1、肝胆生物化学检验肝胆生物化学检验Company Logo教学目标教学目标 教学时数教学时数 6 6学时学时v熟悉肝胆基本解剖生理功能；熟悉肝胆基本解剖生理功能；v熟悉血氨、胆红素、总蛋白、清蛋白熟悉血氨、胆红素、总蛋白、清蛋白/ALT/ALP/ALT/ALP等等 分析前变异（标本收集与前处理）；分析前变异（标本收集与前处理）；v掌握掌握ALT/ALP/AST/DB/TB/TP/AlbALT/ALP/AST/DB/TB/TP/Alb等检验方法原理等检验方法原理 v熟悉肝胆酶学、胆红素、氨、蛋白等临床意义熟悉肝胆酶学、胆红素、氨、蛋白等临床意义Company Logov梗阻性黄疸梗阻性黄疸v梗阻性
2、黄疸生物化学标记物特点？梗阻性黄疸生物化学标记物特点？v该患者在被检验师开始分离血清时已发现偏黄，该患者在被检验师开始分离血清时已发现偏黄，血清偏黄色主要由黄疸引起，有时候为摄入着色血清偏黄色主要由黄疸引起，有时候为摄入着色剂引起剂引起v黄疸病黄疸病 通常胆红素会沉积在皮肤通常胆红素会沉积在皮肤 粘膜或眼睛粘膜或眼睛Company Logov肝功能评估常见生物化学指标（与功能相关）肝功能评估常见生物化学指标（与功能相关）v酶学：酶学：ALP ALT AST GGT 5-NT(核苷酸酶）核苷酸酶）v生物转化及排泄：生物转化及排泄：TB DBv合成：合成：TP Albv代谢及排泄：代谢及排泄：TG
3、 TC 尿素尿素 氨氨Company LogoCompany LogoCompany Logo一、肝脏结构一、肝脏结构（一（一）解剖学特点）解剖学特点双重血液供应双重血液供应 腹主动脉的分技肝动脉腹主动脉的分技肝动脉 氧氧 门静脉门静脉 营养营养 双重输出管道双重输出管道 肝静脉肝静脉 代谢降解物代谢降解物 下腔静脉下腔静脉 胆道系统胆道系统 脂溶性物质及其代谢产物脂溶性物质及其代谢产物 体外体外 Company Logo（二（二）肝脏的显微结构特点）肝脏的显微结构特点1 1、组织结构、组织结构2 2、亚细胞结构、亚细胞结构（三（三）细胞的再生）细胞的再生Company Logo二、肝脏的生物
4、化学功能二、肝脏的生物化学功能排泄功能排泄功能物质代谢功能物质代谢功能生物转化生物转化重要生化功能重要生化功能Company Logo（一）排泄功能（一）排泄功能主要排泄对象：胆汁酸、胆红素、氨主要排泄对象：胆汁酸、胆红素、氨1 1、胆汁酸代谢、胆汁酸代谢 （1 1）胆汁的分泌：）胆汁的分泌：胆汁功能：促进脂类的消化吸收，同时能将体内某些代谢产物及生物转化胆汁功能：促进脂类的消化吸收，同时能将体内某些代谢产物及生物转化产物不断地排入肠道随粪便排出体外。产物不断地排入肠道随粪便排出体外。胆汁的来源：胆汁的来源：肝胆汁肝胆汁 胆囊胆汁胆囊胆汁 十二指肠十二指肠胆汁的成分：胆汁的成分：水水/胆汁酸（
5、盐）、卵磷脂、蛋白质、脂肪酸和胆固醇胆汁酸（盐）、卵磷脂、蛋白质、脂肪酸和胆固醇Company Logo（2 2）胆汁酸生成及种类：）胆汁酸生成及种类：Company Logo（3 3）胆汁酸肝肠循环：）胆汁酸肝肠循环：（4 4）胆汁酸的功能：）胆汁酸的功能：促进脂类消化促进脂类消化促进脂类吸收促进脂类吸收抑制胆固醇从胆汁中析出沉淀抑制胆固醇从胆汁中析出沉淀Company Logo2 2、胆红素代谢、胆红素代谢胆色素胆色素 尿胆素原尿胆素原 粪胆素原粪胆素原尿胆素尿胆素粪胆素粪胆素胆绿素胆绿素胆红素胆红素未结合胆红素未结合胆红素(单核吞噬细胞系统如骨髓、脾脏单核吞噬细胞系统如骨髓、脾脏)结合胆
6、红素（肝脏）结合胆红素（肝脏）胆素原胆素原Company Logo部位肝脏细胞鸟氨酸鸟氨酸瓜瓜氨氨酸酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酸代琥珀酸精氨酸代琥珀酸ATPAMP+PPi延延胡胡索索酸酸鸟氨酸鸟氨酸精氨酸精氨酸H2OCONH2NH2天门冬氨酸天门冬氨酸NH3CO2氨氨甲甲酰酰磷磷酸酸+H2O3 3、氨代谢、氨代谢Company Logo（二）物质代谢功能（二）物质代谢功能1 1、营养物质代谢、营养物质代谢2 2、激素及维生素代谢、激素及维生素代谢 (1)(1)在蛋白质代谢中的作用在蛋白质代谢中的作用 (2)(2)在氨基酸代谢中的作用在氨基酸代谢中的作用 (3)(3)在糖代谢中的作用在糖代谢中的作用 (
7、4)(4)在脂代谢中的作用在脂代谢中的作用激素的灭活主要在肝脏进行激素的灭活主要在肝脏进行 多种维生素能在肝细胞内储存并进行转化多种维生素能在肝细胞内储存并进行转化 Company Logo胆红素代谢紊乱生化胆红素代谢紊乱生化（一）胆红素代谢障碍（一）胆红素代谢障碍n定义定义:n黄疸分类黄疸分类:黄疸黄疸和阻塞性黄疸和阻塞性黄疸 溶血性黄疸溶血性黄疸肝细胞性黄疸肝细胞性黄疸高胆红素血症高胆红素血症v高胆红素血症高胆红素血症v高胆红素血症可分为肝前性、肝性高胆红素血症可分为肝前性、肝性、肝后性、肝后性v肝前性高胆红素血症可能为溶血或血红素代谢旺肝前性高胆红素血症可能为溶血或血红素代谢旺盛、红细胞
