1、1,男性精液分析技术 新进展,2,WHO1,1980,出 版 背 景,1987,WHO2,2010,WHO5,WHO4,1999,出 版 背 景,出 版 背 景,出 版 背 景,以往版本存在的问题 检测方法不一 结果带有主观性：不客观、不真实 精确度低、重复性差 对男性生育力的评估、临床诊断应用价值很有限,出 版 背 景,随着近几年男科学和生殖医学的发展，基于循证医学应用，不少原有的概念和诊疗评价需要修订 WHO成立专门委员会编写修改新一版手册，以期达到更好的标准化，提高精液分析的质量,WHO5th 主 要 内 容,精液分析 标准程序 可选择性实验 研究性实验 精子制备 精子制备 精子冷冻 质
2、量保证 附录,WHO5th 主 要 内 容,精液分析： 标准程序：精液采集和初步肉眼观察、精子浓度和精子总数的测定、精子活力分级、精子形态学评估、非精子成分 可供选择的试验：多重精子缺陷指数、WBC免疫细胞化学染色、精子宫颈粘液相互作用、精浆生化、CASA 研究实验：活性氧、顶体反应、精子卵细胞相互作用、精子透明带结合、去透明带仓鼠卵穿透试验、精子染色质检测,WHO5th 主 要 内 容,精子制备： 精子制备技术：精子的洗涤、直接上游法、非连续密度梯度法 精子冷冻保存：冷冻方法、保护剂配制 质量保证： 内部质量控制 外部质量控制 附录：参考值、生物安全、质控图的使用等,精子浓度和精子总数的测定
3、,精子浓度 精子密度改为精子浓度 增加计数池的面积，每份标本均采用两次取样、两次稀释和两次计数，每次计数至少200个精子，且两次计数在95%可信区间 精子总数：强调一次射精的精子总数能够反映睾丸生精功能，因次必须准确测定精液的体积,10,精子浓度和精子总数的测定,年轻人 老年人 差异 精子浓度 (106/ml) 73 64 NS 精液量 (ml) 3.2 1.8 P0.05 精子数量 (106/总数) 206 74 P0.05 Ng et al. 2004,精 液 体 积 的 测 量,推荐： 称重后按1.0g/ml比重换算为体积（1.043-1.102g/ml）,精 液 体 积 的 测 量,X
4、,X,X,不推荐的方法： 在收集管（杯）中转移,对 显 微 镜 的 要 求,精子浓度和活力必须使用相差显微镜 无论是手工方法还是CASA都要求使用,20倍正相差物镜下精子图像,精 子 计 数 的 要 求,推荐使用改良牛鲍氏计数板 制备两份分别稀释的样本 不能将同一份稀释样本加入到两个计数池内 不要两次计数同一计数池,精 子 计 数 的 要 求,只对完整精子（包括头和尾）进行计数 以精子头部位进行计数，尾的定向不重要，方格的边界由三线的中间线标明，计数精子头的大部分位于两条内线之间，而并非大部分头部在两条外线之间 为避免相邻方格内的同一精子的重复计数，头部位于划分两个相邻方格线上的精子，应只计两
5、条垂直界线之一上的精子。例如，精子大部分的头部位于L型，中央界线或在其左边的，可计数，而中央界线上方或右边的不予计数,精 子 计 数 的 质 控 要 求,每份标本重复取样2次，分别计数200个精子，计数结果符合要求的，结果可以接受（取两次的均值） 超过误差范围的必须重新取样重复计数2次,对于一定总数两个重复计数可接受的差异p32页,精子计数可接受误差的应用,例1: 第1个计数池计数201个精子 第2个计数池计数245个精子 两次总数为201+245=446 两次计数差为245-201=44 查表总数为446时，预期随机误差不能超出41 所以需要重新制备稀释标本重新进行计数,精子计数可接受误差的
