1、1第一章、植物病原真菌的分离、第一章、植物病原真菌的分离、培养及纯化技术培养及纯化技术21 1）材料：）材料：马铃薯马铃薯200g200g、葡萄糖、葡萄糖20g20g、琼脂、琼脂20g20g、水、水1000ml1000ml1、马铃薯葡萄糖琼脂（、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基）培养基马铃薯葡萄糖琼脂：马铃薯葡萄糖琼脂：potato dextrose agar,简称简称PDA；马铃薯蔗糖琼脂：马铃薯蔗糖琼脂：potato sucrose agar,简称简称PSA。一、一、真菌学研究中常见的真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌培养基的制作和灭菌342 2）制作步骤）制作步骤马铃薯洗净，去皮称马铃
2、薯洗净，去皮称200g200g切块切块/条，条，1000ml1000ml水煮沸水煮沸30min30min，用双层纱布滤去薯块，用双层纱布滤去薯块，加入加入15-20g15-20g琼脂，加热熔化，再加琼脂，加热熔化，再加20g20g葡萄糖，葡萄糖，待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤，待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤，补水并定容到补水并定容到1000ml,1000ml,分装于三角瓶或试管中，分装于三角瓶或试管中，塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。5自然自然pH；调调pH值值，也可用也可用1mol/L的的NaOH或或HCl调至调至pH为为5.56.5之间，
3、最后加水补足至之间，最后加水补足至1000mL。Tips:实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。免使用。62、植物组织和煎汁、植物组织和煎汁 许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用。能做培养基使用。植物煎汁是很
4、好的培养基，可以满足普通微植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，液，如加琼脂即能制成固体培养基。如加琼脂即能制成固体培养基。当然，必须当然，必须灭菌后灭菌后才能使用。才能使用。73、培养基的分装、培养基的分装根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶中。或三角瓶中。试管分装时，使用玻璃漏斗。试管分装时，使用玻璃漏斗。装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的分装量为管高的1/5左右左右，用三角瓶分装培养基时，用
5、三角瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的容量不宜超过容积的1/3-1/2。注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。湿棉塞而引起污染。8制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。4、灭菌、灭菌高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：15磅磅/英寸或英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续持续15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干晾干/烘干烘干、包装好，进行干热灭菌。、包装好，进行干热
6、灭菌。灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。化学灭菌、以及辐射灭菌等。9 滤膜孔径主要有滤膜孔径主要有0.22 0.22 m m和和0.450.45m m两种。过两种。过滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。10115 5、斜面、平板培养基的制作、斜面、平板培养基的制作试管培养基试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/52/5至至3/53/
7、5，冷凝后即成斜面培养基。冷凝后即成斜面培养基。三角瓶三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。培养基。方法是方法是：将培养基冷却至：将培养基冷却至45455050（低于（低于4545易凝固，应在易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养
8、基约好伸入，倾入培养基约15mL15mL，平置、凝固即成。，平置、凝固即成。注意：操作者事先必须洗净手，并用注意：操作者事先必须洗净手，并用70%70%酒精消毒。酒精消毒。12二、真菌分离二、真菌分离 植物病原菌的植物病原菌的分离培养，是植物分离培养，是植物病理实验室工作中病理实验室工作中的基本技能。的基本技能。13真菌的分离真菌的分离-就是将所需要的真菌与其它杂菌就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。培养。一般是根据该微生物对一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活
