1、 沙门氏菌（沙门氏菌（SalmonellaSalmonella）的检验）的检验DANIEL ELMER DANIEL ELMER SALMONSALMON,(1850-1914),(1850-1914)美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。一位兽医学博士。18841884年任美国农业部畜牧局年任美国农业部畜牧局 首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为纪念他而以是为纪念他而以 他的名字命名的。他的名字命名的。沙门菌
2、（Salmonella）是一大群寄生于动物肠道内生化反应和抗原构是一大群寄生于动物肠道内生化反应和抗原构造相似的造相似的革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌一、沙门氏菌生物学特性一、沙门氏菌生物学特性 大小大小0.60.61.01.02 23um3um，无芽孢，一般有鞭毛无芽孢，一般有鞭毛(鸡沙门鸡沙门菌除外菌除外)，无荚膜，多数有菌，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度或兼性厌氧，最适生长温度为为35353737，最适，最适pHpH值为值为6.86.87.87.8。1、沙门菌生物学性状G-G-杆菌杆菌 0.6-1.0um0.6-1.0um2-4um
3、2-4um周身鞭毛，有菌毛。周身鞭毛，有菌毛。形态大小形态大小2、病 原 学生化反应生化反应不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生多数产生H H2 2S S，不产生靛基质，不液化明胶，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。在氰化钾培养基上不生长。3、流行病学易感动物：各种年龄的动物均感染，幼畜易感动物：各种年龄的动物
4、均感染，幼畜最易感最易感传播途径：传播途径：主要消化道、呼吸道、伤口等主要消化道、呼吸道、伤口等子宫内感染（垂直传播）子宫内感染（垂直传播）内源性感染（带菌现象普遍内源性感染（带菌现象普遍)沙门氏菌属致病性 潜伏期一般潜伏期一般6-726-72小时，主要症状为恶心、呕吐、小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1 12 2天天或更长。或更长。感染剂量为感染剂量为15152020个菌，个菌，死亡率达死亡率达1 14%4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。免疫缺陷者等。污染源
5、主要是人和家畜的粪便污染源主要是人和家畜的粪便 可以存在于多类食品中可以存在于多类食品中二、沙门菌病简介二、沙门菌病简介目前至少有目前至少有6767种种O O抗原和抗原和20002000个以上血清型，所个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。致疾病称沙门菌病。肠热症肠热症-是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。急性肠炎（食物中毒）急性肠炎（食物中毒）-是最常见的沙门杆菌是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。等引起。败血症败血症-
6、常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。鸡白痢三、沙门氏菌检验三、沙门氏菌检验中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准GB/T 4789.4-2010GB/T 4789.4-2010微生物学检验微生物学检验本标准代替本标准代替GB/T 4789.4-2008GB/T 4789.4-2008食品卫生微生物检验沙门氏菌检验食品卫生微生物检验沙门氏菌检验。本标准与本标准与GB/T 4789.4-2008 GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下：相比，主要变化如下：修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英
7、文名称；修改了标准的范围；修改了标准的范围；修改了培养基和试剂；修改了培养基和试剂；修改了设备和材料；修改了设备和材料；修改了附录修改了附录A A。本标准的附录本标准的附录A A、附录、附录B B 为规范性附录。为规范性附录。本标准所代替的历次版本发布情况为：本标准所代替的历次版本发布情况为：GB 4789.4-84GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008GB/T 4789.4-2008前前 言言 本标准规定了食品中沙门氏菌本标准规定了食品中沙门氏菌（S
8、almonella Salmonella）的检验方法。）的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。的检验。范范 围围设设 备备 和和 材材 料料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他还有：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他还有：冰箱：冰箱：2 2 5 5。恒温培养箱恒温培养箱均质器均质器振荡器振荡器电子天平：感量电子天平：感量0.1g0.1g无菌锥形瓶无菌锥形瓶:容量容量500mL500mL，250 mL250 mL无菌试管无菌试管无菌培养皿无菌培养皿无菌吸管无菌吸管无菌毛细管无菌毛细管 pH pH 计或计或pH pH 比比 色管或精密色管或精密pH pH
9、 试试纸纸全自动微生物生全自动微生物生 化鉴定系统化鉴定系统 培培 养养 基基 和和 试试 剂剂 缓冲蛋白胨水（缓冲蛋白胨水（BPW BPW）四硫磺酸钠煌绿（四硫磺酸钠煌绿（TTBTTB）增菌液增菌液亚硒酸盐胱氨酸（亚硒酸盐胱氨酸（SCSC）增）增菌液菌液亚硫酸铋（亚硫酸铋（BS BS）琼脂）琼脂HE HE 琼脂琼脂木糖赖氨酸脱氧胆盐木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD XLD）琼脂）琼脂沙门氏菌属显色培养基沙门氏菌属显色培养基三糖铁（三糖铁（TSITSI）琼脂）琼脂蛋白胨水、靛基质试剂蛋白胨水、靛基质试剂 氰化钾（氰化钾（KCN KCN）培养培养 尿素琼脂尿素琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基赖氨酸脱羧酶试验