8、破坏血红蛋白增加、镰状细胞贫血引盛、红细胞破坏血红蛋白增加、镰状细胞贫血引起起 表现为非结合胆红素升高表现为非结合胆红素升高 结合胆红素正常结合胆红素正常v肝性高胆红素血症既可能为未被转运到肝脏或肝肝性高胆红素血症既可能为未被转运到肝脏或肝脏生物转化功能缺陷引起，前者典型的如吉氏综脏生物转化功能缺陷引起，前者典型的如吉氏综合征、后者典型如克合征、后者典型如克-纳氏综合症纳氏综合症 新生儿黄疸新生儿黄疸（缺（缺UDPG转移酶）表现为非结合和结合胆红素都升转移酶）表现为非结合和结合胆红素都升高高 肝酶学指标如肝酶学指标如ALT AST多升高多升高 表明肝脏有炎表明肝脏有炎症或肝细胞有损伤症或肝细胞
9、有损伤Company Logov肝后性高胆红素血症肝后性高胆红素血症v通常为结石通常为结石、肿瘤、疤痕引起胆管堵塞，表现为、肿瘤、疤痕引起胆管堵塞，表现为结合胆红素升高，非结合胆红素正常，结合胆红素升高，非结合胆红素正常，ALP GGT升高升高 脂类代谢异常脂类代谢异常v其他影像学检查可辅助诊断梗阻部位其他影像学检查可辅助诊断梗阻部位v该例患者该例患者 最后被诊断为胆结石最后被诊断为胆结石Company Logo案例案例2v一新生儿一新生儿 从第三天总胆红素开始升高从第三天总胆红素开始升高 母亲母亲O型型 新新生儿生儿A型型 接受光疗（接受光疗（450nm）转化非结合胆红）转化非结合胆红素，否
10、则导致胆红素穿过新生儿血脑屏障，发生素，否则导致胆红素穿过新生儿血脑屏障，发生脑瘫脑瘫 耳聋耳聋 智力低下智力低下v并监测并监测 胆红素胆红素v家属寻求合理的解释家属寻求合理的解释Company Logov生理性黄疸：生理性黄疸：2-3天出现，天出现，4天开始好转，也可能天开始好转，也可能持续持续2周周 一般非结合胆红素升高一般非结合胆红素升高 肝酶学正常肝酶学正常 v其他原因：溶血性疾病、先天性胆管闭锁、新生其他原因：溶血性疾病、先天性胆管闭锁、新生儿特发性肝炎儿特发性肝炎 导致持续升高导致持续升高v溶血性黄疸溶血性黄疸 主要是免疫机制引起溶血主要是免疫机制引起溶血 属于肝前性属于肝前性v其
11、检查方法？其检查方法？Company LogoCompany Logo血清胆红素测定血清胆红素测定重氮盐法重氮盐法胆红素氧化酶胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOD)(bilirubin oxidase,BOD)法法高效液相色谱法高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)(high performance liquid chromatography,HPLC)、导数分光光度法导数分光光度法直接分光光度计法直接分光光度计法 测测定定方方法法Company Logo1 1重氮盐改良重氮盐改良J-G(Jendrassik
12、 and Grof method,J-G)J-G(Jendrassik and Grof method,J-G)法法(1)(1)原理原理:血清中血清中结合胆红素与重氮盐反应生成偶氮胆红素结合胆红素与重氮盐反应生成偶氮胆红素；同样条件下，；同样条件下，游离胆游离胆红素需要在加速剂作用下红素需要在加速剂作用下，使游离胆红素分子内的，使游离胆红素分子内的次级键断裂次级键断裂，极性上升并，极性上升并与重氮试剂反应。反应完成后加入与重氮试剂反应。反应完成后加入终止试剂终止试剂，继而加入，继而加入碱性酒石酸钾钠碱性酒石酸钾钠使紫使紫色偶氮试剂转变为蓝色，波长色偶氮试剂转变为蓝色，波长600nm600nm下
13、比色分析，求出血样中总胆红素的含下比色分析，求出血样中总胆红素的含量。量。(2)(2)方法评价：方法评价：推荐的常规方法，其方法的线性范围较宽，在推荐的常规方法，其方法的线性范围较宽，在342342mol/L(200mg/L)mol/L(200mg/L)浓度下有较好的准确性和精确性，浓度下有较好的准确性和精确性，高浓度时准确性和精确性降低高浓度时准确性和精确性降低。因此，建。因此，建议浓度过高时减少血样用量测定。议浓度过高时减少血样用量测定。Company Logo【临床意义临床意义】【参考范围参考范围】黄疸的鉴别诊断黄疸的鉴别诊断 总胆红素总胆红素:5.1:5.119.0mol/L(0.31