9、条件，等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。的环境，从而得到纯菌株。14 观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出作出诊断诊断。同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面生长的生长的腐生性
10、腐生性真菌。真菌。因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。性。此外，为了此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生态，态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培养物是必要的。培养物是必要的。（一）目的意义（一）目的意义15分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下进行。进行。（二）、真菌分离的程序（二）、
11、真菌分离的程序1 1分离前的准备工作分离前的准备工作161.1 1.1 清洁环境：清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，分离工作严格说应在无菌条件下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。为了保证无菌操作，应注意下面几点：为了保证无菌操作，应注意下面几点：1.2 1.2 若限于条件实验只能在若限于条件实验只能在普通房间普通房间进行时，必进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些地上多洒些水水，以消除室内尘埃，工作台上铺好，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿毛巾湿毛巾，点燃酒精灯。，点燃酒精灯。
12、171.3 1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；1.4 1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；1.5 1.5 无菌操作前还要用无菌操作前还要用7070酒精擦手；酒精擦手；1.6 1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。要说话等。18分离材料的选择对分离培养的成败有着决
13、定的影响。分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。病害材料应尽可能新鲜病害材料应尽可能新鲜，如可选择，如可选择新近发病新近发病的植株、的植株、器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。最好在病、健交接处选材取样最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。跃，容易分离成功。2 2分离材料的选择分离材料的选择19 例如：例如：果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂
14、的部分分离。根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较远的部分分离。远的部分分离。值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到病菌的。当然，这类病害是比较少的。病菌的。当然，这类病害是比较少的。从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部分病害都是适用的。分病害都是适用的。20 采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可采得的材料如已经败坏而沾染大量的
15、腐生菌，有时可以以采用接种后再分离的方法采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织，即将沾染有腐生菌的病组织作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得较多的是植物病原细菌的分离。得较多的是植物病原细菌的分离。引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属和疫霉属(Phytophthora)的真菌，用这种方法分离的效果也很好。的真菌，用这种方法分离的效果也很好。分离烟草的根腐病菌分