10、培养基糖发酵管糖发酵管邻硝基酚邻硝基酚 -D-D 半乳糖苷半乳糖苷（ONPGONPG）培养基）培养基半固体琼脂半固体琼脂丙二酸钠培养基丙二酸钠培养基沙门氏菌沙门氏菌O O 和和H H 诊断血清。诊断血清。生化鉴定试剂盒生化鉴定试剂盒操操 作作 步步 骤骤检检 样样25g(ml)25g(ml)样品样品+225mlBPW+225mlBPW1ml+TTB10ml1ml+TTB10ml1ml+SC10ml1ml+SC10ml36361 1，8h-18h8h-18hBSBSXLD(XLD(或或HEHE、显色培养基、显色培养基)挑取可疑菌落挑取可疑菌落 42 42 1 1，18h24h18h24h 36
11、36 1 1，18h24h18h24h36 36 1 1，40h48h40h48h36 36 1 1，18h24h18h24h沙沙门门氏氏菌菌检检验验程程序序生化鉴定生化鉴定试剂盒试剂盒或全自动或全自动微生物微生物生化鉴定生化鉴定系统系统+A1A1A2A2A3A3反应反应结果结果与左侧与左侧描述描述不符不符 甘露醇甘露醇+、山梨醇、山梨醇+ONPG-ONPG-沙门氏菌，血清学试验沙门氏菌，血清学试验 非沙门氏菌非沙门氏菌 报报 告告TSITSI，赖氨酸，赖氨酸，NANA，靛基质，尿素（，靛基质，尿素（pH7.2pH7.2），），KCNKCN反应序号反应序号A1A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如
12、尿素、：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCNKCN和赖氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶3 3项中有项中有1 1项异常，按表项异常，按表4 4可判定为沙门氏菌。如有可判定为沙门氏菌。如有2 2项异常为非沙门氏菌。项异常为非沙门氏菌。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 综合以上生化实验和血清学鉴定的结综合以上生化实验和血清学鉴定的结果，报告果，报告25g25g（mlml）样品中检出或未检）样品中检出或未检出沙门氏菌。出沙门氏菌。结结 果果 与与 报报 告告前增菌：使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞前增菌：使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞恢复活力恢复活力未经加工过的食品，检验前不
13、需要前增菌未经加工过的食品，检验前不需要前增菌前增菌：前增菌：2525克（加工食品）克（加工食品）+225+225毫升毫升缓冲蛋白胨缓冲蛋白胨水水 3737度培养度培养4 4小时（干蛋品小时（干蛋品18241824小时）。小时）。（一）前增菌（一）前增菌沙门氏菌前增菌培养基沙门氏菌前增菌培养基缓冲蛋白胨水缓冲蛋白胨水(BPW)(BPW)肉汤：肉汤：是基础增菌培养基，不含任何抑制成是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门氏菌复苏。使受分，有利于受损伤的沙门氏菌复苏。使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。态。20032003版本标准仅用于加工
14、食品或冷冻版本标准仅用于加工食品或冷冻食品的前增菌。食品的前增菌。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 （二）选择性增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL1 mL，转，转种于种于10 mL TTB10 mL TTB内，于内，于42 42 1 1 培养培养18 h18 h24 h24 h。同时，另取。同时，另取1 mL1 mL，转种于，转种于10 mL SC10 mL SC内，于内，于36 36 1 1 培养培养18 h18 h24 h24 h。一种增菌剂不可能适合所有的沙门菌，所以，一种增菌剂不可能适合所有的沙门菌，所以，要同时使用
15、两种以上的培养基增菌要同时使用两种以上的培养基增菌同时使用同时使用TTBTTB、SCSC20032003版本国标还有版本国标还有MMMMAOACAOAC：TTTT、SCSCFDAFDA：RVRV、TTTTISOISO：RVRV、SCSC选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌，选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。PDF 文件使用
16、 pdfFactory Pro 试用版本创建 沙门氏菌的增菌液沙门氏菌的增菌液l 四硫磺酸钠煌绿增菌液四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)(TTB)：含有胆盐，：含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长。生长，而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长。l 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SCSC）：可对伤寒及）：可对伤寒及其他沙门氏菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白其他沙门氏菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃复合物，
17、影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 （三）分离培养分别用接种环取增菌液分别用接种环取增菌液1 1 环，划线环，划线接种于一个接种于一个BSBS琼脂平板和一个琼脂平板和一个XLDXLD琼琼脂平板（或脂平板（或HE HE 琼脂平板或沙门氏菌属琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于显色培养基平板）。于36 36 1 1 分别分别培养培养18 h18 h24 h24 h（XLDXLD琼脂平板、琼脂平板、HEHE琼琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）
