电泳技术和常用电泳仪课件.pptx

1、第六章第六章 电泳技术和常用电泳仪电泳技术和常用电泳仪 一、概述一、概述 generalization)电泳（电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）。可以实现电泳分离技术的仪器称）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（之为电泳仪（electrophoresister）。）。第六章第六章 电

2、泳技术和常用电泳仪电泳技术和常用电泳仪 目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。甚至还用于细胞与病毒的研究。临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。和毛细管电泳等。第一节第一节 电泳原理电泳原理第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法第三节第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标常用电泳设备的基本结

3、构及技术指标第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式第五节第五节 电泳仪的临床应用电泳仪的临床应用第六节第六节 电泳技术的质量控制电泳技术的质量控制本章目录本章目录第一节第一节 电泳原理电泳原理 一、电泳的基本原理一、电泳的基本原理 物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相量相 等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大

4、小不子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场同，因而在一定的电场 中它们的移动方向和移中它们的移动方向和移 动速度也不同，因此可动速度也不同，因此可 使它们分离。使它们分离。06-01电泳现象和电渗流现象电泳现象和电渗流现象。第一节第一节 电泳原理电泳原理 若将带净电荷若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：到的电荷引力为：F引引=E Q （6-1）在溶液中在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F阻阻 F阻阻=6rV （6-2）当当F引引=F阻阻时时 EQ=6rV V=EQ/6r （6-3）由上

5、式可以看出由上式可以看出,粒子的移动速度粒子的移动速度(泳动速度泳动速度V)与与电场强度电场强度(E)和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量(Q)成正比成正比,而与粒子的而与粒子的半径半径(r)及溶液的粘度及溶液的粘度()成反比。成反比。第一节第一节 电泳原理电泳原理 二、影响电泳的外界因素二、影响电泳的外界因素 （一）电场强度（一）电场强度 （二）溶液的（二）溶液的pHpH值值 （三）溶液的离子强度（三）溶液的离子强度 （四）电渗作用（四）电渗作用 （五）粒子的迁移率（五）粒子的迁移率 （六）吸附作用（六）吸附作用影响电泳的环境因素影响电泳的环境因素在电场中被分离物质的泳动速度除受本身性质如所带电

6、荷在电场中被分离物质的泳动速度除受本身性质如所带电荷的性质和数量、分子本身的大小和形状、分子的水化程度的性质和数量、分子本身的大小和形状、分子的水化程度、解离趋势、两性行为等影响外，还与其它外界环境因素、解离趋势、两性行为等影响外，还与其它外界环境因素有关。有关。1 电场强度的影响：电场强度是指电场中每厘米的电位降电场强度的影响：电场强度是指电场中每厘米的电位降，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强度重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强度低，带电颗粒泳动速度慢。低，带电颗粒

7、泳动速度慢。2 溶液溶液pH值的影响：大部分生物大分子都具有阳离子和阴值的影响：大部分生物大分子都具有阳离子和阴离子基团，这些基团的解离常数不同，溶液的离子基团，这些基团的解离常数不同，溶液的pH值决定被值决定被分离物质带电基团的解离程度，所以生物大分子的净电荷分离物质带电基团的解离程度，所以生物大分子的净电荷取决于环境的取决于环境的pH值。值。pH影响着生物大分子的电泳迁移率，影响着生物大分子的电泳迁移率，溶液的溶液的pH值距离蛋白质的等电点值距离蛋白质的等电点pI越远，蛋白质带电性越越远，蛋白质带电性越强，泳动速度越快；强，泳动速度越快；pH值距离蛋白质的值距离蛋白质的pI越近，蛋白质带越

8、近，蛋白质带电性越弱，泳动速度越慢。电泳时为保持电性越弱，泳动速度越慢。电泳时为保持pH恒定，必须采恒定，必须采用缓冲液作为电极缓冲液。在分离蛋白质时，要选择合适用缓冲液作为电极缓冲液。在分离蛋白质时，要选择合适pH的缓冲液，使待分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较的缓冲液，使待分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大差异，有利于彼此分开。大差异，有利于彼此分开。3 溶液离子强度的影响：溶液中的离子强度直接影响被分溶液离子强度的影响：溶液中的离子强度直接影响被分离物质的电动电势离物质的电动电势()。带电颗粒的迁移率与离子强度的平方。带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。如果溶液的离子强度越大，电

9、动电势越小，泳动根成反比。如果溶液的离子强度越大，电动电势越小，泳动速度越慢；如果溶液的离子强度越小，电动电势越大，泳动速度越慢；如果溶液的离子强度越小，电动电势越大，泳动速度越快。高离子强度时电泳条带较细窄。一般最适合的离速度越快。高离子强度时电泳条带较细窄。一般最适合的离子强度在子强度在0.020.2之间。溶液离子强度的计算公式如下：之间。溶液离子强度的计算公式如下：I=1/2scz2式中，式中，I为离子强度，为离子强度，s表示溶液中有表示溶液中有s种离子，种离子，c为离子的为离子的摩尔浓度摩尔浓度(mol/L)，z为离子价数。溶液中离子种类多，浓度为离子价数。溶液中离子种类多，浓度大，离

10、子价数高，则离子强度大。大，离子价数高，则离子强度大。4 电渗的影响：固体支持物表面的电荷使支持物附近溶液电渗的影响：固体支持物表面的电荷使支持物附近溶液分子形成偶电层，溶液在电场中向一定方向移动，即电渗现分子形成偶电层，溶液在电场中向一定方向移动，即电渗现象，溶液移动的同时携带颗粒一起移动。象，溶液移动的同时携带颗粒一起移动。AB 5 温度的影响：在凝胶电泳过程中要产生焦温度的影响：在凝胶电泳过程中要产生焦尔热，而热对电泳的分离效果影响很大。尔热，而热对电泳的分离效果影响很大。温度升高时，介质粘度下降，分子运动加温度升高时，介质粘度下降，分子运动加剧，使自由扩散的速度变快，迁移率增加。剧，使

11、自由扩散的速度变快，迁移率增加。6 介质的影响：介质的交联度直接影响介质的影响：介质的交联度直接影响分离效果，介质的纯度影响聚胶效果，介分离效果，介质的纯度影响聚胶效果，介质的非特异性吸附会增大电渗。质的非特异性吸附会增大电渗。第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法一、电泳技术的分类一、电泳技术的分类 （一）根据工作原理的不同：可分为移界电泳、（一）根据工作原理的不同：可分为移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等。泳等。按分离原理分类按分离原理分类(1)区带电泳区带电泳(zone electrophoresis，ZEP

12、)：是在半固相或：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带立的区带(图图3-2a)，这是当前应用最广泛的电泳技术。，这是当前应用最广泛的电泳技术。(2)移界电泳移界电泳(moving boundary electrophoresis，MBEP)：是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，是把电场加在生物大分子溶

13、液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图图3-2b)。(3)稳态电泳稳态电泳(steady state electrophoresis)：带电颗粒在：带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳(isotachophoresis，ITP)、等电聚焦电泳、等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)(图图2c、2d)。a b c d

14、图图3-2 各种电泳分离原理示意图各种电泳分离原理示意图a 区带电泳区带电泳 b 移界电泳移界电泳 c 等速电泳等速电泳 d 等电聚焦等电聚焦第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法（二）根据有无固体支持物可分为：自由电泳和支持物电泳（二）根据有无固体支持物可分为：自由电泳和支持物电泳（三）根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直电泳、（三）根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、板状电泳、柱状电泳、U U型管电泳、倒型管电泳、倒V V字形电泳、毛细管字形电泳、毛细管电泳等。电泳等。（四）根据支持物的特点又可分为：（四）根据支持物的特点又

15、可分为：无阻滞支持物电泳。高密度的凝胶电泳。无阻滞支持物电泳。高密度的凝胶电泳。（五）根据电源控制的不同，一般可分为以下（五）根据电源控制的不同，一般可分为以下3 3类：类：1.1.恒压电泳恒压电泳;2.;2.恒流电泳恒流电泳;3.;3.恒功率电泳恒功率电泳 。第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法 （六）根据自动化程度的不同，可分为半自动和（六）根据自动化程度的不同，可分为半自动和 全自动型。全自动型。（七）根据其功能的不同，可分为制备型、分析（七）根据其功能的不同，可分为制备型、分析 型、转移型、浓缩型等。型、转移型、浓缩型等。（八）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉

16、（八）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉 电泳、连续纸电泳、电泳层析相结合技术等。电泳、连续纸电泳、电泳层析相结合技术等。（九）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、（九）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、血清蛋白电泳、制备电泳、血清蛋白电泳、制备电泳、DNADNA测序电泳等。测序电泳等。第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法 二、电泳方法简介二、电泳方法简介 （一）纸电泳（一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。是最早使用的区带电泳。06-02 平卧式电泳槽装置示意图 将滤纸条水平地架设在将滤纸条水平地架设在两个

17、装有缓冲溶液的容器之两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压泳电源输入直流电压（100V100V1000V1000V）进行电泳进行电泳。第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法（二）醋酸纤维素薄膜电泳（二）醋酸纤维素薄膜电泳 电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、点是分离速度快、电泳时间短

18、、样品电泳时间短、样品 用量少。因此特别用量少。因此特别 适合于病理情况下适合于病理情况下 微量异常蛋白的检测。微量异常蛋白的检测。06-03 血清蛋白的电泳图谱 第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法 （三）凝胶电泳（三）凝胶电泳 由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。联聚丙烯酰胺和琼脂糖。它具有机械强度好、

19、弹性大、它具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗透明、化学稳定性高、无电渗 作用、设备简单、样品量小作用、设备简单、样品量小 (1(1100g100g）、分辨率高等优点。、分辨率高等优点。06-04 凝胶电泳图凝胶电泳图Bis将单体长链间连成网状结构：第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法（四）等电聚焦电泳（四）等电聚焦电泳 1 等电聚焦电泳过程等电聚焦电泳过程 一种利用有一种利用有pH值梯度的介值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。将等电点不同的蛋白质混合将等电点不同的蛋白质混合物加入有物加入有pHpH值梯度的凝

20、胶介质中，值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应分将分别聚焦在各自等电点相应的的pHpH值位置上，最后，样品的各值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。清晰而稳定的窄带。06-05 净电荷与PH的关系曲线 第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法 2 2等电聚焦电泳的特点等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成稳使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的定、连续、线性的pHpH梯度；由于梯度；由于“聚焦效应聚焦效应”，即使很小的样

21、品也能获得清晰、鲜明的区带界面；即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快电泳速度快;分辨率高分辨率高;加入样品的位置可加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点点;适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。工酶等）生物组分的分离分析。第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法（五）等速电泳（五）等速电泳 采用两种不同浓度的电解质组成，采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随

22、电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解电解质与尾随电解 质之间的空隙中移动，质之间的空隙中移动，实现分离。实现分离。06-06 等速电泳示意图 第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法（六）双向凝胶电泳（二维电泳）（六）双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦第一向采用等

23、电聚焦 根据复杂的蛋白质成根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的分中各个蛋白质的PIPI的不同，将蛋白质进行分离。的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳 （SDS-PAGESDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状状，而是呈现为斑点状。第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法胶性 PH9中电加解入质了溶双液 PH3加上电场后建立稳定PH梯度蛋白质溶液加入，建立电场染色后，蛋白质

24、因PI值不同，沿PH梯度分离开第一向等电聚焦等电聚焦PI逐渐降低等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上 第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量逐渐降低PI 逐渐降低 06-07 双向凝胶电泳示意图双向凝胶电泳示意图第二节第二节 常用电泳技术和电泳方法常用电泳技术和电泳方法(七）免疫电泳七）免疫电泳 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各

25、抗原成然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。方，形成肉眼可见的沉淀弧。第三节第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标常用电泳设备的基本结构及技术指标一、常用电泳设备的基本结构一、常用电泳设备的基本结构（一）电泳电源（一）电泳电源（二）电泳槽（二）电泳槽（三）附加装置（三）附加装置 06-08 平卧式电泳槽装置示意图平卧式电泳槽装置示意图从第一台商品自由移界电泳系统的问世以后，近从第一台商品自由移界电泳系统的问世以后，近50年来年来电泳仪器的发展迅猛，尤其是随着凝胶电泳技

26、术的成熟及电泳仪器的发展迅猛，尤其是随着凝胶电泳技术的成熟及广泛应用，各种类型的凝胶电泳装置层出不穷，使电泳技广泛应用，各种类型的凝胶电泳装置层出不穷，使电泳技术得以迅速发展。凝胶电泳仪作为实验室的常规小型仪器术得以迅速发展。凝胶电泳仪作为实验室的常规小型仪器，种类很多。随着科学技术的不断发展，电泳仪器的分析，种类很多。随着科学技术的不断发展，电泳仪器的分析对象也越来越专门化，分辨率越来越高，操作越来越简单对象也越来越专门化，分辨率越来越高，操作越来越简单，性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳，性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。槽及附属设备三大类。

27、电泳仪：电泳仪：根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪常压电泳仪(600V)：用于净电荷和：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳；胶电泳；(2)高压电泳仪高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和泳和DNA测序；测序；(3)超高压电泳仪超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。：用于毛细管电泳。电泳槽：电泳槽：根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。槽主要有自由界

28、面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。(1)自由界面电泳槽自由界面电泳槽Tiselius设计的自由界面电泳槽（图设计的自由界面电泳槽（图3-3）是一个）是一个U形玻璃形玻璃管，在管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统光学系统“纹影法纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。电泳槽目前已不使用。90年代初发展起来的高效毛细管电年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而

29、设计的。泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。电极电极U形管 3 Tiselius自由界面电泳装置示意图自由界面电泳装置示意图(2)管状电泳槽管状电泳槽50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳后呈圆盘状，因而称圆盘电

30、泳(disc electrophoresis)。圆盘电泳槽(3)板状电泳槽板状电泳槽 板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两 块 平 行 的 玻 璃 板 中 间，因 而 称 板 状 电 泳两 块 平 行 的 玻 璃 板 中 间，因 而 称 板 状 电 泳(s l a b electrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品件下进行电泳，

31、便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。槽。垂板电泳槽垂板电泳槽转移电泳槽转移电泳槽平板电泳槽平板电泳槽双向电泳槽双向电泳槽4.3附属设备附属设备随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方电泳在制

32、胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。第三节第三节 常用电泳设备的基本结构及技术指标常用电泳设备的基本结构及技术指标二、电泳仪的主要技术指标二、电泳仪的主要技术指标 1 输出电压 8 连续工作时间 2 输出电流 9 保护措施 3 输出功率 10 显示方式 4 电压稳定度 11 定时方式 5 电流稳定度 12 电源电压 6 功率稳定度 13 电

33、源频率 7 输出组数 14 功耗 琼脂糖凝胶电泳步骤：1.缓冲液的制备：缓冲液的制备：常用常用TAE或或TBE，PH值在值在69之间。之间。无论哪种都含无论哪种都含EDTA，可去除二价金属离，可去除二价金属离子。子。2.琼脂糖胶板的制备琼脂糖胶板的制备 1）取一定量的琼脂糖放入三角瓶中，加入电泳）取一定量的琼脂糖放入三角瓶中，加入电泳缓冲液配制成一定浓度的琼脂糖溶液（如基因缓冲液配制成一定浓度的琼脂糖溶液（如基因组组DNA：0.8%；PCR产物产物1.2%）。）。2）选择凝胶盘放入制胶架中，选好梳子插在制）选择凝胶盘放入制胶架中，选好梳子插在制胶架上。胶架上。3）加热煮沸使溶液澄清，冷却至）加

34、热煮沸使溶液澄清，冷却至60加入加入10mg/mlEB，摇匀后到入制胶架中。，摇匀后到入制胶架中。4）室温放置）室温放置3040分钟待凝胶聚合后，轻轻拔分钟待凝胶聚合后，轻轻拔掉梳子（注意：先拔一侧，否则垂直拔除产生掉梳子（注意：先拔一侧，否则垂直拔除产生真空导致部分凝胶带出）。真空导致部分凝胶带出）。3.在两边槽中加入电泳缓冲液，使凝胶全部被浸在两边槽中加入电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没，液面应高出胶面没，液面应高出胶面1mm。4.在梳井内加样，注意避免引入气泡。在梳井内加样，注意避免引入气泡。5.盖好上盖，接通电泳仪。盖好上盖，接通电泳仪。6.根据实际情况选择适宜的电压即可电泳。长胶根据实际

35、情况选择适宜的电压即可电泳。长胶需较高电压，但是采用高电压所需电泳时间较需较高电压，但是采用高电压所需电泳时间较短，发热高，分辨率低，适合筛选阳品或检查短，发热高，分辨率低，适合筛选阳品或检查样品纯度。反之，低电压，发热少，分辨率高，样品纯度。反之，低电压，发热少，分辨率高，但费时。但费时。7 .电泳实验结束后，先关闭电泳仪；随之拔除电泳实验结束后，先关闭电泳仪；随之拔除电源线，然后打开电泳槽上盖，取出凝胶托盘。电源线，然后打开电泳槽上盖，取出凝胶托盘。毛细管电泳是带电粒子在电场力的毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、

36、快速分离分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。电泳。20世纪世纪3040年代年代 蒂蒂塞利乌斯塞利乌斯(A.W.K.Tiselius）建建立了移动界面电泳，将电泳发展立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术成分离技术 获获得得1948年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。为毛细管电泳的发展奠定了基础。上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。1 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理 2 分离模式分离模式 3 进样与检测

37、进样与检测 4 毛细管电泳的应用毛细管电泳的应用第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式 06-09 毛细管电泳仪装置示意图 第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式三、毛细管电泳的特点三、毛细管电泳的特点 1.高灵敏度高灵敏度 2.高速度高速度 3.高分辨率高分辨率 4.样品少样品少 5.自动化程度高自动化程度高 6.应用范围广应用范围广 06-10 英特雷勃英特雷勃 全自动电泳仪全自动电泳仪第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式一、毛细管电泳的相关概念一、毛细管电泳的相关概念 1.1.电

38、场强度电场强度 （Electric Field StrengthElectric Field Strength）2.2.电泳淌度电泳淌度 (Electrophoretic Mobility)(Electrophoretic Mobility)3.3.迁移时间迁移时间 （Migration TimeMigration Time）4.4.电泳速度电泳速度 (Electrophoretic Velocity)(Electrophoretic Velocity)5.5.电渗流电渗流 （Electroosmotic FlowElectroosmotic Flow，EOFEOF）6.6.焦耳热焦耳热 （J

39、oule HeatingJoule Heating）第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式 二、毛细管电泳的基本工作原理二、毛细管电泳的基本工作原理 溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异淌度和分配行为上的差异 而实现分离。而实现分离。第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 2 电泳和电渗电泳和电渗 电泳电

40、泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。移动的现象。电渗电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。液体沿固体表面移动的现象。第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电泳电泳行为与特性使用淌度描述行为与特性使用淌度描述 即单位场强即单位场强(E E)下离下离子的平均电泳速度子的平均电泳速度 ep=/E实验中，只发生电泳时有效淌度实验中，只发生电泳时有效淌度 ef=ef (L/V)=(l/tm)(L/V)毛细管有效长

41、度毛细管有效长度 迁移时间迁移时间 毛细管总长度毛细管总长度 电压电压 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗电渗与固液界面的双电层有着密切的关系与固液界面的双电层有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成

42、了电渗流（迁移，便形成了电渗流（electroosmotic flow,EOF）。）。固液两相间的固液两相间的总电势总电势-热力学热力学电势电势-0 Zeta电势电势-第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的流型特点电渗流的流型特点电渗流电渗流 HPLCHPLC塞流塞流 层流层流 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的表示电渗流的表示电渗流的大小可用淌度电渗流的大小可用淌度(eo)或电渗流系数表示或电渗流系数表示 eo=eo/E=l/(teoE)电渗流速

43、度电渗流速度 毛细管有效长度毛细管有效长度 电渗流流出时间电渗流流出时间 电场强度电场强度 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的意义电渗流的意义1.1.电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象2.2.电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快5 57 7倍倍3.3.利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析完成正、负离子的分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重

44、要参数电渗流是毛细管电泳分离的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。泳分离的效率、重现性、分离度。分情况而论第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 改变电渗流的方法改变电渗流的方法1.1.改变外加径向电场改变外加径向电场2.2.改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液成分和浓度 ZetaZeta电势电势3.3.改变缓冲液改变缓冲液pHpH4.4.加入添加剂加入添加剂5.5.改变温度改变温度 粘度粘度 盐盐-离子强度离子强度表面活性剂表面活性剂eo正比于正比于Zeta电

45、势和介质的介电常数介电常数 反比于介质的黏度介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度双电层厚度和界面有效电荷密度界面有效电荷密度 反比于介质的介电常数介电常数第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 区带宽度区带宽度展宽因素展宽因素 1.焦耳热焦耳热 2.流型流型3.电泳扩散电泳扩散4.毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附 焦耳热焦耳热 细内径（细内径（100100mm），粗外径的毛细管柱），粗外径的毛细管柱 温度轮廓温度轮廓-黏度轮廓黏度轮廓 -速度轮廓速度轮廓第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管

46、电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 进样进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。一般进样区带控制在柱长的1%电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。而引起区带电分散。D值低的物质展宽程度小。值低的物质展宽程度小。第第22章章 毛细管电泳毛

47、细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有：使用极端使用极端pHpH条件条件 加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物 对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式四、毛细管电泳的分离

48、模式四、毛细管电泳的分离模式 （一）毛细管区带电泳（一）毛细管区带电泳 它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离的。根据组分的迁移时间的。根据组分的迁移时间 进行定性，根据电泳峰进行定性，根据电泳峰 的峰面积或峰高进行定的峰面积或峰高进行定 量分析。量分析。06-11 毛细血管区带电泳原理图 第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式（二）毛细管凝胶电泳（二）毛细管凝胶电泳 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进

49、行的电泳。将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。适用于分离、测定肽类、蛋白质、适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的类物质的分离。分离。毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的的优点优点 :1.1.电泳峰尖锐，柱效极高电泳峰尖锐，柱效极高2.2.短柱上实现极好的分离短柱上实现极好的分离3.3.试样容量为试样容量为10101212g g主要缺点主要缺点:制备柱较困难，寿

50、命较短制备柱较困难，寿命较短已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、酸、DNADNA等强有力的工具。例应用等强有力的工具。例应用CGECGE分离与分离与激光诱导荧光检测相结合，用于激光诱导荧光检测相结合，用于DNADNA序列快速序列快速分析。分析。第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式3 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳第四节第四节 毛细管电泳的基本结构和分离模式毛细管电泳的基本结构和分离模式（三）毛细管胶束电动色谱（三）毛细管胶束电动色谱(MECC)使使MECC系统中存在两个相：流动的水相和起系统中存在两个相：流动的水相和起