16、离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，用这种方法效果也很好，将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平板上，病菌即生长而得到纯培养。平板上，病菌即生长而得到纯培养。21 （1 1）酒精酒精 用用酒精（酒精（70%70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟消毒，只浸很短的时间（几秒钟到到1 1分钟），然后用灭菌水冲洗；分钟），然后用灭菌水冲洗；较大的材料较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞往
17、往是在酒精中浸过后，或用棉花塞蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧去。去。3 3组织的表面消毒剂组织的表面消毒剂22配方为：配方为：升汞升汞 1g1g，浓盐酸浓盐酸 2.5mL2.5mL，加水加水 至至 1000mL1000mL。将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀释。稀释。升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红染料。几滴红染料。消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般况而异，一般3 35 5分钟。消毒
18、后用无菌水冲洗分钟。消毒后用无菌水冲洗3 34 4次。次。（2 2）升汞溶液（升汞溶液（0.1%）23（3 3）次氯酸钠次氯酸钠NaClONaClO3 3 由于漂白粉的成分不固定而影响其消毒效由于漂白粉的成分不固定而影响其消毒效果，目前多改用次氯酸钠果，目前多改用次氯酸钠.消毒所用的浓度一般是消毒所用的浓度一般是3%-5%3%-5%的水溶液，消的水溶液，消毒时间毒时间5-155-15分钟分钟。幼嫩的幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短消毒时间应尽量缩短。比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌比较安全
19、的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水洗水洗8 8、9 9次。次。244 4常规分离方法常规分离方法植物病原真菌的分离方法主要有两种：植物病原真菌的分离方法主要有两种：组织分离法组织分离法和和稀释分离法稀释分离法。组织分离法组织分离法是最常用的方法是最常用的方法.稀释分离法稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。的病原真菌的分离。25植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。洗过以后，移殖在琼脂培养基平板
20、上培养。切取组织的大小要适宜，一般可将较大的切取组织的大小要适宜，一般可将较大的组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭菌水洗过以后培养。菌水洗过以后培养。4.1 4.1 组织分离法组织分离法261 1）选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成选取典型的病组织，在病健交界处将其剪成5mm5mm5mm5mm的小方块若干，装于火焰灭菌的小碟中。的小方块若干，装于火焰灭菌的小碟中。注注:选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分入的机会。腐生菌一般在发病很久
21、而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。植物病原真菌的植物病原真菌的组织分离组织分离的技术与步骤：的技术与步骤：272 2）向装有病组织的小碟中加入向装有病组织的小碟中加入70%70%酒精酒精（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉酒精。酒精。注注:先用先用7070的酒精浸的酒精浸2 2、3s3s是为了消除寄主表面的气泡，是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，减少表面张力，7070的酒精亦用于表面消毒，处理的时间的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短较短(一般数秒至一般数秒至l
22、min)lmin)。283 3）向小碟中加入向小碟中加入0.1%0.1%升汞或升汞或10%10%次氯酸钠次氯酸钠溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间可自可自3030秒至秒至3 3分钟不等，然后倒掉废液。分钟不等，然后倒掉废液。注：升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自注：升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s30s至至30min30min不等，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则不等，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些一般情况下，需时间可长些一般情况下，需时间3 3、5min5min。294 4）向小碟中加灭菌水，冲洗向小碟中加灭菌水，冲洗