18、或或40 h40 h48 h48 h（BSBS琼脂平板），观察各琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表落特征见表1 1。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 表表1 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼选择性琼脂平板脂平板沙门氏菌沙门氏菌BS BS 琼脂琼脂（36 1 40 h48 h）菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变呈黑色或棕
19、色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE HE 琼脂琼脂（36 1 18 h24 h）蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD XLD 琼脂琼脂（36 1 18 h24 h）菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现大的带光泽的黑色中心，或 呈现全部黑色呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌沙门氏菌属显色培属显
20、色培养基养基（36 1 18 h24 h）按照显色培养基的说明进行判定。按照显色培养基的说明进行判定。使用使用BSBS、XLDXLD、HEHE、沙门氏菌显色培养基、沙门氏菌显色培养基20032003版本国标：版本国标：BSBS、DHLDHL（或（或HEHE、WSWS、SSSS）FDAFDA：BSBS、XLDXLD、HEHEAOACAOAC：BSBS、XLDXLD、HEHEISOISO：phenol red brilliant greenphenol red brilliant green琼脂、琼脂、BSBS或或HEHE为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用
21、两种以上选择性分离培养基。必须使用两种以上选择性分离培养基。沙门氏菌分离培养基沙门氏菌分离培养基PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 沙门氏菌分离培养基沙门氏菌分离培养基l 亚硫酸铋琼脂（亚硫酸铋琼脂（BSBS）：含有煌绿、亚硫酸铋）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大肠埃希氏菌、变形杆菌和革兰氏阳能抑制大肠埃希氏菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门氏菌性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门氏菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门氏菌能的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门氏菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑
22、色和棕色的环，对光观黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过配制，超过48 h48 h不宜使用。不宜使用。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 l 沙门氏菌菌落形态：沙门氏菌菌落形态：黑色有金属光泽、黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈落周围培养基可呈黑色或棕色；有些黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基菌落，周围培养基不变。不变。PDF 文件使用 pdfFa
23、ctory Pro 试用版本创建 l HEHE琼脂：在保证细琼脂：在保证细菌所需营养的基础菌所需营养的基础上，加入了一些抑上，加入了一些抑制剂，如：胆盐、制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏染色阴但对革兰氏染色阴性的肠道致病菌则性的肠道致病菌则无抑制作用。无抑制作用。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 l 沙门氏菌在沙门氏菌在HEHE琼脂上的菌落形态：蓝绿琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑
24、色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。黑色。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 lXLDXLD琼脂：培养基中含有去氧胆酸琼脂：培养基中含有去氧胆酸钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂，而不影响沙门氏菌属和志贺制剂，而不影响沙门氏菌属和志贺氏菌属的生长。氏菌属的生长。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 l XLDXLD琼脂：粉红色，带或不带黑色中心，有琼脂：粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，
25、或呈现些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。不带黑色中心。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 l XLDXLD培养基分离沙门氏菌和志贺氏菌的敏感培养基分离沙门氏菌和志贺氏菌的敏感性超过了传统培养基，如：性超过了传统培养基，如：EMBEMB、SSSS。因这。因这些培养基尚有抑制志贺氏菌属生长的潜在因些培养基尚有抑制志贺氏菌属生长的潜在因素，故本培养素，故本培养基是分离鉴定基是分离鉴定沙门氏菌及志沙门氏菌及志贺氏菌属的可贺氏菌属的可靠培养基。在靠培养基。在国外广泛使用。国外广泛
26、使用。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 l 沙门氏菌显色培养基主要用于快速筛选、分沙门氏菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门氏菌。其基本原理：利用沙门氏菌特离沙门氏菌。其基本原理：利用沙门氏菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门氏菌在培养基上呈紫色或紫红色。出来，沙门氏菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠埃希氏菌等其他肠杆菌呈蓝绿色。而大肠埃希氏菌等其他肠杆菌呈蓝绿色。沙门氏菌沙门氏菌辛酸脂酶辛酸脂酶色原-特定结合物无色色原特定结合物游离显色PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 SS琼脂上面
