素对实验结果目的：排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。的影响，提高实验结果的可信度。(2)方法：取一个未接种的培养基与接种好的方法：取一个未接种的培养基与接种好的培养基一起培养。培养基一起培养。栏目栏目导引导引2.注意无菌操作注意无菌操作(1)建立无菌观念，严格控制实验器材、实
20、验建立无菌观念，严格控制实验器材、实验室、实验操作者的消毒、灭菌。室、实验操作者的消毒、灭菌。(2)整个实验过程必须保证无菌操作。整个实验过程必须保证无菌操作。(3)取样、稀释都要在酒精灯火焰附近的无菌取样、稀释都要在酒精灯火焰附近的无菌环境中进行。环境中进行。(4)规范操作，防止其他微生物污染，实验结规范操作，防止其他微生物污染，实验结束后洗手、消毒。束后洗手、消毒。栏目栏目导引导引3.准确计数准确计数(1)在计算结果时，不同的微生物要选择的稀在计算结果时，不同的微生物要选择的稀释倍数不同。细菌、放线菌、酵母菌一般以释倍数不同。细菌、放线菌、酵母菌一般以每个培养皿中有每个培养皿中有30300
21、个菌落为宜，而霉个菌落为宜，而霉菌则以有菌则以有10100个为宜。个为宜。(2)要设置要设置3个或个或3个以上的重复组，然后求其个以上的重复组，然后求其平均值进行计算。平均值进行计算。(3)每隔每隔24 h统计一次，最后选取数目稳定时统计一次，最后选取数目稳定时的记录作为结果。的记录作为结果。栏目栏目导引导引特别提醒特别提醒间接计数法主要是用来推测样间接计数法主要是用来推测样品中大约含有的活菌数。品中大约含有的活菌数。统计的菌落数往往比实际的数目低，因为统计的菌落数往往比实际的数目低，因为当两个或两个以上微生物在一起时，平板上当两个或两个以上微生物在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。观察到的
22、只是一个菌落。栏目栏目导引导引 在做分离分解尿素的细菌实验时，在做分离分解尿素的细菌实验时，A同同学从对应的培养基上筛选出大约学从对应的培养基上筛选出大约150个菌落，个菌落，而其他同学只选择出大约而其他同学只选择出大约50个菌落。个菌落。A同学的同学的结果产生原因可能有结果产生原因可能有()由于土样不同由于土样不同由于培养基污染由于培养基污染由由于操作失误于操作失误没有设置对照没有设置对照ABC D例例2栏目栏目导引导引【解析解析】实验结论是否正确与是否设置对实验结论是否正确与是否设置对照有直接关系，但实验结果与是否设计对照照有直接关系，但实验结果与是否设计对照无关。无关。【答案答案】A栏目栏目导引导引变式训练变式训练下列调查活动或实验中，计算所得数值与实下列调查活动或实验中，计算所得数值与实际数值相比，可能偏小的是际数值相比，可能偏小的是()标志重捕法调查灰喜鹊种群密度时标志物标志重捕法调查灰喜鹊种群密度时标志物脱落脱落用血球计数板计数酵母菌数量时只统计方用血球计数板计数酵母菌数量时只统计方格内菌体格内菌体栏目栏目导引导引样方法调查蒲公英种群密度时在分布较密样方法调查蒲公英种群密度时在分布较密的地区取样的地区取样调查某遗传病的发病率时以患者家系为调调查某遗传病的发病率时以患者家系为调查对象查对象A BC D栏目栏目导引导引
