1、第第 六六 章章 体外分析技术 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析 10 -12 10 -9 10 -6 10 -3 10 -0 pg/mLng/mLmg/mLmg/mL g/L 免疫分析 Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins 常量微量 超微量 待测物质浓度与检测手段 临床化学分析 10 -12 10 -9 10 -6 10 -3 10 -0 pg/mLng/mLmg/mLmg/mL g/L 免疫
2、分析 Therapeutic Drugs Thyroid Hormone Fertility Hormone Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins 常量微量 超微量 现代医学的发展 疾病诊断的革新 可在没有任何临床症状，而病人体内 发生 1. 基因表达异常； 2. 受体分布异常或受体功能改变； 3. 器官代谢异常； 4. 激素水平异常 酶、神经递质 等异常， 可早期 发现。 体外分析和影像学的发展起了很大 作用 例如 癌症的早期诊断 放射免疫分析法的创立 集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发 应
3、的高特异性 1959 美国Yalow & Berson 1960 英国 Ekims 1977 获诺贝尔医学生物学奖 开创了医学生物学超微量分析方法 使人体内微量生物活性物质的测量成为可能 对现代医学的发展起到推动作用 R：放射性核素标记抗原 高灵敏（10 -9 -15 g/ml） 探测待测物上的标记信号 (标记物的放 大效应) I：免疫学反应 高特异 以抗体为结合剂 B:标记抗原与非标记抗原竞争与同种抗体结 合 定义 以放射核素标记（或其他非放射性标记 ）的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结 合体的结合反应为基础，在试管内进行的 微量生物活性物质的检测技术。 体外分析技术是结合了放射性核
4、素 的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的 一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异 性强、精密度好、应用面广、方法简便等优 点。 方法学基础 结合反应 遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1 R+L RL k2, v2 定量手段 放射性测量技术 酶定量技术 化学发光定量技术 生物学基础 特异性结合反应： 抗原-抗体的免疫结合反应； 配基-受体的结合反应； 底物-催化酶之间的酶促反应； 结合体对： 抗原-抗体 激素-激素结合球蛋白 受体-配体 体 外 分 析 技 术 体外放射分析 体外非放射分析 放射性竞争 结合分析 放射性非竞 争结合分析 放射免疫分析放射免疫分析 (RIA)(RIA) 免
5、疫放射分析免疫放射分析 酶免疫分析酶免疫分析 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 荧光免疫分析荧光免疫分析 (IRMA)(IRMA) (EIA)(EIA) (CLIA)(CLIA) (FIA)(FIA) 第第 一一 节节 放射免疫分析放射免疫分析 (Radioimmunoass(Radioimmunoass ay)ay) Dr. Yalow 在体外条件下, 利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab 的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量 的一种超微量分析技术。 一、基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag Ab Ag + + *Ag-Ab + *Ag (B)(F) 4*Ag与Ag
6、 免疫活性相同 4*AgAg Ab Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag 90% 2）半衰期足够长 3）保持原有抗原的特性 大分子：125I 小分子：3H or 125I 3.非标记抗原 （标准品） 化学结构、免疫活性与被测抗原相同 高纯度 B和F 的分离1、第一类 2、第二类 双抗体沉淀法 PEG沉淀法 固相第二抗体法 二、基本方法 + Ag Ab(1) Ab(2) Ab(2 ) Ab(1) Ag 可溶性复合物 可沉淀复合物 试管 试管 分离方法的要求 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过 程中不使抗原-抗体
7、复合物解离或形成新的复合 物。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 三、质量控制（quality control） 1、精密度（ precision） 变异系数（ CV ） 7%10% 2、准确度（accuracy） 回收率=测定值/真实值100% 90%110% 3、灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量 4、特异性（specificity） 交叉反应率 5、可靠性（validity） 平行性试验 6、稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 A B C 质量控制就是使用合适的方法以 检查、表示和消除来自试
8、剂药盒和测量体系 的误差，并使这种误差降低到某一允许水平 。 具体作用有： 1检查误差的程度，决定测定结果的取 舍。 2识别误差的来源并消除其原因。 3改进测定方法的设计以提高质量。 RIA 小 结 灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便 第二节 免疫放射分析法 *Ab + Ag-*Ab + *Ab （immunoradiometric assay,IRMA） B% Ag （B）（F） 在体外, 利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性 复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。 IRMA与RIA工作原理的主要区别 RIAIRMA 竞争性抗原抗体结合反应非竞争性