6、应用,例2： 第1个计数池计数220个精子 第2个计数池计数218个精子 两次总数为220+218=438 两次计数差为220-218=2 查表总数为438时，预期随机误差不能超出41 所以计数的数值是可以接受的，即取二者的均值计算精子浓度,低 精 子 浓 度 标 本 的 计 数,精子浓度过低，需要检测更多个视野 如果每高倍镜视野精子数小于4个，可不考虑精确计数，给出浓度约小于1106/ml 即可,活 力 的 分 类,精子活力的分级： 前向运动精子（PR）：精子运动活跃、线性运动或者在较大的范围内运动,不考虑运动的速度 非前向运动精子（NP）：精子运动但不活跃，如精子在较小的范围内运动，精子头
7、部轻微移位或仅有鞭毛摆动 不运动精子（IM）：精子完全不动,精 子 活 力 分 析 的 质 控,每份标本重复取样2次，每次至少计数200个精子，以常见活力类型为评价对象，结果符合要求的，可以接受（取2次的均值） 超出误差范围的重新取样2次重复分析,重复计数200个精子（总数400）确定平均值的两个百分率之间的可接受差异p19页,精子活力分析百分比的计算要求,百分比要调整为最接近的整数 若百分比是0.5%则将其调整至最接近的偶数，如将32.5%调降至32%，而将3.5%调升至4% 这些四舍五入成的百分比全部加起来可能不等于100%,精子活力分析可接受误差的应用,例1： 重复计数200个精子评估精
8、子的活力结果如下： PR型精子分别是30%和50% NP型精子是5%和15% IM型精子是65%和35% 最常见活力级别是IM型，均值为50%，差值是30% 在均值为50%的情况下，随机误差的上限是10%，得出的差异超出10%，应需重新制作两份标本进行评估,26,精子活力分析可接受误差的应用,例2： 重复计数200个精子评估精子的活力结果如下： PR精子分别占37%和28% NP精子分别占3%和6% IM精子分别占60%和66% 最常见活力级别是IM型，均值为63%，差值是6% 在均值为63%时，随机误差上限是10%，结果是可接受的 报告结果如下：运动型精子占32%，非运动型精子占4%，完全不
9、动型精子占63%（构成比不到100%）,精 子 形 态 分 析,推荐使用Papanicolaou、shorr或Diff-Quik染色 每份标本制备双份涂片进行重复分析 每张涂片至少分析200个精子 两次分析结果的差异在允许范围内的，最终结果取两次的均值；超出允许范围的需要重新读片（不必重新制片）,28,精 子 形 态 学 评 估 标 准,精子包括头、颈、中段、主段和末端 由于通过光学显微镜很难观察到精子末端，因此可以认为细胞是由头（和颈）和尾（中段和主段）组成 只有头和尾都正常的精子才认是正常的 所有处于临界状态的精子均认为是异常,人类精子结构图,精 子 形 态 学 评 估 标 准,由于人精子
10、形态的多样性，造成精子形态评估的困难。精子形态的标准是从性交后宫颈粘液回收的精子，或者从卵子透明带回收的精子来定义的，这样的精子具有潜在受精能力 在评估精子正常形态时应采用严格标准（Kruger et al.,1986; Menkveld et al., 1990; Coetzee et al., 1998）,精 子 形 态 学 评 估 标 准,（a，b）在体外从透明带中回收的精子（c）性交后从宫颈内粘液中收集的精子，用巴氏染色法染色,精子形态学分析包括以下步骤,精液涂片的制备 固定和染色 封片 精子形态评估（应制备双份涂片重复评估，每张涂片应评估至少200个精子） 双份片评估（百分率）结果比
11、较（差异是否在可接受范围内，如果不可接受，重新读片） 取平均值，报告结果,精液涂片的制备,充分混匀精液样本。 快速取样，避免精子从混悬的精液样本中沉降。 重复取样前，再次混匀精液样本。 根据精液样本具体不同情况，采用不同的涂片方式。,（a） 对于未稀释的精液，采用拉薄技术，将一滴精液（S）沿成角的载玻片背侧边缘展开，向前拖拉制成涂片。 （b） 对于洗涤的精液，采用滴管法，水平持滴管（P）推进，将一滴精子悬液（SS），沿载玻片的表面展开。,正常精液标本,使用拉薄技术，取一滴精液在载玻片的表面上涂片。 磨砂载玻片的两面，用不起毛软纸擦干净。 用HB或No.2铅笔，在载玻片的磨砂处标记上身份编号、日
12、期。 根据精子密度，取5-10l的精液滴在载玻片的一端。用第二张载玻片作为拉片，沿着载玻片的表面拖拉精液滴。 涂片经空气干燥后，立即固定、染色。,一开始，可以用10l的精液，45角度，一秒钟的时间涂片 为了减少涂片上精子间的相互重叠，如果需要，可以改变上述参数（10l，45，1秒） 精液的粘稠度越低，涂片的拉薄技术发挥得越好，拉薄技术不适用于高度粘稠的精液,拉薄技术,精子密度低的标本 假如精子密度低于2106/ml，浓缩标本 粘稠精液标本 精浆高度粘稠时涂片往往是厚而不均，可以按与液化不良精液标本相同的处理方法或者使用洗涤的方法处理。,染色方法,推荐的染色方法有 Papanicolaou染色法
13、 Shorr染色法 Diff-Quik染色法。,用上述三种染色方法，在光学显微镜亮视野下观察，精子头部的顶体区染成淡蓝色pale blue，顶体后区染成深蓝色dark blue，中段可能染成红色，尾部染成蓝色或淡红色reddish。通常位于头部背后或中段周围的胞浆小滴染成粉红色、红色（巴氏染色）或者橘红色（Shorr染色）。,改良巴氏染色步骤,1、80%乙醇 30秒 2、50%乙醇 30秒 3、纯水 30秒 4、Harris苏木精 4分钟 5、纯水 30秒 6、酸性乙醇 48次* 7、流水洗 5分钟 8、50%乙醇 30秒 9、80%乙醇 30秒,10、95%乙醇 至少15分钟 11、橙黄G6
14、 1分钟 12、95%乙醇 30秒 13、95%乙醇 30秒 14、95%乙醇 30秒 15、EA-50 1分钟 16、95%乙醇 30秒 17、95%乙醇 30秒 18、100%乙醇 15秒 19、100%乙醇 15秒,主要溶液的作用,乙醇 固定细胞；并且使细胞脱水 苏木精 使细胞核染成蓝色 酸性乙醇 去除胞浆中非特定区域的染料 （脱色） 自来水 去除未与细胞核结合的苏木精 橙黄G-6 使胞浆染成粉红色 EA-50 使胞浆染成粉红色,WHO第4版与第5版巴氏染色主要步骤比较,1、第5版共19步，第4版共23步，减少了4个步骤。 2、由于苏木精后没有流水冲洗，导致染液残留较多，酸性乙醇的更换频
15、率明显增加。 3、第5版染色所需时间较4版约增加10分钟以上。 4、染色效果相似。,WHO第4版与第5版巴氏染色总结,WHO第4版与第5版染色效果比较,WHO第4版,WHO第5版,精子封片前的处理,有两种液体封片剂：溶于乙醇的和不溶于乙醇。 使用溶于乙醇的封片剂，染色完成后，在涂片未干的情况下立即使用该封片剂进行封片。 使用不溶于乙醇的封片剂，将涂片在二甲苯中浸1分钟（在通风柜中操作），沥干1-2秒钟后立即封片，封片时应保持涂片的湿润。,精子涂片的封片,1、滴2-3小滴封片剂在载玻片上。 2、将盖玻片（24 mm 50 mm 或 24 mm 60 mm最合适）直接放置在载玻片上。 3、盖玻片先