23、3-43-4次（次（除去除去残留的消毒剂残留的消毒剂），将病组织转移到灭菌滤将病组织转移到灭菌滤纸上吸去多余的水（纸上吸去多余的水（以大大减少病组织附近以大大减少病组织附近出现细菌污染出现细菌污染）。305 5）将吸干水分的病组织移到预先倒好的）将吸干水分的病组织移到预先倒好的PDAPDA平板上，注意要用平板上，注意要用镊子轻压组织镊子轻压组织使其着使其着靠在培养基上。靠在培养基上。316 6）每皿）每皿5 5块，均匀摆放，块，均匀摆放，倒置倒置于于2525培养箱中培养箱中培养。培养。4-54-5天后检查结果。写明日期、姓名等。天后检查结果。写明日期、姓名等。32各种真菌病害发生的部位和症状不
24、同，其分离要各种真菌病害发生的部位和症状不同，其分离要根据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典根据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典型材料的分离法。型材料的分离法。4.1.1 4.1.1 斑点病病原真菌的分离斑点病病原真菌的分离4.1.2 4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离维管束组织内病原真菌的分离4.1.3 4.1.3 根腐病菌的分离根腐病菌的分离4.1.4 4.1.4 肉质组织中病菌的分离肉质组织中病菌的分离4.1.5 4.1.5 种子内病菌的分离法种子内病菌的分离法334.1.1 4.1.1 斑点病病原真菌的分离斑点病病原真菌的分离 从病斑切取每边约从病斑切取每边约3-5m
25、m3-5mm的小块病组织，用的小块病组织，用70%70%的酒精浸几秒钟，再在的酒精浸几秒钟，再在0.1%0.1%的酸性升汞水溶液的酸性升汞水溶液中浸中浸3-53-5分钟；而后用灭菌水换洗分钟；而后用灭菌水换洗3 3次，将其移置次，将其移置在琼脂培养基平板上培养。在琼脂培养基平板上培养。344.1.2 4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离维管束组织内病原真菌的分离35 从根茎维管束组织从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主分离病菌，可先将寄主病部表面用病部表面用7070酒精酒精擦擦拭消毒，将表皮组织用拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的后切取其中小块变
26、色的维管束组织，用升汞或维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培菌水冲洗几次，移置培养基面上。养基面上。364.1.3 4.1.3 根腐病菌的分离根腐病菌的分离 根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。材料小的可以仿照斑点病的分离法。材料小的可以仿照斑点病的分离法。材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。374.1.4 4.1.4 肉质组织中病菌的分离肉质组织中病菌的分离 多肉的茎、根和果实等，可以采用维管束组织内多肉的茎、根和果实等，可以采用维管束组织内病菌的分
27、离法，除去表面组织，切到其中小块病组织病菌的分离法，除去表面组织，切到其中小块病组织分离。分离。如有杂菌感染可如有杂菌感染可采用采用“直接接种直接接种”法，待出现症状法，待出现症状后，用此法再行后，用此法再行分离。分离。3839种子如在种子如在未破裂未破裂的的果荚内，可以果荚内，可以不经不经过过表面消毒，在无表面消毒，在无菌的条件下取出移菌的条件下取出移在培养基平板上培在培养基平板上培养。养。4.1.5 4.1.5 种子内病菌的分离法种子内病菌的分离法 将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒（升汞或漂白粉），用灭菌水洗涤后移在琼脂培（升汞或漂白粉），用灭菌
28、水洗涤后移在琼脂培养基平板上培养。养基平板上培养。40 稀释法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分离稀释法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分离细菌和酵母菌细菌和酵母菌等。等。4.2 4.2 稀释分离法稀释分离法植物病原真菌的分离植物病原真菌的分离一般很少用稀释法分一般很少用稀释法分离，但有些产生大量离，但有些产生大量孢子孢子的病原真菌和霉的病原真菌和霉菌，可以配成孢子悬菌，可以配成孢子悬浮液稀释分离。浮液稀释分离。41方法：方法：用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液，悬浮液，用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平用无菌移液管或滴管吸