14、9.0mol/L(0.31.1mg/dL)1.1mg/dL)直接胆红素直接胆红素:1.71:1.716.8mol/L(0.16.8mol/L(0.10.4mg/dL)0.4mg/dL)Company Logo2 2胆红素胆红素BODBOD测定法测定法(1)(1)原理原理:BOD BOD在不同在不同pHpH条件下催化不同组份的条件下催化不同组份的胆红素氧化生成胆绿素胆红素氧化生成胆绿素，胆绿素与氧胆绿素与氧进行非酶促反应转变为淡紫色化合物进行非酶促反应转变为淡紫色化合物，胆红素的最大吸收峰在，胆红素的最大吸收峰在450nm450nm 附近。附近。随着胆红素被氧化随着胆红素被氧化,450nm,45
15、0nm下降，下降程度与胆红素浓度成正比下降，下降程度与胆红素浓度成正比。；在。；在pH8.0pH8.0条条件下件下,未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，用于测定未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，用于测定总胆红素总胆红素,在在pH=4.5pH=4.5的的酸性条件下，酸性条件下，BODBOD仅能催化结合胆红素和大部分仅能催化结合胆红素和大部分胆红素，而游离胆红素不被胆红素，而游离胆红素不被氧化，测定其含量代表氧化，测定其含量代表结合胆红素结合胆红素。(2)(2)方法评价：方法评价：BODBOD法测定总胆红素的准确性、精密度比改良法测定总胆红素的准确性、精密度比改良J-GJ-G法好法好 Company
16、 Logo【参考范围参考范围】血清总胆红素：血清总胆红素：10.2610.264.104.10mol/L mol/L 血清结合胆红素：血清结合胆红素：2.572.572.56 2.56 mol/L mol/L 胆红素胆红素mol/L=mol/L=胆红素胆红素mg/L X 17.1mg/L X 17.1【临床意义临床意义】见重氮比色法见重氮比色法Company Logo尿胆素原测定尿胆素原测定新鲜标本新鲜标本 （受胆红素干扰（受胆红素干扰 可能被氧化为尿胆素）可能被氧化为尿胆素）方法：埃里希反应方法：埃里希反应 （试剂酸性对二甲基苯甲醛（试剂酸性对二甲基苯甲醛 红色）红色）胆红素干扰排除：氯化钡
17、沉淀过滤胆红素干扰排除：氯化钡沉淀过滤Company Logo胆汁酸代谢障碍胆汁酸代谢障碍1 1、胆汁酸合成障碍、胆汁酸合成障碍2 2、胆汁酸向肠道排出障碍、胆汁酸向肠道排出障碍3 3胆汁酸肠肝循环紊乱胆汁酸肠肝循环紊乱4 4胆汁瘀积病变时胆汁酸代谢紊乱胆汁瘀积病变时胆汁酸代谢紊乱 Company Logo血清胆汁酸测定血清胆汁酸测定高效液相色谱法高效液相色谱法放射免疫分析法放射免疫分析法酶免疫分析法酶免疫分析法比色分析测定法比色分析测定法 测测定定方方法法Company Logo(1)(1)酶比色法测定原理酶比色法测定原理 3-HSD3-HSD胆汁酸胆汁酸 +NAD+NAD+3-3-氧氧-5
18、-5类固醇类固醇+NADH +NADH （1 1）NADH+NBT NADH+NBT 甲甲jiejie（蓝色化合物（蓝色化合物 =540nm=540nm）（2 2）3-3-氧氧-5-5类固醇类固醇 +NAD+NAD+3-3-氧氧-5-5类固醇类固醇 +NADH +NADH （3 3）黄递酶黄递酶4 4-DH-DHu酶比色法酶比色法Company Logo 由于胆汁酸在血中含量低，方法检测的灵敏度达不到要求，通过由于胆汁酸在血中含量低，方法检测的灵敏度达不到要求，通过增加增加3-3-氧氧-5-5-类固醇脱氢酶类固醇脱氢酶(4-DH)4-DH)，胆汁酸经，胆汁酸经3-HSD3-HSD催化的产物催化
19、的产物3-3-氧代胆酸在氧代胆酸在4-DH4-DH作用下再作用下再次脱氢，加大了次脱氢，加大了NADHNADH的生成量，提高了反应的检测能力（见反应式的生成量，提高了反应的检测能力（见反应式1 1、2 2、3 3）。但。但以上两种方法都存在一个缺点：生成的蓝色产物是一种染料，易于附着管壁，难于清以上两种方法都存在一个缺点：生成的蓝色产物是一种染料，易于附着管壁，难于清洗或堵塞管道。洗或堵塞管道。酶循环法测定原理为：酶循环法测定原理为：NADNAD+Thio-NAD Thio-NAD Thio-NADH Thio-NADH 胆汁酸胆汁酸3-3-氧代胆汁酸氧代胆汁酸NADHNADH3-HSDCom
20、pany Logo(2)(2)酶比色测定法评价：酶比色测定法评价：快速、简便、准确、可靠和适用的优点。它即可以手工操快速、简便、准确、可靠和适用的优点。它即可以手工操作、也可以在自动化仪器上进行。但试剂价贵、不易保持。对作、也可以在自动化仪器上进行。但试剂价贵、不易保持。对酶量的要求严格，以保证酶促反应在零级反应下进行，酶量不酶量的要求严格，以保证酶促反应在零级反应下进行，酶量不足易产生误差。足易产生误差。此外，标准品的制备非常重要。常采用甘氨胆此外，标准品的制备非常重要。常采用甘氨胆酸溶入小牛血清中制成冻干品酸溶入小牛血清中制成冻干品。【参考范围参考范围】1 1 7 7 mol/Lmol/L
21、(成人空腹血清总胆汁酸成人空腹血清总胆汁酸)血清胆汁酸测定的临床意义血清胆汁酸测定的临床意义1、总胆汁酸测定、总胆汁酸测定肝细胞微损伤确定诊断价值指标肝细胞微损伤确定诊断价值指标高胆红素血症与胆汁瘀积的区别高胆红素血症与胆汁瘀积的区别 TBA测定正常而胆红素升高，可视为高胆测定正常而胆红素升高，可视为高胆红素血病红素血病 TBA升高，胆红素正常为胆汁瘀积升高，胆红素正常为胆汁瘀积 两者均升高考虑为胆汁瘀积性黄疸两者均升高考虑为胆汁瘀积性黄疸2、胆汁酸比值测定、胆汁酸比值测定 胆道梗阻时，患者血清中胆道梗阻时，患者血清中CA和和CDCA升高，以升高，以CA为主，为主，CA/CDCA1。肝实质细胞
22、损坏时，血清中以肝实质细胞损坏时，血清中以CDCA为为主，主，CD/CDCA1因此，因此，CA/CDCA比值可作为鉴别梗阻性比值可作为鉴别梗阻性病变黄疸和肝细胞病变（黄疸）的指标。病变黄疸和肝细胞病变（黄疸）的指标。3、其它、其它 药物：所致的中毒性肝炎、早期药物：所致的中毒性肝炎、早期TBA 指示回肠病变或功能紊乱的指标指示回肠病变或功能紊乱的指标 胆汁酸耐量试验胆汁酸耐量试验 任何引起肝细胞损伤的病理过程都可能引起血中胆汁酸升任何引起肝细胞损伤的病理过程都可能引起血中胆汁酸升高可见于各种类型的肝病、肝硬化、脂肪肝，也见于急慢性胆高可见于各种类型的肝病、肝硬化、脂肪肝，也见于急慢性胆道阻塞。
23、其中空腹胆汁酸测定是一种敏感、特异性强并相对简道阻塞。其中空腹胆汁酸测定是一种敏感、特异性强并相对简单的肝功能试验，是目前公认最敏感的肝功能试验之一。特别单的肝功能试验，是目前公认最敏感的肝功能试验之一。特别适用于可疑有肝病但其它生化试验正常或轻度异常的病人诊断。适用于可疑有肝病但其它生化试验正常或轻度异常的病人诊断。案例案例3v59岁女性岁女性 未明原因发烧未明原因发烧 瘙痒瘙痒 血清棕黄色血清棕黄色Company LogoCompany Logo血浆酶紊乱检验血浆酶紊乱检验1 1肝脏合成酶类肝脏合成酶类:胆碱脂酶、凝血因子、铜蓝蛋白；胆碱脂酶、凝血因子、铜蓝蛋白；2.2.肝细胞内酶肝细胞内
24、酶:ALT、AST 3 3肝脏阻塞性疾病酶活性改变：肝脏阻塞性疾病酶活性改变：ALP、GGT4 4肝硬化疾病酶活性改变：肝硬化疾病酶活性改变：单胺氧化酶（单胺氧化酶（MAOMAO）Company Logo酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识 n酶活性的概念酶活性的概念 n酶活性单位酶活性单位 n酶活性单位的计算酶活性单位的计算 n酶促反应进程酶促反应进程 n酶促反应底物动力学酶促反应底物动力学 Company Logo一、酶活性的概念一、酶活性的概念 酶活性酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。间内底物的减少量或产物的
25、生成量。底物浓度为底物浓度为S S,产物浓度为产物浓度为P P,时间为时间为t t，反应速度为，反应速度为v vv=-dS/dt 或或 v=dP/dt。注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。生成量为好。Company Logo二、酶活性单位二、酶活性单位n定义：定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。准。惯用单位惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。酶活性测定方法的建立者所规定的单
26、位。国际单位国际单位：1IU指在规定条件（最适指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，最适底物浓度）下，每分钟转化每分钟转化1 mol底物的酶量。单位为底物的酶量。单位为IU/L。Katal单位单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的底物的酶量，酶量，1Katal=60106IU。Company Logo三、酶活性单位的计算三、酶活性单位的计算n步骤：步骤：运用公式进行计算。运用公式进行计算。明确测定方法的明确测定方法的酶单位定义酶单位定义，按照酶单位，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，定义确定物质量、体积和时间的单位，Company L