16、接触封片剂，从载玻片的长边开始放置，以防止产生气泡。 4、如有需要，轻轻地按压盖玻片的顶端以使气泡移到载玻片的边缘。 5、擦掉载玻片底下多余的二甲苯（如果使用二甲苯）。 6、在通风柜内，把已封片的涂片水平地放在载玻片烘干架上，或者放在吸水纸上干燥24小时。,WHO不同版本精子形态学内容比较,WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较,WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较,WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较,WHO第5版与第4版精子形态学评估标准的主要区别,1、头部外形轮廓判断变的宽松，仅要求大致成椭圆形。 2、对头部空泡的判断更严格，多于2个空泡或者顶头后区空泡，都判断为异常。 3、中
17、段的长度有原来头部的1.5倍缩短为1倍，并且宽度比第4版要更细。 4、尾部只有尖锐的折角才判断为异常，而不再以弯曲角度90度为界限。 5、胞浆小滴的标准无差异。,WHO第5版手册中的精子图谱分析,424个 细 胞,精子：364个,正常：93个,异常：254个,未评估：17个,非精子：58个,头部异常：201个,中段异常：134个,尾部异常：35个,胞浆小滴：12个,未分类：2个,备注： 1、第4版图谱中仅评估47个精子，其中正常精子8个，异常精子39个 2、未评估：由于聚焦不好或精子重叠。 3、非精子细胞包括：巨噬细胞、单核细胞、降解的白细胞、上皮细胞、细菌等,共14 Plate,精子形态学评
18、估,正常形态精子百分率与受精率相关 异常形态精子的类型、部位和程度更重要,1、头部外形,对 于 头 部 异 常 的 描 述,梨形 锥形 扁平底 轮廓不规则,大头针样 无定形头 小头 圆头,2、空泡,多于2个空泡,顶体后区空泡,表面有空泡,空泡20%,3、顶体,顶体70%,顶体40%,对 于 头 部 异 常 的 描 述,对于颈和中段异常的描述,增粗,轮廓不规则,插入,弯曲,1、中段异常,2、胞浆小滴,胞滴小于1/3（CD）,胞滴大于1/3(ERC),对于尾部异常的描述,双尾,环状,卷曲,短尾,粗,弯曲,非精子细胞 （一）,退化的巨噬细胞,多核型白细胞,上皮细胞,杆 菌,单核细胞,吞噬中的巨噬细胞
19、,退化的白细胞,巨噬细胞,精子细胞,生精细胞,精母细胞,分裂中的精母细胞,分裂中的精子细胞,退化的精子细胞,非精子细胞 （二）,未 评 估 精 子,难以聚焦,重叠,未分类细胞,重复计数200个精子（精子总数400）得出的两个百分率平均后可接受的差异,73,精子形态分析可接受误差的应用,例1： 重复计数200个精子后，正常形态精子百分比分别为18%和9% 均值为14%，差值为9% 查表可见均值为14%，样本误差允许范围为7% 本次评估误差超出7%，需要重新评估,74,精子形态分析可接受误差的应用,例2： 重复计数200个精子后，正常形态精子百分比分别为10%和14% 均值为12%，差值为4% 查
20、表均值为12%，样本误差允许范围为7% 本次评估样本误差低于7%，本次评估值可接受，均值12%出报告,75,精 液 参 数,采用3大洲8个国家的400-1900份一年内使女方受孕的男性精液标本的原始数据 在统计方面，由于各项精液参数的高值都不可能对生育产生危害，所以采用单侧参考区间，并以第5百分位数作为参考下限，不像一般统计学分析那样采用双侧参考区间和第2.5百分位数,参 考 值 区 间,双侧：血清 2.5%-95%-2.5% 单侧：精液 5.0%-95%,WHO5手册 精 液 参 考 值 下 限,精 液 参 数,关于WHO5使用中的思考,精子计数分析 “精子密度”改为“精子浓度”表达更准确