29、取一定体积的菌液至平板培养基上，板培养基上，然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至倾入融化后冷却至4545的培养基，的培养基，轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。424.2.1 4.2.1 孢子分离法孢子分离法 产生大量孢子的病菌如青霉属产生大量孢子的病菌如青霉属(PenicilliumPenicillium)、交链孢属、交链孢属(AlternariaAlternaria)、小丛壳属、小丛壳属(GlomerellaGlomerel
30、la)、拟茎点霉属、拟茎点霉属(PhomopsisPhomopsis)及茎点属及茎点属(PhomaPhoma)等，则可配制成孢子悬浮液等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或以稀释法或划线法分离。划线法分离。43 许多真菌的孢子在成熟时有许多真菌的孢子在成熟时有弹射弹射的作用，这样就可以的作用，这样就可以将产生孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面或者悬挂将产生孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面或者悬挂在上面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。在上面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。44典型的是担典型的是担子菌亚门大子菌亚门大型真菌担孢型真菌担孢子的分离和子的分离和获得：获得：担孢担孢子无色或有
31、子无色或有色，浅色的色，浅色的担孢子需要担孢子需要成团堆积时成团堆积时方能辨识，方能辨识，一般是依靠一般是依靠“孢子印孢子印”。45 为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。液，然后用稀释法或划线法分离。4.2.2 4.2.2 土壤带菌分离法土壤带菌分离法 46稀释倒平板法示意图稀释倒平板法示意图47稀释涂布法示意图稀释涂布法示意图481.dilute sample1 ml9 ml10
32、100 1000 104 105 106 1072.plate out 0.1 ml 平板稀释法平板稀释法49图图 平板划线分离法平板划线分离法1.1.斜线法斜线法 2.2.曲线法曲线法 3.3.方格法方格法 4.4.放射法放射法 5.5.四格法四格法50平板划线方法示意图平板划线方法示意图51 分离真菌时经常有细菌污染。将培养基调节分离真菌时经常有细菌污染。将培养基调节至酸性反应，如在至酸性反应，如在10ml10ml培养基中加培养基中加1-21-2滴滴25%25%的乳的乳酸，可使大部分细菌受到抑制，而并不影响真菌酸，可使大部分细菌受到抑制，而并不影响真菌的生长。的生长。4.3 4.3 细菌污
33、染的排除细菌污染的排除52培养基中加适当的抗菌素是抑制细菌生长很有效的方法。培养基中加适当的抗菌素是抑制细菌生长很有效的方法。加加金霉素金霉素(30ug/ml)可抑制多数细菌的生长，可抑制多数细菌的生长，加加青霉素青霉素(20ug/ml)可抑制革兰氏阳性细菌的生长，可抑制革兰氏阳性细菌的生长，加加多粘霉素多粘霉素B(5.0ug/ml)可抑制可抑制G阴性细菌的生长，阴性细菌的生长，加加链霉素链霉素(40ug/ml)或或氯霉素氯霉素(50ug/ml)可以抑制大部分细可以抑制大部分细菌的生长。菌的生长。除去除去氯霉素氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养
34、基灭菌后并冷却到灭菌后并冷却到45左右时加入左右时加入(以手背触三角瓶感到烫，以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜但尚可以忍耐为宜)。535、内生真菌的分离、内生真菌的分离 先将健康组织，如：叶片和茎，用自来水冲洗干净、晾干先将健康组织，如：叶片和茎，用自来水冲洗干净、晾干水分后水分后,剪成约剪成约1.5cm1.5cm的小片的小片(叶叶)或或1.5cm长的小段长的小段(茎茎)。按下列程序进行表面消毒。按下列程序进行表面消毒:70%酒精漂洗酒精漂洗30s0.1%升汞漂洗升汞漂洗1min 70%酒精漂洗酒精漂洗30s无菌水冲洗无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分次，在无菌滤纸上吸干水分。将上述处
35、理过的材料在无菌状态下剪切成将上述处理过的材料在无菌状态下剪切成0.5cm0.5cm 小小片（剪去片（剪去0.5cm的边缘），或的边缘），或0.30.5cm长段移植于含链霉长段移植于含链霉素的供试培养基上（素的供试培养基上（PDA、Czapek、煎汁培养基）、煎汁培养基）,于于261黑暗条件下培养，待组织块边缘有菌丝长出后，黑暗条件下培养，待组织块边缘有菌丝长出后，及时挑取菌丝尖端转入及时挑取菌丝尖端转入PDA平板上培养。平板上培养。54 用丝瓜诱发瓜果腐霉：用丝瓜诱发瓜果腐霉：Pythium aphanidennatum6 6、土壤真菌的诱发技术、土壤真菌的诱发技术与步骤：与步骤：E E、进
36、一步纯化，保存备用。、进一步纯化，保存备用。D D、在、在2525下放置下放置4-54-5天后，瓜上长出大量白色棉絮状的天后，瓜上长出大量白色棉絮状的菌丝体，即为所需真菌。菌丝体，即为所需真菌。C C、将丝瓜切段，切口端插入土中。、将丝瓜切段，切口端插入土中。B B、加入少量自来水，将菜园土混合成糊状。、加入少量自来水，将菜园土混合成糊状。A A、将菜园土装于玻璃杯中（约半杯）、将菜园土装于玻璃杯中（约半杯）551 1）先用剪刀将每粒大麻籽一分为二，然后在水中煮沸，）先用剪刀将每粒大麻籽一分为二，然后在水中煮沸，进行简单灭菌。进行简单灭菌。7 7、水生真菌的诱发技术与步骤：、水生真菌的诱发技术
37、与步骤：4 4）进一步纯化，保存备用。）进一步纯化，保存备用。3 3）2 2天后开始换水，即将培养皿中的混合水全部倒掉，再天后开始换水，即将培养皿中的混合水全部倒掉，再加入约加入约15ml15ml灭菌水，以后每天换灭菌水一次，一般灭菌水，以后每天换灭菌水一次，一般4-54-5天天后即可从大麻籽上长出菌落，通常为后即可从大麻籽上长出菌落，通常为SaprolegniaSaprolegnia spp.spp.或或AchlyaAchlya spp.spp.。2 2）每人取）每人取3 3个灭菌培养皿，在每一培养皿中加入个灭菌培养皿，在每一培养皿中加入3-43-4瓣经简瓣经简单灭菌的大麻籽，然后分别加入单
38、灭菌的大麻籽，然后分别加入1414、1212、10ml10ml灭菌水，再灭菌水，再分别加入分别加入1 1、3 3、5ml5ml池塘水，置池塘水，置2525培养。培养。56分离工作有时不很顺利，分离工作有时不很顺利，失败的原因失败的原因很多，以下几点值得首很多，以下几点值得首先加以考虑：先加以考虑：（1 1）材料是否新鲜，标本中的病菌是否存活，其中杂菌滋）材料是否新鲜，标本中的病菌是否存活，其中杂菌滋生的情况；生的情况；（2 2）表面消毒所用的药剂和处理方法是否适宜；）表面消毒所用的药剂和处理方法是否适宜；（3 3）培养基是否适当，包括它的化学性状和物理性状；）培养基是否适当，包括它的化学性状和
39、物理性状；（4 4）培养的条件是否适宜，受低温、高温和其他因子的影）培养的条件是否适宜，受低温、高温和其他因子的影响；响；（5 5）病原生物的生物学特点，它对于腐生条件的适应能力）病原生物的生物学特点，它对于腐生条件的适应能力 （三）分离结果与分析：（三）分离结果与分析：57三、培养三、培养cultureculture病原物的培养病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。58每皿组织块均匀摆放，干水，轻压；每皿组织块均匀摆放，干水，轻压；培养皿倒置或正放
40、；培养皿倒置或正放；于于25-27 25-27 培养箱中培养；培养箱中培养；黑暗或光照，或光暗交替；黑暗或光照，或光暗交替；日光灯，紫色光，黑光灯等；日光灯，紫色光，黑光灯等；2-32-3天后检查结果；天后检查结果；写明日期、姓名等。写明日期、姓名等。591 1菌落的质地；菌落的质地；2 2菌落是凸起的还是成簇的菌丝体；菌丛密集及繁茂程度、菌落是凸起的还是成簇的菌丝体；菌丛密集及繁茂程度、3 3形成成堆的孢子是干性的还是粘性的；形成成堆的孢子是干性的还是粘性的；4 4各种子实体和休眠结构（厚垣孢子、菌核等）的形成各种子实体和休眠结构（厚垣孢子、菌核等）的形成 及所需的时间；及所需的时间；5 5
41、菌落正、背面的颜色，有无色素分泌出来而渗入培养基中；菌落正、背面的颜色，有无色素分泌出来而渗入培养基中；6 6有无特殊气味；有无特殊气味；7 7菌落中有无部分呈扇形；菌落中有无部分呈扇形；8 8生长率的快慢，如菌落长到一定直径所需的时间。生长率的快慢，如菌落长到一定直径所需的时间。9.9.培养基种类培养基种类(成分及成分及pH)pH)10.10.培养温度培养温度11.11.光照条件。光照条件。真菌培养性状观察真菌培养性状观察观察和记载以下内容：观察和记载以下内容：60 1 1菌丝块法菌丝块法 一般从形成的菌落的边缘挑取菌丝体移植培养，这也一般从形成的菌落的边缘挑取菌丝体移植培养，这也有一定的纯
42、化作用。有一定的纯化作用。四、真菌菌种的纯化四、真菌菌种的纯化 对一种真菌在进行深入研究以前，菌种的纯化是必要的。对一种真菌在进行深入研究以前，菌种的纯化是必要的。此外，研究真菌的遗传和变异、性征和同宗或异宗配合等现此外，研究真菌的遗传和变异、性征和同宗或异宗配合等现象，都要求菌种从单个孢子（或小段象，都要求菌种从单个孢子（或小段顶端菌丝顶端菌丝）繁殖而来。）繁殖而来。61这种方法这种方法实质上是分离菌落实质上是分离菌落，主要用于，主要用于细菌和酵细菌和酵母菌母菌等菌种的纯化，但不能看到和确定一个菌落等菌种的纯化，但不能看到和确定一个菌落是从单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。同是从单个孢子繁
43、殖而来，纯化的可靠性较差。同时，这种方法也不能用来分离特定的孢子。时，这种方法也不能用来分离特定的孢子。2 2单菌落法单菌落法 将菌种上产生的孢子用灭菌将菌种上产生的孢子用灭菌水洗下，适当稀释后，取一定量水洗下，适当稀释后，取一定量的孢子悬浮液与熔化后冷却到的孢子悬浮液与熔化后冷却到4545左右的琼脂培养基充分混合左右的琼脂培养基充分混合，倒平板培养，从形成的单个分，倒平板培养，从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体培养。散的菌落上移植菌丝体培养。623 3稀释法稀释法 将孢子悬浮液加将孢子悬浮液加适量的灭菌水，不适量的灭菌水，不断稀释到每一小滴断稀释到每一小滴悬浮液中悬浮液中大致只有大致只有1
44、1个孢子个孢子。移植到适当的培养移植到适当的培养基上培养。基上培养。此方法操作比较麻此方法操作比较麻烦，但是比前一种烦，但是比前一种分离法可靠。分离法可靠。63 孢子悬浮液中孢子调节到适当的数量，再涂匀在孢子悬浮液中孢子调节到适当的数量，再涂匀在琼脂平板表面上。用玻璃针、金属针或其他器具在显琼脂平板表面上。用玻璃针、金属针或其他器具在显微镜下观察和挑取。微镜下观察和挑取。4 4琼脂平板表面琼脂平板表面单孢单孢子挑取法子挑取法有时可以等到孢子萌芽产生有时可以等到孢子萌芽产生短芽管后再挑取。孢子萌芽后短芽管后再挑取。孢子萌芽后容易看到和挑取，尤其是有利容易看到和挑取，尤其是有利于分离小而无色的孢子
45、，还可于分离小而无色的孢子，还可以保证分离到的孢子是活的。以保证分离到的孢子是活的。中枢性性早熟诊断中枢性性早熟诊断与治疗共识与治疗共识 1 132 CPPCPP的诊断的诊断CPPCPP的治疗的治疗 概 述CONTENTS概 述01一、概述 中枢性性早熟(central precocious puberty,CPP)是 指 由 于 下 丘 脑-垂 体-性 腺 轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)功能提前启动而导致女孩 8 岁前，男孩 9 岁前出现内外生殖器官快速发育及第二性征呈现的一种常见儿科内分泌疾病。发病率约为 1/5 0001/10 00
46、0，女孩约为男孩的 510 倍 。其对机体的影响主要表现为：由于性发育过早，引起女孩早初潮；由于骨骼成熟较快，骨龄超过实际年龄而骨骺提前愈合，影响患儿的终身高；由于第二性征过早发育及性成熟，可能带来相应的心理问题或社会行为异常。一、概述 目前国内外普遍应用促性腺激素释放激素类似物(gonadotropin-releasing hormone analogs,GnRHa)治疗 CPP。数十年来，世界范围内青春期发育开始的年龄有逐渐提前趋势，CPP 的诊断与治疗日益引起人们重视。CPP CPP 的诊断02二、二、CPP的诊断的诊断（一）、临床诊断（一）、临床诊断 根据患儿出现第二性征的时间、症状、
47、体征及实验室检查，首先确定患儿是否为 CPP。性早熟按 HPGA 功能是否提前启动分为中枢性性早熟(GnRH 依赖性、真性、完全性性早熟)、外周性性早熟(非 GnRH 依赖性、假性性早熟)和不完全性性早熟(部分性性早熟)。二、二、CPP的诊断的诊断 CPP 的诊断需符合以下标准：(1)第二性征提前出现：女孩 8 岁前，男孩 9 岁前出现第二性征发育。以女孩出现乳房结节，男孩睾丸容积增大为首发表现。(2)线性生长加速：年生长速率高于正常儿童。(3)骨龄超前：骨龄超过实际年龄 1 岁或 1岁以上。(4)性腺增大：盆腔 B 超显示女孩子宫、卵巢容积增大，且卵巢内可见多个直 径4 mm 的卵泡；男孩睾
48、丸容积4 ml。(5)HPGA 功能启动，血清促性腺激素及性激素达青春期水平。二、二、CPP的诊断的诊断在临床诊断过程中还应注意以下问题：在临床诊断过程中还应注意以下问题：1 1 性早熟的年龄界定：性早熟的年龄界定：性早熟是指女孩在 8 岁前，男孩在 9 岁前出现第二性征发育。近年来世界各地的调查显示，乳腺发育的年龄呈现明显提前趋势，但初潮年龄仅略为提前，且具有种族和地域差异 。美国 Lawson Wilkins 儿科内分泌学会建议将性早熟的年龄界定为白种女孩7 岁，非裔女孩6 岁，但存在争议。性发育开始的时间与遗传、环境、肥胖等因素有关。因此，有学者提出性早熟的年龄界定应根据不同国家、不同种
49、族的标准进行。目前国内外仍广泛沿用既往年龄标准。二、二、CPP的诊断的诊断2 2 性发育的顺序及进程：性发育的顺序及进程：性发育是一个连续的过程，且具有一定规律。CPP 是由于 HPGA 功能提前启动所致，性发育的顺序与正常儿童基本一致。女孩青春期发育顺序为：乳房发育，阴毛、外生殖器的改变，腋毛生长，月经来潮。男孩性发育则首先表现为睾丸容积增大(4 ml 时即标志青春期开始)，继而阴茎增长增粗，阴毛、腋毛生长及声音低沉、胡须，出现遗精。性发育的速度存在明显个体差异。一般性发育过程可持续 34 年，女孩每个 Tanner 分期的进展历时约1 年。男孩Tanner 分期进展与女孩类似，但从睾丸开始
50、增大至遗精历时比女孩稍长。二、二、CPP的诊断的诊断2 2 性发育的顺序及进程：性发育的顺序及进程：在性早熟的诊断过程中，对于典型的界定年龄(女孩 8 岁，男孩 9 岁)前出现性发育征象的患儿较易诊断，但在重视性发育开始年龄的同时，还应考虑性发育的顺序及进程，性发育顺序或进程异常，可为性早熟的不同表现。对进一步诊断和处理有重要提示意义。性发育顺序异常时需注意排除外周性性早熟、不完全性性早熟等。其中不完全性性早熟又称变异型青春期(pubertal variants)，包括单纯性乳房早发育(premature thelarche)、肾上腺功能早现(premature adrenarche)、单纯性