27、的志贺氏菌和沙门氏菌PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 SS琼脂上面的沙门氏菌PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 DHL琼脂上面的沙门氏菌PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 BS琼脂上面的志贺氏菌和沙门氏菌PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 分离培养中的注意要点分离培养中的注意要点l 非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型或可疑沙门氏菌
28、菌落时，按如下步骤检验或可疑沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。非典型的沙门氏菌菌落。l HEHE和和XLDXLD琼脂：非典型的沙门氏菌在琼脂：非典型的沙门氏菌在HEHE和和XLDXLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。中心。HEHE和和XLDXLD平板经平板经24242 h2 h培养后，没培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑取有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2 2个或更多个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。显色琼脂另外。个非典型的沙门氏菌菌落。显色琼脂另外。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 l BSBS琼脂：某些非典型菌株产
29、生绿色菌落，琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BSBS平平板培养板培养24242 h2 h后，没有出现典型菌落，则后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养不挑取任何菌落，让平板继续培养24242 h2 h。如果经如果经48482 h2 h培养后，仍没有典型或可疑培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取的菌落出现，则挑取2 2个或更多个非典型的个或更多个非典型的菌落。菌落。分离培养中的注意要点分离培养中的注意要点PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 （四）革兰染色沙门氏菌：革兰阴性杆菌沙门氏菌
30、：革兰阴性杆菌 （五）五项生化试验（五）五项生化试验1 1、三糖铁琼脂试验、三糖铁琼脂试验2 2、靛基质试验（吲哚试验）、靛基质试验（吲哚试验）3 3、尿素酶试验、尿素酶试验4 4、氰化钾试验（、氰化钾试验（KCNKCN）5 5、赖氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验可编辑自选择性琼脂平板上分别挑取自选择性琼脂平板上分别挑取2 2个以上典个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于于36 36
31、1 1 培养培养18 h18 h24 h24 h，必要时可延长，必要时可延长至至48 h48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2 2。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 20032003版本国标中生化鉴定是将可疑菌落版本国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于三糖铁（同时接种于三糖铁（TSITSI）琼脂、蛋白胨水）琼脂、蛋白胨水(供做靛基质试验供做靛基质试验)、尿素琼脂、尿素琼脂 (pH7.2)(pH7.2)、氰化、氰化钾钾 (KCN)(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培
32、养基；培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基；20102010版本修改为：接种版本修改为：接种TSITSI琼脂和赖氨琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼酸脱羧酶试验培养基的同时增加一项营养琼脂（脂（NANA），经），经TSITSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌培养基的选择后，可筛掉大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时也满足了下一株，大大减少了工作量，同时也满足了下一步生化鉴定的需要。步生化鉴定的需要。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 三糖铁、赖
33、氨酸反应情况三糖铁、赖氨酸反应情况绝大多数沙门菌属，绝大多数沙门菌属，极少数为爱德华菌属极少数为爱德华菌属甲型副伤寒（约甲型副伤寒（约10%10%的甲副的甲副H HS S呈阳性）呈阳性）伤寒杆菌（伤寒杆菌（H HS S仅在仅在穿刺线出现）穿刺线出现）沙门氏菌亚属沙门氏菌亚属伟劳地柠檬酸杆菌伟劳地柠檬酸杆菌/变变形杆菌，极少数为甲形杆菌，极少数为甲型副伤寒杆菌型副伤寒杆菌柠檬酸杆菌属柠檬酸杆菌属A1A1A2A2A3A3A4A4B1B1B2B2判判 定定动力动力赖氨酸赖氨酸乳糖乳糖 H HS S葡萄糖葡萄糖PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试