21、密度的概念为每单位体积物质的质量，浓度的概念是单位体积内物质的个数，所以用“精子浓度”最为恰当 因此应该用“sperm concentration”，代替“sperm density”来表示精子浓度,80,关于WHO5使用中的思考,精子计数工具 WHO5推荐血球计数池作为精子的计数工具， 但CASA在我国使用率高达80% 血球计数池为一开放池，有一定深度，计数时样本稀释，分析过程受周围环境条件、加样、分析时间、水分蒸发等影响，分析结果偏高 WHO5未考虑和评价男科实验室广泛应用的Makler、Macro、Microcell、cell-vu等使用更加方便,81,关于WHO5使用中的思考,精子计数
22、分析 WHO5精子浓度分析方法和参考值下调的推荐，精子浓度参考值的确定，应考虑地区、种族、环境、气候、季节采样时间的差异。占世界人口1/5的中国未参加调查(张树成教授课题） 精子总数的意义比精子浓度更为重要，我国并未引起重视,82,关于WHO5使用中的思考,精液量测定 用比重法测量精液比重，麻烦、费时、易污染，不易推广（科研必用） 利用转移量筒测量法，丢失精液可达0.3-0.9ml 有刻度广口量杯测量精液体积：可行,83,关于WHO5使用中的思考,精子活力分析 WHO5将精子活力4级分级改为了3级，把WHO4中的a级和b级合并为前向运动精子（PR),这一合并是没有考虑精子前向运动速度 实际上前
23、向运动平均速度是预测男性生育力的重要指标，快速前向运动精子是体外受精（IVF）中有价值的指标,84,关于WHO5使用中的思考,精子活力分析 精子活力分析：由4级分级改为3级分级，方便于手工法检测精子活力 手工法分析十分不准确，主观意向多，CASA分析可获更多信息，而且CASA分析也有利于精子活力分析的质量控制的实施 鉴于目前现状 CASA系统的单位，精子活力沿用4版分级 手工操作单位，精子活力分级改为5版分级,85,关于WHO5使用中的思考,精子活力分析（例2）： 重复计数200个精子评估精子的活力结果如下： PR精子分别占37%和28% NP精子分别占3%和6% IM精子分别占60%和66%
24、 最常见活力级别是IM型，均值为63%，差值是6% 在均值为63%时，随机误差上限是10%，结果是可接受的 报告结果如下：运动型精子占32%，非运动型精子占4%，完全不动型精子占63%（99%）,关于WHO5使用中的思考,染色方法 第5版共19步，第4版共23步，减少了4个步骤 由于苏木精后没有流水冲洗，导致染液残留较多，酸性乙醇的更换频率明显增加 第5版染色所需时间较4版约增加10分钟以上 染色效果相似,关于WHO5使用中的思考,精子形态学分析 WHO5正常精子形态参考值为4%：临床不易把握（正确和严格掌握标准）,88,关于WHO5使用中的思考,小结 WHO5是对目前临床男科实验室已开展或未来将要开展的检测项目的检测原理，具体操作和临床意义等进行了详尽的介绍，还补充了精子制备技术和精子冷藏技术 总的来说 ，WHO5相比前四版手册，是最为全面的修订,89,思 考 题 1,WHO5精子活动力分为几级？如何分级？ 分三级：前向运动精子、非前向运动精子、不运动精子 前向运动精子（PR）：精子运动活跃、线性运动或者在较大的范围内运动,不考虑运动的速度 非前向运动精子（NP）：精子运动但不活跃，如精子在较小的范围内运动，精子头部轻微移位或仅有鞭毛摆动 不运动精子（IM）：精子完全不动,思 考 题 2,WHO5手册男性精液常用参考值下限,92,共同提高！ 互相支持 加强交流,谢谢！,
