1、张文炳 020-62-789123 0757-299-85246 南方医科大学公共卫生 与热带医学学院微生物学系,医学微生物学实验 Medical Microbiology Practicum,微生物学实验室规则 Lab Safety Regulation,进入实验室必须穿白大衣，戴帽子。 书本、文具放在抽屉里。 实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头脸等部位。 凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处理，不得随便乱放或用水冲洗。 一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。 离开实验室前,必须洗手。怀疑污染应及时用1新洁而灭泡手。 每次实验后
2、，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖布拖地以后再扫地，实验室用紫外线灯照射1小时。,实验室人员基本要求,实验人员应具有相应的教育、微生物专业培训经历，具备相应的资质，能够理解并正确实施实验。 实验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识。 实验人员应在实验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染。 实验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定，保证自身安全。,实验分组（52人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲乙丙丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙
3、 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,11 甲 乙 丙 丁,12 甲 乙 丙 丁,13 甲 乙 丙 丁,实验分组（48人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲乙丙丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,11 甲 乙 丙 丁,12 甲 乙 丙 丁,实验分组（48人）,俩俩相对4人为一个小组,组号
4、编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲乙丙丁+戊。,甲 乙 戊 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁 戊,甲 乙 戊 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁戊,甲 乙 8 丙 丁 戊,甲 乙戊 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁 戊,甲 乙戊 9 丙 丁,讲 台,左,右,实验分组（45人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲乙丙丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,
5、甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,11 甲 乙 丙 丁 戊,实验分组（40人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,实验分组（36人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙
6、 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,5,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,实验分组（32人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,5,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,10,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,实验分组（28人）,俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,4,甲
7、 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,5,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,10,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,实验室器材介绍,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置 接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,普通冰箱(3颗星*) 冷藏室(上柜）： 温度48，保存细菌培养物，培养基，常用菌种和抗菌素纸片等。 冷冻室（下柜）： 温度18，保存诊断血清、血浆，长期保藏的抗菌素纸片。,卫生工具： 扫帚,拖布,撮箕,垃圾筐,放在冰箱和水池之间。,
8、隔水式电热恒温培养箱：3537， 一般细菌培养时间为1824小时。,奥林巴斯 CX21型 生物显微镜 （实验柜内，每人一台）,注意：只能横放，不得竖放。,两侧边台各一个电陶炉，双圈炉面可同时放置4个300ml锥形瓶进行加热。,电陶炉使用说明 开启单圈（120mm）：顺时针旋转，选择单圈档位（最大档位）正对炉面。 开启双圈（180mm）：顺时针旋转，使炉面正对旋钮档位，再微用力旋转至档位，并听到“嗒”的响声，立即放开旋钮，旋钮会自动弹回档位，此时双圈开启，然后逆时针选择双圈档位进行加热。,电陶炉使用注意事项,放置锥形瓶时，应轻拿轻放，勿以拖拉的方式移动锥形瓶，以免造成炉面损坯和刮痕。 在加热过程
9、中，如有培养基溢出，请立即关闭电陶炉。 切勿用湿手插拔电源插头，以免触电。 炉面温度最高可达570，不得空烧。 电陶炉的炉面为微晶玻璃板面，如有裂纹或破损，请立即拔掉电源插头。 当旋钮在0档位时，如果逆时针强行旋转，会导致旋钮损坏。 当旋钮旋转至档位时，如果继续顺时针旋转，会导致旋钮损坏。,蒸馏水：配制培养基。 1新洁而灭：怀疑病原菌污染，泡手35分钟。 玻片缸：浸泡用过的载玻片。 消毒抹布：擦拭实验台台面。,医学微生物学实验 综合性实验一 Comprehensive Experiment 1,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（P2） Isolation and detection of path
10、ogenic bacteria in pus and stool specimens 培养基的制备P2 消毒与灭菌P5 细菌的人工培养 无菌技术（录像） 摆斜面，倾注平板。,脓汁、痰、咽部分泌物,观察菌落特征、溶血性、色素,肉汤增菌培养,挑取可疑菌落,涂片染色镜检,血平板培养,直接涂片、革兰染色、镜检,血液、穿刺液,纯培养,培养液涂片染色境检,染色镜检 生化反应 血清学鉴定,双糖铁培养基,增菌培养,血、骨髓,挑取可疑菌落,SS琼脂、伊红美蓝平板分离培养,粪便,常见肠道致病菌的检查程序P48：,常见病原性球菌的检查程序P47：,生化反应 动物实验 药敏实验,脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验流程,
11、培养基的制备,细菌的分离培养,细菌的纯培养,细菌的形态学检查,细菌的生化试验等,细菌的血清学试验、结果分析实验论文撰写,Isolation and identification of bacteria from clinical specimens (Pus & Stool) - workflow, culture media preparation, isolated culture of bacteria, pure culture of bacteria, morphological examination of bacteria, biochemisty, mobility, SCT
12、& AST of bacteria, serologic test, results analysis paper writing,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,培养
13、基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,培养基的制备 Preparation of Culture Media,公共培基，勿作标记！ 请在30分钟内完成！,加热时,常摇动。 沸腾时，不能摇动！,培养基煮开，使完全溶解。营养肉汤煮开1次，含琼脂的培养基煮开3次(煮至刚刚冒泡,立即放置台面，半分钟后
14、再煮)。,煮开三次,用洗耳球和刻度吸管分装培养基。 棉塞1/2塞入试管口内，松紧合适。,培养基趁热分装,培养基装筐待灭菌,放置试管筐内，罩上硫酸纸牛皮纸，用橡皮筋扎好。,各组边台柜子内器材,量筒,锥形瓶,砝码,干粉培养基,试管筐,天平,各组边台抽屉内器材,试管,刻度吸管,洗耳球,称量皿2个,药勺,厘米尺,硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋,称量皿置于左盘，游码移至标尺左端“0”点位置上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。,秤物时“左物右码”（210组使用游码，不用砝码），物品置左盘，尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿清洗干净。,天平已经改造，右侧添加与
15、称量皿等重物件。,培养基配制器材,内盖盖好 外盖扭紧,Preparation of Culture Media,Melt agar into solution in the microwave or electric stove,玻璃器材的洗刷,无污染器皿:洗涤剂洗刷流水冲洗10次晾干。 病原菌污染的器材高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净流水冲洗10次晾干。,瓶刷,试管刷,吸管刷,去污粉,纱布,收拾器材，放回边台柜内，依次摆整齐!,量筒,锥形瓶,砝码,干粉培养基,试管筐,天平,量筒罩纸套，扎皮筋 。 锥形瓶洗干净，塞棉塞，罩纸套，扎皮筋 。 干粉培养
16、基内外盖子，必须盖好扭紧！,收拾器材，放回抽屉内，依次摆整齐!,试管,刻度吸管,洗耳球,称量皿,药勺,厘米尺,硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋,药勺、称量皿、刻度吸管洗刷干净，甩去水滴，放回边台抽屉内。,细菌培养基 Culture Media,用人工的方法，将多种营养物质，根据各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种营养制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水，pH7.47.6。 培养基制备的一般程序： 调配溶化 矫正pH 分装灭菌检定保存。干粉培养基蒸馏水加热溶化分装灭菌检定保存。 培养基的制备原则： (1)适当的营养成分,(2)合适的酸碱度,(3)配制后必须灭菌。,培养基的种类（按物理性状分类）
17、液体培养基:不含凝固剂(琼脂),用于增菌，纯培养,保种。 固体培养基:含12琼脂，用于分离培养,纯培养,保种。 半固体培基（琼脂高层）:含0.30.5琼脂，用于动力检测,保种。,营养肉汤 broth tube 琼脂斜面 agar slant 琼脂高层 agar deep,Different forms of culture media.,培养基的种类（按用途分类）P3 基础培养基:含一般细菌生长繁殖所需的基本营养成分，可作为一些特殊培养基的基础成分，如普通平板。 营养培养基：在基础培养基中加入血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长，如血平板。 增菌培养基：促
18、进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 选择培养基：在培养基中加入抑制剂抑制杂菌生长，有助于目的菌的生长，如EMB、SS平板。 鉴别培养基：利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用来试验细菌的生化反应、代谢产物，如糖发酵管。 厌氧培养基：氧化还原电势低，表面用凡士林和石蜡封住，与空气隔绝，成为无氧环境，如庖肉培养基。,培养基的灭菌,在冷空气完全排尽的情况下，蒸汽压103.43 kPa ,温度可达到121.3 ,维持1530分钟，可以杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。 基础培养基：121高压蒸汽灭菌1530分钟。 含糖培养基：115灭菌15分钟。
19、 鸡蛋、牛奶培养基:75100 30分钟，3次(1天1次)。 不耐高温的液体成分：滤菌器滤过除菌 EK型蔡氏滤器、 G5或G6玻璃滤器、0.45um或0.22um微孔滤膜。,琼脂平板 agar plate,含琼脂的培养基灭菌以后，冷却5060（温度越高，冷凝水越多，越易污染 ），以无菌操作，倾注平皿10ml（直径7厘米平皿），琼脂凝固后形成琼脂平板。 平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。,平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？ 防止平板水分蒸发丢失。 防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。 ,琼脂斜面 agar slant,含琼脂的培养基灭菌以后摇均匀，趁热斜放，培基不超过试管长度的2
20、/3，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。 斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。 斜面底部的冷凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和菌种保藏。,怎样检查培养基是否合格?,无菌试验：将待检培养基置于3537培养箱培养24小时，无任何细菌生长为合格。 效果试验：将已知的标准参考菌株，接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。,细菌生长繁殖的方式和速度,细菌繁殖方式：以二分裂方式进行无性繁殖。 繁殖速度：多数2030分钟繁殖1代，结核杆菌1820小时繁殖一代。 细菌生长繁殖曲线,细菌的生长曲线,细菌数量的对数,培养时间 （小时）,5 10 15 20 25 30,活菌数,总菌数,迟
21、缓期,对数生长期,稳定期,衰退期,细菌生长曲线意义,迟缓期：一般14h，细菌代谢活跃，但不繁殖。 对数期：维持48h，细菌快速繁殖，数目呈几何级数增加，细菌形态、染色性、生理活性最典型、对抗菌素最敏感。细菌鉴定选用此期为佳。 稳定期： 通常维持10h，活菌数和死菌数几乎相等，代谢产物形成较多。 衰亡期：培养18 24 h以后，代谢逐渐停滞,死菌数超过活菌数。,玻璃器材的洗刷,无污染器皿:洗涤剂洗刷流水冲洗10次晾干。 病原菌污染的器材高压蒸汽灭菌趁热倒出污物洗涤剂浸泡瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净流水冲洗10次晾干。,瓶刷,试管刷,吸管刷,去污粉,纱布,试管用毛刷，上下、旋转刷洗
22、内壁和管底。,字迹用湿纱布，粘去污粉擦拭。,管口朝向相同，流水冲洗10次。,洗干净的试管，倒扣在筐内，晾干。,平皿用纱布，旋转擦拭内外侧，字迹用纱布粘去污粉擦拭。,流水冲洗10次。逐个倒扣在筐内，晾干。,玻璃器材洗干净的标准,1.洗涤时观察:洗后的玻璃器材附着在内壁上的水不是个别水珠,而是一层极薄的水膜。 2.干燥后观察:对着光亮处观看玻璃器材,非常透明, 内外壁上不出现大片发白或白点,也无微小污点和粉末。,test tube rack inoculating needle , inoculating loop ； oil base pen , lighter.,power socket te
23、st tube rack Alcohol burner kidney basin,power socket test tube rack Alcohol burner kidney basin,test tube rack inoculating needle , inoculating loop ； oil base pen , lighter.,实验器材 整齐有序,医学微生物学实验 综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（一） 培养基的制备P2 消毒与灭菌P5 细菌的人工培养 无菌技术（录像） 摆斜面，倾注平板。,思考题,人工培养细菌需要提供的条件是什么? 培养基制备的原则是什么? 怎样检查培养基是否合格? 培养基按物理形状分哪几种?各有何用途? 高压蒸汽灭菌法的杀菌机理是什么?,固体培养基的制备 （课外完成）,平板（40人份）：倾注营养琼脂平板505个、伊红美蓝平板20+2个。以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固以后（温度降至室温,约30分钟），平板倒放，4冰箱保存备用。 斜面：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后，4冰箱保存备用。,