34、验注：本试验的阳注：本试验的阳性反应为培养基性反应为培养基不改变颜色，而不改变颜色，而培养基变黄色者培养基变黄色者为阴性反应。本为阴性反应。本试验一定要设空试验一定要设空白对照。培养基白对照。培养基需用液体石蜡封需用液体石蜡封盖，阻止空气的盖，阻止空气的氧化作用。氧化作用。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 氰化钾试验氰化钾试验l 氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓冲液、氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓冲液、氯化钠、氰化钾。氯化钠、氰化钾。l 原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌的呼吸酶系统，使这些酶失去活性，细菌的的呼吸酶系
35、统，使这些酶失去活性，细菌的生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验常用于沙门氏菌与柠檬酸杆菌的鉴定。常用于沙门氏菌与柠檬酸杆菌的鉴定。l 沙门氏菌生长情况：阴性（不生长）。沙门氏菌生长情况：阴性（不生长）。l注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复试验。试验失败
36、的主要原因是封口不严，氰化钾逐试验。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低细菌生长，呈假阳性反应。细菌生长，呈假阳性反应。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 靛基质（吲哚）试验靛基质（吲哚）试验阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）尿素酶试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）阴性（黄）阳性（红）ONPGONPG试验试验阳性（黄）阳性（黄）空白空白丙二酸盐试验丙二酸盐试验阳性（兰）阳性（兰）阴性（不变）阴性（不变）ONPG试验阳性（黄）空白（六）三糖铁琼脂(TS
37、I)介绍 三糖铁琼脂(TSI)成分：蛋白胨蛋白胨 20.0g20.0g牛肉膏牛肉膏3.0g3.0g乳乳 糖糖 10.0g10.0g蔗糖蔗糖 10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖1.0g 1.0g 硫酸亚铁铵硫酸亚铁铵(含含6 6个结晶水个结晶水)0.5g)0.5g酚红酚红 0.025g0.025g或或5g/L5g/L溶液溶液5mL5mL氯化钠氯化钠5.0g 5.0g 硫代硫酸钠硫代硫酸钠0.5g0.5g琼脂琼脂 12.0g12.0g蒸馏水蒸馏水 1000.0mL 1000.0mL 可疑菌落生化鉴定可疑菌落生化鉴定 l 三糖铁的主要成分：蛋白三糖铁的主要成分：蛋白胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、胨、乳糖、蔗
38、糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂。酚红、琼脂。l 在在TSITSI琼脂中有琼脂中有2 2个指示剂个指示剂体系：体系：l 酚红：在碱性环境中呈酚红：在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄红色；在酸性环境中呈黄色。色。l 硫酸亚铁铵：是硫化氢硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫化氢反的指示剂，可与硫化氢反应生成硫化铁呈黑色。硫应生成硫化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成化形成S-SS-S基而影响反应。基而影响反应。PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 TSI生化原理斜面部分暴露于空气中，为有氧环境。而斜面部分暴
39、露于空气中，为有氧环境。而下部与空气隔绝是相对厌氧的环境。因此下部与空气隔绝是相对厌氧的环境。因此TSITSI时，时，最重要的是斜面部分和管下部琼脂最重要的是斜面部分和管下部琼脂的长度的长度，两者均为，两者均为3cm 3cm，以保证两部分相，以保证两部分相对应的有氧或厌氧环境。对应的有氧或厌氧环境。测试时使用接种针测试时使用接种针先穿刺至底部先穿刺至底部，而后于斜面，而后于斜面作划线作划线接种接种，经培养，经培养18-2418-24小时后，依情况判断糖类发酵情形。小时后，依情况判断糖类发酵情形。观察结果：有三种类型A.A.非发酵型：无碳氢化合物发酵，所以无酸非发酵型：无碳氢化合物发酵，所以无酸
40、产生，斜面上琼脂的肽降解产物是碱性物产生，斜面上琼脂的肽降解产物是碱性物质导致斜面变红。这种类型的细菌称为非质导致斜面变红。这种类型的细菌称为非发酵型。发酵型。B.B.非乳糖发酵型非乳糖发酵型:如果接种的是发酵葡萄糖不发酵乳如果接种的是发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，培养基内仅有糖的细菌，培养基内仅有0.1%0.1%葡萄糖可以产酸。葡萄糖可以产酸。开始阶段，培养开始阶段，培养8-12h8-12h时，产生的酸足以引起斜面时，产生的酸足以引起斜面和底部颜色变成黄色。在接下来的时间里，葡萄和底部颜色变成黄色。在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，糖被完全消耗，斜面部分的细菌在有氧条件下开斜面部分的细菌在有
41、氧条件下开始氧化降解氨基酸，产生的胺类很快就中和斜面始氧化降解氨基酸，产生的胺类很快就中和斜面上存在的酸上存在的酸；到；到18-24h18-24h，整个斜面又转换成碱性，整个斜面又转换成碱性PHPH，颜色有变成红色。深部（厌氧区域），氨基，颜色有变成红色。深部（厌氧区域），氨基酸降解不足以中和形成的酸，培养基仍为黄色。酸降解不足以中和形成的酸，培养基仍为黄色。C.C.乳糖（蔗糖）发酵型乳糖（蔗糖）发酵型 三糖铁（三糖铁（TSITSI）试验）试验肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，可发酵葡萄糖产可发酵葡萄糖产酸。酸。利用糖类发酵之不同与硫化氢产生与否，加以区分。利用糖类发酵之不同
42、与硫化氢产生与否，加以区分。三糖铁琼脂斜面培养基含有三糖铁琼脂斜面培养基含有1 1乳糖及蔗糖与乳糖及蔗糖与0.10.1葡萄糖葡萄糖作为发酵基质，且以作为发酵基质，且以酚红作为酸碱指示剂酚红作为酸碱指示剂，如，如培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵三糖铁（三糖铁（TSITSI）琼脂试验）琼脂试验本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而