9、抗原抗体结合反应 采用标记 抗原采用标记 抗体 三种主要反应试剂二种主要反应试剂 所用抗体是限量的所用抗体是过量的 *AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关 反应到达平衡慢反应到达平衡快 非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区 低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素 B% B% 拟合的标准曲线 拟合的NSB 拟合的标准曲线 拟合的NSB IRMA的标准曲线及 非特异结合曲线 RIA的标准曲线及 非特异结合曲线 IRMAIRMA和和RIARIA低剂量区的不确定因素示意图低剂量区的不确定因素示意图 RIA + + 或 01 IRMA + 1 非放射
10、性标记免疫分析技术 酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术 一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗 体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其 中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA） 。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应 的高敏感性的检测技术。 ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行 与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离 结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子 的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光 度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又 和复合物的量成正比。 常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四 甲基联苯胺 (T
11、MB) ，反应后显黄色。 二、化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术是以化学发光物 质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析 技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用 下能形成激发态产物，并在退激时将能量转 化为光子的物质。 1.化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标 记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下 化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光 子放射。检测光子的数量就可以反映复合物 的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和 吖啶酯。 2.化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标 记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的 复合物作用于特殊的底物-金刚烷，使底 物发射出光子
12、。 此法光子发射持续时间较长，可 靠性比较好。 3.电化学发光免疫分析(略) 4.生物发光免疫分析(略) 三、时间分辨荧光免疫分析技术 （time-resolved fluoroimmunoassay） 时间分辨荧光免疫分析采用时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素稀土元素标记抗体标记抗体 ，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得 稀土元素稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光 物质的干扰。物质的干扰。 标记物为具有独特荧光特性的标记物为具有独特荧光特性的 稀土金属稀土金属镧系元素镧系元素 镧系元素共有15种，
13、应用在时间分辨荧光免疫技 术种有四种 : 钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（ Te） 镧系元素荧光重要特点： 1. 极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质 ：10ns 2. 200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3. 狭窄的发射峰 4. 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 时间分辨荧光免疫分析技术 （time-resolved fluoroimmunoassay） 一、基 本原理 镧系元素（15）：铕（Eu），钐 （Sm），镝（Dy），鋱（Te） Eu + Eu Eu +增强液
14、+ Eu “解离增强镧系荧光免疫分析” 时间分辨荧光检测的基本原理示意图 荧光衰退时间 铕：730000 ns 钐：50000 ns 一般荧光物质：10 ns 铕的荧光 二、TrFIA的特点 1. 最大限度提高测量方法的灵敏度 2. 有与RIA相似的特异性和精密度 3. 可同时测定两种以上的抗原 4. 无辐射污染 DELFIADELFIA技术的特点为临床检测带来的先技术的特点为临床检测带来的先 进性进性 技术术特点检验检验 先进进性 时间时间 分辨 波长长分辨 将特异性荧荧光与非特异性荧荧 光分离开 零背景 高特异性 解离-增强荧荧光性大大提高 稳稳定的荧荧光螯合物 线线性范围围更宽宽 重复性
15、更好 低分子量原子 标记标记 标记标记 位点多可达20个 对标记对标记 物的结结构与活性影响 小 无衰变变 受环环境影响小 灵敏度更高 高稳稳定性，高精确度 试剂试剂 保质质期至少一年 标标准曲线线保留时间长时间长 同一批次只需两点定标标 多标记标记单单，双，三，四标记标记一个试剂试剂 盒可同时测时测 多 个项项目 总结： 体外分析的发展 方法设计的改变：竞争结合分析 非 竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析 标记物的改变：放射性核素 荧光、 酶、化学发光、稀土元素 结合体的改变 微生物 RMA 酶 REA 受体 RRA 特异结合蛋白 CPBA 改变结合体对 放射性技术 Ag Ag-Ab RIA + Ab 免疫学技术 Ag Ag-Ab 改变标记物 第一阶段 第二阶段 第三阶段 小分子半抗原联接125I 单克隆技术 固相技术 药品化Kit 理论与实践上更丰富更完善的RIA 1. 可测物达300多种 2. 涉及多个临床与基础学科 3. RIA显像 4. RIA治疗 荧光 FIA IRMA 化学发光 CIA 酶 EIA 谢 谢!
