1、SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot 检测技术,Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析,Western Blot,Western Blot 简介：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子
2、的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,Western Blot 基本原理,Western Blot应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,Western Blot 流程,蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇
3、、丙酮和丁醇等。,蛋白样品的提取,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。 蛋白质浓度测定的各种方法汇总： ,碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并将Cu2+还原成Cu+； Cu+与BCA结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓度呈正比,BCA法,BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5g/ml），应用更加灵活。 可耐受高达5%的表面活性剂
4、测定不同蛋白样品时比bradford测定法结果均一,BCA法,蛋白样品的变性,2SDS-PAGE上样缓冲液： DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量2050g。,SDS：,阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,蛋白质-SDS胶束的特点：,（1）具有
5、相同的形状，形状像一个长椭圆棒 （2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,不连续的电泳缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单
6、链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。,【SDS-PAGE基本原理】,PAGE：聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三
7、维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。,凝胶成分,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：,单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶,聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化
8、学催化（核黄素TMTED）体系。,不连续电泳：,电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。,凝胶浓度与蛋白分离范围,SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：,不连续系统,不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,浓缩胶,浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。 当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电泳液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCl解
9、离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。,浓缩胶,电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 Gly- Pro- Cl-,-,+,分离胶,孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电厂消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子量不同,通过分
10、离胶受到的阻力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白的分子量不同而分开.,-,+,积层胶,分离胶,Pro1- Pro2 Gly- Cl-,灌制分离胶 隔绝空气,灌制积层胶 插入梳子,3.电泳,电泳条件： 推荐：浓缩胶 80V 3545min 分离胶 120V 4575min,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色,染色和脱色,电泳后的凝
11、胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片,转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。,转移膜的选择,最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍： ,湿转系统,半干转移系统,电转,电转,
12、转膜条件： 推荐：100V ，12小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。,转膜后检测（此步可以省略）,转膜后检测：（立春红染色）,为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。,1x立春红 5min,染色前,染色后,封闭,为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（TBST） Tween-
13、20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,一抗、二抗孵育,把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次5min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP),辣根过氧化物酶法（HRP） 辣根过氧化物酶-DAB法: DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀
14、. 显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带 终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.,化学发光显色法(HRP) 辣根过氧化物酶-ECL法: 增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光原理,将结果记录下来。,显色（结果检测）,滴加ECL工作液,显影、定影,常见问题,SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度
15、合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,SDS-PAGE电泳,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,转移到膜上的蛋白很少,背景太高,杂交信号很弱,出现非特异带,Further Readings,生物秀Western Blotting专题 Millipore的蛋白印迹手册 Bio-Rad的western Blotting操作手册 Western blot问题解答专帖 ,THANK YOU!,