43、氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。保持黄色。a.uninoculated b.little change/alkaline/-/-c.alkaline/acid/-/+d.acid/acid/+/+e.acid/acid/+/-slant color/butt color/gas production/hydrogen sulfide production制好的培制好的培养基养基对
44、照管对照管斜面红色，斜面红色，底面黄色底面黄色培养基全黄色培养基全黄色斜面、斜面、底部黄底部黄色，并色，并产生产生H H2 2S S斜面红色，底部黑斜面红色，底部黑色，产生色，产生H H2 2S S底面黄色，并产生底面黄色，并产生COCO2 2（1 1）斜面碱性（红色）斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色）底部酸性（黄色+）产气或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表产气或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，但因葡萄糖含量低，于斜酸，使培养基变黄，但因葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸立即氧化而呈碱性反应，同
45、时面产生之微量酸立即氧化而呈碱性反应，同时培养基中的蛋白质也随之利用而产碱，培养基培养基中的蛋白质也随之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故仍维持酸性反应。仍维持酸性反应。（2 2）斜面酸性（黄色）斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色）底部酸性（黄色+）产气或不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖产气或不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，与（或）蔗糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持培养基斜面与底部保持酸经继续发酵，可维持培养基斜面与底部保持酸性反应。性反应。（3 3）斜面碱性（红色）斜
46、面碱性（红色-）底部碱性（红色）底部碱性（红色-）或无）或无变化（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则变化（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。则斜面与底部均呈碱性反应。为使结果准确，应于接种培养为使结果准确，应于接种培养18-2418-24小时内观小时内观察结果，以确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之察结果，以确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产生。碱性终产物尚未产生。培养基变黑培养基变黑
47、（4 4）三糖铁琼脂培养基中）三糖铁琼脂培养基中亦含有硫代硫酸钠亦含有硫代硫酸钠若微生物有硫化氢产生，会若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变黑。养基变黑。肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 斜面斜面底层底层产气产气硫化氢硫化氢可能的菌属和种可能的菌属和种/沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌华氏菌/沙门氏菌沙门氏菌、弗劳地氏柠檬酸、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌杆菌、普通变形杆菌沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、沙门氏菌属、大肠埃希氏菌
48、、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属普罗菲登斯菌属伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属普罗菲登斯菌属/大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌劳地氏柠檬酸杆菌注：阳性；阴性；注：阳性；阴性；/多数阳性，少数阴性多数阳性，少数阴性肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果A1沙门氏菌属
49、A2沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌A3弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌A4普通变形杆菌B1沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3/克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4/摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注2：KCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注3：表示阳性；表示阴性；/表示多数阳性，少数阴性。a a）抗原的准备）抗原的准备 一般采用一般采用 1.21.21.51.5琼脂培养物作为玻片凝琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗
50、原。集试验用的抗原。O O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如（如2 2 3 3）培养基上再检查；如果是由于培养基上再检查；如果是由于Vi Vi 抗原的存在而阻止了抗原的存在而阻止了O O 凝集反应时，可挑取菌苔于凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。煮沸后再检查。H H 抗原发育不良时，将菌株接种在抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.550.650.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌
