1、1,产前诊断实验室技术 郑州大学第三临床医学院 检验科 吴玥丽 2015年11月,2,主要内容,一、产前诊断基本知识介绍 二、产前诊断的取材 三、产前诊断主要实验室技术 羊水细胞染体核型分析 羊水细胞荧光原位杂交,3,为什么要进行产前诊断,围生儿期常见疾病的发生率大大降低 遗传性疾病的发生率逐年提高 遗传病不能根治，不少遗传病病情严重，甚至导致患儿死亡或终生残疾 产前诊断可及时诊断遗传性疾病，有利于积极采取预防措施，减少遗传病患儿的出生，降低遗传性疾病的发生率,4,产前诊断概念,产前诊断又称宫内诊断，是在胎儿出生前即对其是否患有某种遗传性疾病或先天畸形做出准确判断,5,产前诊断概念,无创性产前
2、诊断技术 影像学检查（X线、超声、胎儿镜等），了解胎儿大体形态的发育情况 母体外周血富集胎儿细胞技术 母体外周血胎儿游离DNA检测 有创性产前诊断技术（介入性产前诊断技术） 绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、脐带穿刺术等有创性操作 获得胎儿细胞进行遗传学分析，判断胎儿是否患有遗传性疾病,6,可进行产前诊断的疾病有哪些,单基因遗传病:PCR，基因测序等,7,染色体异常的发生机率,活产婴儿 0.6% 先天性智力障碍（MR）患者 23% 先天性心脏病 13% 死胎和围产期死亡胎儿 6.0% 自然流产(前三个月) 60%,8,染色体异常的发生机率,21-三体综合征新生儿发病率高达1/800 18-三体发病率约为
3、1/8000 13-三体发病率约为1/20000 其它各种性染色体异常发病率约为1/1000,9,哪些人需要进行产前诊断,唐筛高风险孕妇 35岁以上高龄孕妇 夫妇任一方为染色体病或染色体平衡易位携带者 曾生育过染色体异常患儿的夫妇再次妊娠 曾有不明原因自然流产、畸胎、死胎、死产或新生儿死亡史的孕妇再次妊娠 采用辅助生殖技术妊娠者 夫妇一方有明显致畸因素接触史者,10,孕期胎儿染色体筛查方案,11,唐氏筛查报告的解读,例如：21-三体风险率1/100 假阳性和假阴性 结合母亲年龄的三联筛查，唐氏综合症检出率: 65%，假阳性率：4.5-5.0% 增加抑制素A，可以将检出率增加到75% 结合母亲年
4、龄的NT测量，21三体检出率：77%，假阳性率：5% 结合生化分析和颈透明度的唐氏综合症的检测检出率可以达到89%，假阳性率：5% 仅仅是筛查实验，不是确诊实验！,12,先天愚型的发生率与母亲年龄关系,13,产前诊断取材,绒毛膜穿刺术 羊膜腔穿刺 脐静脉穿刺术,14,绒毛膜穿刺术,在妊娠9-11周之间进行 一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足任何产前诊断的需要 操作相关的流产率约为1%,15,羊膜腔穿刺术,孕18-24周 B超引导下 取羊水25-30ml,16,脐静脉穿刺术,操作时间窗为18周至分娩，妊娠20-24周为最佳穿刺时期 其危险性高于羊膜腔穿刺术和CVS,17,产前诊断主要实
5、验室技术,羊水细胞培养及染色体核型分析 羊水细胞荧光原位杂交检测 （Fluorescence in situ hybridization，FISH ）,18,羊水细胞培养及染色体核型分析,19,羊水细胞培养实验原理,标本采集：一般为孕1824 周，此时羊水中所含成纤维细胞和上皮样细胞多，较易生长 羊水细胞是胎儿皮肤等的脱落细胞，大部分是固缩的，死亡的，只有一小部分是活细胞 人的羊水细胞能长成单层贴壁细胞克隆并可连续进行传代培养,20,羊水细胞培养实验原理,培养条件：37,5%CO2 开放式培养 经过7天左右的培养，羊水细胞可生长为较成熟的细胞克隆，此时需更换培养液 换液后细胞进入指数增长期，此
6、时细胞生长旺盛，在换液后d1天及d2天在倒置显微镜下观察克隆生长情况，适时加入秋水仙素终止培养,21,羊水细胞培养实验步骤,25ml羊水于1500rpm离心10min 小心弃上清后，用1ml羊水重悬沉淀 加入5ml完全羊水培养基，混匀 转入培养瓶中，拧松瓶盖，置于37,5%CO2 培养箱中培养57天 一般7天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48小时 如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素作用4-6小时左右行细胞学处理。,22,细胞收获及染色体制备实验步骤,倒出倒出瓶中细胞上清液