27、ogon计算公式计算公式:产物的增加量产物的增加量 每单位规定的保温时间每单位规定的保温时间 10001000（mlml）酶单位酶单位/升升 =每单位规定的产物增加量每单位规定的产物增加量 实际保温时间实际保温时间 实际标本用量（实际标本用量（mlml）分光光度法测定的公式：分光光度法测定的公式：（A A测定测定 A A对照）对照）V V总总10106 6 每单位规定的保温时间每单位规定的保温时间酶单位酶单位/升升 =L LV V标标 实际保温时间实际保温时间Company Logo四、酶促反应进程四、酶促反应进程n 酶促反应进程曲线酶促反应进程曲线 Company Logon酶量的测定：酶量
28、的测定：通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（确测定酶量，应使酶浓度（E E）与酶促反应速度）与酶促反应速度成正比，即成正比，即E E-d-dS S/dt/dt或或E EddP P/dt/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。度，即酶促反应初速度。酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。应速度才能准确代表酶活性。酶的含量酶的含量 酶活性酶活性酶促反应初速度酶促反应初速度Compa
29、ny Logo五、酶促反应底物动力学五、酶促反应底物动力学n中间产物学说：中间产物学说：酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。催化底物反应生成产物。E+S ES E+P Company Logon米米-曼氏方程：曼氏方程：VmaxSv=S+Km 上式中上式中v v代表反应速度，代表反应速度，VmaxVmax代表最大反应速度，代表最大反应速度，S S代表底物浓度，代表底物浓度，KmKm称为米氏常数。称为米氏常数。Company Logo（一）米氏常数的定义（一）米氏常数的定义由米由米-曼氏方程可以导出：曼氏方程可
30、以导出：（Vmax-v）SKm=v 当当v=1/2Vmaxv=1/2Vmax时，时，Km=Km=S S。因此。因此KmKm值为反应速度相当值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。于最大反应速度一半时的底物浓度。KmKm值是酶的特征常数值是酶的特征常数，具，具有重要的应用价值。有重要的应用价值。Company Logo（二）（二）Km值的应用值的应用1.鉴定酶的种类鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种不同种类的酶其类的酶其Km值不同，对于
31、一种未知的酶，可在规定的值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其条件下测定其Km值加以鉴定。值加以鉴定。Company Logo表表7-1 7-1 某些酶的某些酶的KmKm值值 酶酶 底物底物 Km(mmol/L)乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 0.017己糖激酶己糖激酶 D-葡萄糖葡萄糖 0.05 D-果糖果糖 1.5-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 D-乳糖乳糖 4.0碳酸酐酶碳酸酐酶 H2CO3 9.0过氧化氢酶过氧化氢酶 H2O2 25蔗糖酶蔗糖酶 蔗糖蔗糖 28糜蛋白酶糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108Company Logo2.2.反映酶与底物的亲合力反映酶与
32、底物的亲合力 KmKm值越大，酶与底物亲合力越小，值越大，酶与底物亲合力越小，KmKm值越小，酶与底物亲合力越大。值越小，酶与底物亲合力越大。3.3.选择酶的最适底物选择酶的最适底物 KmKm值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的物有不同的KmKm值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。使酶促反应容易进行，并节省底物用量。Company Logo4.4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的
33、比率度的比率 根据米根据米-曼氏方程可以计算曼氏方程可以计算 5.5.设计适宜的底物浓度设计适宜的底物浓度 酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的活性，一般要求初速度达到最大速度的90%90%95%95%、底物、底物消耗率为消耗率为1%1%5%5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。致于使底物浓度过高而造成浪费。Company Logo(三三)Vmax的应用的应用n定义定义 ：Vmax指指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。酶完全被底物分子饱和时的
34、反应速度。n应用：应用：Vmax可用来计算酶的转化率（可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反秒。当反应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的转化率：转化率：TN=底物转化量（底物转化量（mol/s）/酶量（酶量（mol）Company Logo(四四)Km和和Vmax的测定的测定1Linweaver-Burk作图法作图法,又称为双倒数作图法又称为双倒数作图法 1 Km+S Km 1 1 =+v Vm
35、axS Vmax S VmaxCompany Logo2Cornish-Bowden作图法作图法 又称为直线线性作图法。又称为直线线性作图法。Company Logo同工酶测定同工酶测定n同工酶的定义同工酶的定义n同工酶产生的机理同工酶产生的机理n同工酶的测定方法同工酶的测定方法Company Logon同工酶的定义同工酶的定义 是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等同的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。Company Lo
36、go一、同工酶产生的机理一、同工酶产生的机理（一）由不同基因位点编码（一）由不同基因位点编码（二）由等位基因编码（二）由等位基因编码（三）由多肽链化学修饰产生（三）由多肽链化学修饰产生Company Logo二、同工酶的测定方法二、同工酶的测定方法（一）按照理化性质不同进行分离鉴定（一）按照理化性质不同进行分离鉴定1 1电泳法电泳法 同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。2 2层析法层析法 根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法加
37、以分离。法加以分离。Company Logo（二）按照底物专一性不同进行鉴定（二）按照底物专一性不同进行鉴定 同工酶同工酶底物专一性不同，底物专一性不同，Km值也不同。如果同工值也不同。如果同工酶之间的酶之间的Km值差别足够大，可以通过测定其值差别足够大，可以通过测定其Km值加值加以鉴定。以鉴定。（三）按照（三）按照最适最适pH不同进行鉴定不同进行鉴定 同工酶同工酶分子氨基酸组成不同，最适分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如也不同。如果同工酶最适果同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓之间的差别足够大，可以通过调节缓冲溶液的冲溶液的pH值加以鉴定。值加以鉴定。Company Logo
38、（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定（五）按照耐热程度不同进行鉴定（五）按照耐热程度不同进行鉴定（六）选择性抑制法（六）选择性抑制法Company Logo酶学分析在临床诊断上的应用酶学分析在临床诊断上的应用n血浆酶的来源血浆酶的来源n酶的区域化分布酶的区域化分布n酶活性测定在临床诊断中的应用酶活性测定在临床诊断中的应用n同工酶的诊断价值同工酶的诊断价值Company Logo一、血浆酶的来源一、血浆酶的来源血浆酶血浆酶 血浆特异酶血浆特异酶 非血浆特异酶非血浆特异酶 外分泌酶外分泌酶 细胞内酶细胞内酶 Company Logo二、酶的区域化分布二、酶的区域
39、化分布表表7-3 7-3 诊断常用血清酶的来源诊断常用血清酶的来源血清酶血清酶 符号符号 来源来源鸟氨酸氨基甲酰转移酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝肝 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝肝山梨醇脱氢酶山梨醇脱氢酶 SDH 肝肝丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心肝、肾、心异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心肝、胎盘、心-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶 -GT 肝、胆、肾、小肠肝、胆、肾、小肠5-核苷酸酶核苷酸酶 5-NT 肝、胆道肝、胆道单胺氧化酶单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转
40、移酶天门冬氨酸氨基转移酶 AST 心、肝、骨骼肌心、肝、骨骼肌肌酸激酶肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑骨骼肌、心、脑乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺心、肾、骨骼肌、肝、肺碱性磷酸酶碱性磷酸酶 ALP 小肠、胎盘、肝、肾小肠、胎盘、肝、肾酸性磷酸酶酸性磷酸酶 ACP 前列腺、红细胞、血小板前列腺、红细胞、血小板淀粉酶淀粉酶 AMS 胰、唾液腺胰、唾液腺脂肪酶脂肪酶 LPS 胰胰Company Logo三、酶活性测定在临床诊断中的应用三、酶活性测定在临床诊断中的应用（一）在肝脏疾病诊断中的应用（一）在肝脏疾病诊断中的应用（二）在急性心肌梗死诊断中的应用（二）在急性心肌梗死诊断中的
41、应用（三）在急性胰腺炎诊断中的应用（三）在急性胰腺炎诊断中的应用（四）在骨骼疾病诊断中的应用（四）在骨骼疾病诊断中的应用（五）在肌肉疾病诊断中的应用（五）在肌肉疾病诊断中的应用（六）在前列腺疾病诊断中的应用（六）在前列腺疾病诊断中的应用（七）在肿瘤诊断中的应用（七）在肿瘤诊断中的应用四、同工酶的诊断价值四、同工酶的诊断价值Company Logo血清酶测定血清酶测定（一）氨基转移酶测定（一）氨基转移酶测定1 1赖氏法测定赖氏法测定ALTALT（）原理：（）原理：（）（）方法评价：方法评价：赖氏法的实验结果需与赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果卡门分光法的结果对比后求出；对比后求出；NaOHN
42、aOH的浓度的浓度对显色有影响；对显色有影响；该法的该法的重复性差重复性差。Company Logo【参考范围参考范围】5 52525卡门氏单位卡门氏单位 【临床意义临床意义】(2)(2)慢性活动性肝炎或脂肪肝：慢性活动性肝炎或脂肪肝：(1)(1)肝细胞损伤的灵敏指标肝细胞损伤的灵敏指标:ALT轻度增高轻度增高(100200IU),或属正常范围或属正常范围,Company Logo2.2.连续监测法测定连续监测法测定ALT ALT（）原理：（）原理：采用酶偶联反应采用酶偶联反应,即即L-L-丙氨酸和丙氨酸和-酮戊二酸酮戊二酸在在ALTALT作用下，生成作用下，生成丙丙酮酸和酮酸和L-L-谷氨酸
43、谷氨酸。丙酮酸再在丙酮酸再在LDLD作用下生成作用下生成L-L-乳酸乳酸，同时，同时NADHNADH被氧化为被氧化为NAD+,NAD+,可在可在340nm340nm处连续监测到处连续监测到NADHNADH的消耗量的消耗量,从而计算出从而计算出ALTALT活性浓度。活性浓度。双双试剂法试剂法 :首先使血清与缺少首先使血清与缺少-酮戊二酸的底物溶液混合，酮戊二酸的底物溶液混合，3737保保温温5 5分钟，将分钟，将标本中所含的标本中所含的-酮酸酮酸(如丙酮酸如丙酮酸)消耗完消耗完，然后，加入，然后，加入-酮酮戊二酸启动戊二酸启动ALTALT催化的反应，在波长催化的反应，在波长340nm340nm处
44、连续监测吸光度下降速率。根处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率据线性反应期吸光度下降速率(-(-A/min)A/min)，来计算，来计算ALTALT的活性。的活性。Company Logo（）（）方法评价：方法评价：存在着两个副反应，会使测定结果偏高；存在着两个副反应，会使测定结果偏高；A A、血清中存在的、血清中存在的-酮酸酮酸(如丙酮酸如丙酮酸)能消耗能消耗NADHNADH。B B、血清中谷氨酸脱氢酶、血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)(GLDH)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗NADHNADH。双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，
45、测定准确双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，测定准确性高，是性高，是ALTALT测定的首选方法；测定的首选方法；血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性；避免使用溶血标血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性；避免使用溶血标本。本。Company Logo3.3.赖氏法测定赖氏法测定ASTAST（）原理：（）原理：血清中的血清中的ASTAST可催化可催化门冬氨酸门冬氨酸(aspartate)(aspartate)与与-酮戊二酸间的氨基移换，酮戊二酸间的氨基移换，生成生成草酸乙酸草酸乙酸(oxaloacetate)(oxaloacetate)和和L-L-谷氨酸谷氨酸。草酸乙酸自行脱羧转变成为丙酮
46、草酸乙酸自行脱羧转变成为丙酮酸酸。反应。反应6060分钟后，加入分钟后，加入2 2，4-4-二硝基苯肼终止反应二硝基苯肼终止反应，并与，并与酮酸生反应生成两酮酸生反应生成两种种2 2，4-4-二硝基苯腙二硝基苯腙。在碱性条件下。在碱性条件下,两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在505nm505nm处差异最大，由草酸乙酸转变成的丙酮酸所生成的苯腙呈色强度显著大处差异最大，由草酸乙酸转变成的丙酮酸所生成的苯腙呈色强度显著大于于-酮戊二酸苯腙酮戊二酸苯腙。据此可用比色法测定。据此可用比色法测定ASTAST活性。活性。（）方法评价：（）方法评价：赖氏法的实验结果需与赖氏法的
47、实验结果需与卡门分光法的结果卡门分光法的结果对比后求出；对比后求出；该法的重复性差：该法的重复性差：负干扰现象负干扰现象 Company Logo【参考范围参考范围】828卡门氏单位卡门氏单位 【临床意义临床意义】肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎：血清肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎：血清ASTAST也可轻度增高。也可轻度增高。心肌梗死：血清中心肌梗死：血清中ASTAST活性增高活性增高 各种肝病病人：血清各种肝病病人：血清ASTAST的升高的升高 Company Logo4 4连续监测法测定连续监测法测定AST AST （）原理：（）原理：采用酶偶联反应采用酶偶联反应,即即L-L-门冬氨酸和门冬氨酸和-酮戊
48、二酸酮戊二酸在在ASTAST作用下，生成作用下，生成草草酰乙酸和酰乙酸和L-L-谷氨酸谷氨酸。草酰乙酸在。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶作用下生成作用下生成L-L-苹果酸，同时伴苹果酸，同时伴有有NADHNADH转化为转化为NAD+NAD+，在在340nm340nm监测监测NADHNADH的转化速率的转化速率，从而计算出，从而计算出ASTAST的活性的活性。双试剂法双试剂法 :同测定。同测定。Company Logo（）方法评价（）方法评价 误差可来自内源性和误差可来自内源性和(或或)外源性外源性内源性干扰主要来自血清中高浓度丙酮酸和内源性干扰主要来自血清中高浓度丙酮酸和L-L-谷氨酸脱氢
49、酶谷氨酸脱氢酶(GLDH)(GLDH)。外源性干扰来自试剂中污染的外源性干扰来自试剂中污染的GLDHGLDH和和ASTAST。【参考范围参考范围】5 540 IU/L(40 IU/L(连续监测法测定连续监测法测定)【临床意义临床意义】见赖氏法见赖氏法Company Logo(二二)ALP)ALP测定测定 n化学法化学法n连续监测法：连续监测法：鲍氏法鲍氏法金氏法金氏法皮氏法皮氏法Company Logo、金氏法测定、金氏法测定ALPALP （）原理（）原理：ALPALP在碱性环境中作用于在碱性环境中作用于磷酸苯二钠磷酸苯二钠，使之水解释放出，使之水解释放出酚酚和磷酸和磷酸。酚在碱性溶液中与酚在
50、碱性溶液中与4 4氨基安替比林作用，经铁氰化氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物钾氧化形成红色醌类化合物，根据红色深浅确定，根据红色深浅确定ALPALP的活力。的活力。(2)(2)方法评价：方法评价：磷酸苯二钠比色法与更早的磷酸苯二钠比色法与更早的-甘油磷酸钠法甘油磷酸钠法相比具有较大的相比具有较大的优点，如优点，如水解速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、水解速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、不需去蛋白、操作简单、快速不需去蛋白、操作简单、快速。但与。但与磷酸对硝基酚连续监测法磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低；操作比较繁琐相比，准确度、精密度较低；