7、入15ml离心管中 0.25% EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液终止消化 收集细胞悬液：1500rpm离心10min，去上清 低渗：加入0.075M KCl 6ml，吸管吹打，37水浴30min 预固定：加入1ml固定液（甲醇/冰醋酸=3/1），轻混匀，1500rpm离心10min 固定：去上清，加入固定液8ml，轻混匀， 1500rpm离心10min 重复固定一次， 1500rpm离心10min，去上清 根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定液，滴片 显带、染色，显微镜下分析,23,正常男性染色体核型 正常女性染色体核型,24,2
8、1-三体男性染色体核型 21-三体女性染色体核型,25,羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测,原理： 经过荧光素标记的DNA探针，可特异性的与染色体上与之互补的序列相结合，从而使染色体对应位置上发出荧光信号 在细胞学水平和分子水平之间架起了一道桥梁,26,荧光原位杂交（FISH）技术,用已知的荧光标记单链核苷酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位,27,羊水细胞荧光原位杂交（FISH）检测,28,FISH技术可检测哪些染
9、色体病,羊水FISH检测技术可快速检测羊水细胞中13、18、21、X、Y染色体数目异常 以上五种染色体非整倍体异常发生率占所有染色体非整倍体发生率65%以上，占染色体异常活婴的95%以上,29,FISH试验流程,洗片，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察荧光信号,30,图1 A：正常男性核型图； B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号； C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、 红色示Y,核型分析与FISH结果,图1A 1B 1C,31,核型分析与FISH结果,图2 A：正常女性核型图； B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号； C：18/X/Y
10、 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X,图2A 2B 2C,32,核型分析与FISH结果,图3A 3B 3C,图3 A：21-三体男性核型图（箭头示三条21号染色体） B：13/21组荧光信号图，绿色示13号、红色示21号（3个） C：18/X/Y 组荧光信号图，蓝色示18号、绿色示X、红色示Y,33,核型分析与FISH结果,图4A：46,XY,del(13)(q14)核型图（箭头示末端缺失的13号染色体） B：13/21组荧光信号图，绿色示13号（1个）、红色示21号,图4A 2B,34,核型分析与FISH技术对比,核型分析优点 可检出全部46条染色体 不仅能检出染色体数目异常，还能检出染色
11、体结构异常 目前仍是诊断染色体病的金标准 核型分析缺点 孕周要求较为严格，一般为18-24周 需要经过细胞培养，诊断周期长，核型分析报告时间为15-20天 可能发生污染或培养失败等情况,35,FISH技术优点 不经过细胞培养，缩短了诊断时间，提高了诊断效率 ，报告时间为2-3天 对孕周无严格要求 操作简便、敏感、特异性强 FISH技术缺点 仅能检出部分染色体数目异常 不能检出染色体结构重排及变异,核型分析与FISH技术对比,侵入性产前诊断技术的利与弊,36,无创性产前检测技术,37,无创性产前检测技术,38,39,无创性产前诊断技术,40,无创性产前检测技术的利与弊,产前诊断新技术,高通量基因
12、测序 染色体微阵列（CMA，SNP-array） 分辨率高，是普通核型分析的20倍 核型分析：10Mb CMA：400kb 可检出重复或缺失序列的来源 不能检出染色体平衡性结构改变 不能检出重复或缺失序列在染色体组中的位置,产前诊断染色体结果的解释与遗传咨询,胎儿染色体非平衡性结构异常： 胎儿为染色体异常患儿（染色体缺失或重复） 需追查胎儿父母双方染色体，以明确是否为父母一方存在平衡易位导致 若父母一方存在相应的平衡易位，则明确来源 若父母染色体正常，则胎儿为新生突变，来源不明，建议进行CMA检测以明确来源、判断预后,42,产前诊断染色体结果的解释与遗传咨询,胎儿染色体平衡性结构异常（？）：
13、需追查胎儿父母双方染色体，以明确是否为父母遗传 若父母一方为相应平衡性结构异常携带者，则明确胎儿结构异常亦为平衡性 若父母染色体正常，则胎儿为新生突变，不能排除断裂重接过程中是否存在染色体的微小缺失，建议进行CMA检测以明确是否为平衡性,43,产前诊断染色体结果的解释与遗传咨询,胎儿染色体多态性： 需追查胎儿父母双方染色体，以明确是否为父母遗传 若父母一方存在相应多态性，则明确胎儿亦为染色体多态性，不引起临床表型改变 若父母染色体无此多态，则胎儿为新生突变，不能确定是否为多态或存在致病性的重复及缺失，建议进行CMA检测以明确诊断,44,优势 细胞遗传学染色体核型分析目前仍是诊断染色体病的金标准
14、 不仅能够检出染色体数目异常及非平衡性的结构畸变，还能够检出平衡性的染色体结构改变（易位、倒位等） 局限 分辨率有限，无法染色体微小缺失或重复 G显带8.5Mb，高分辨4.5Mb 发现未知来源片段附加无法明确片段来源 细胞培养的限制,染色体核型分析的优势与局限,二代高通量测序技术、染色体微阵列技术CMA（array-CGH、SNP-array） 分辨率高，可达400Kb甚至单碱基水平 可明确拷贝数增加或缺失的来源 可达到无创性产前诊断水平 给传统的细胞遗传学染色体核型分析带来了前所未有的冲击与挑战 是否能够取代染色体核型分析技术？,新的技术不断涌现，日新月异,Case 1,姐弟二人均智力低下，
15、特殊面容 母亲怀孕40天,姐核型： 46,XX,add(1)(q42) 弟核型 46,XY,add(1)(q42) 姐核型： 46,XX,der(1)t(1;3)(q42p24) mat 弟核型 46,XY,der(1)t(1;3)(q42p24) mat,母亲核型： 46,XX,t(1;3)(q42p24) 胎儿核型 46,XY,t(1;3)(q42p24) mat,Case 2,患儿核型： 46,XX,add(7)(q32) 46,XX,dup(7)(p11.2q22.1) 父亲核型：46,XY 母亲核型：46,XX,女，外观无明显畸形，生长发育迟缓，肌张力低，哭声低，心脏畸形，通贯掌,C
16、ase 2,CMA结果： arr7p11.2q22.1(57,877,585-98,919,233)x3 (41,042 kb),该重复片段包含染色体7q11.23重复综合征（chr7:72,744,455-74,142,672）：该综合征临床表现变化大，可见严重的语言表达障碍，轻微颅面异常，先天性心脏病，膈疝，精神发育迟缓等。,Case 3,患儿核型：46,XX,16qh+ 父母核型正常 CMA结果： arr 1p36.33p36.32(849,466-3,422,816)x1 (2,573kb)： 致病性 arr 14q32.33(106,072,250-106,736,227)x3 (6
17、60kb) ： 良性多态性,产前：脐带螺旋20周，生长受限，足月剖腹。 产后：新生儿肺炎，低体重，肌张力正常，追视较好，互动正常，室间隔缺损，动脉导管未闭，头型扁平，双眼小，眼距宽，鼻梁低，耳位低，口唇薄，抬头差,1号染色体缺失片段部分病例的临床表现为：脑积水，智力障碍，肌张力减退，全身性发育迟缓，面部畸形等。,Case 4,53,男，1岁9个月，面容异常，肌张力异常，双下肢肌张力高，母亲孕期脐带呈麻花状扭转。外院产前染色体检查正常（自述）,CMA结果： arr 3p26.3p26.1(61,891-6,711,827)x1 （6650kb) 致病性 arr 18q12.1q23(28,710,467-78,013,728)x3 (49303kb) 致病性,相关临床表现：18-三体综合征表现，重度智力低下、消瘦、肌张力低及躯体发育畸形等。,54,染色体核型结果：46,XY,der(3)t(3;18) (p26;q12) mat 母亲核型结果： 46,XX,t(3;18) (p26;q12),Case 4,55,产前诊断的重要性,56,思考题,1、产前诊断的概念及适应症有哪些？ 2、产前诊断的实验室技术主要有哪些？ 3、染色体核型分析用于产前诊断的意义，可诊断哪些疾 病？ 4、荧光原位杂交技术用于产前诊断的优势有哪些？可诊 断哪些疾病？,57,谢谢!,
