1、CompanyLOGO第二单元第二单元 原料预处理技术原料预处理技术学习目标学习目标v1.发酵液预处理的目的和主要方法及其原理。v2.常用的细胞破碎方法及原理。v3.生物分离常用的离心、过滤方法。第一节第一节 概述概述v微生物发酵或动植物细胞培养结束后，发酵液(或培养液)中除含有所需的生物活性物质外，还存在大量的菌体菌体、细胞细胞、胞内外胞内外代谢产物代谢产物及及剩余的培养基成分剩余的培养基成分等。常规处理方法常规处理方法v先将菌体或细胞、固态培养基等固体悬浮固体悬浮颗粒颗粒与可溶性组分可溶性组分分离(即固固-液分离液分离)，然后再进行后续的分离纯化操作单元。v对于胞内产物胞内产物来说，应先经
2、细胞破碎细胞破碎，使生物活性物质转移到液相转移到液相后，再经固-液分离除去细胞碎片等固体杂质。v常用的固-液分离方法主要是：过滤过滤和离离心心。v但是不同来源的培养液和发酵液其固-液分离速度差异很大差异很大，取决于该介质的理理化性状化性状，主要是细胞或菌体的大小细胞或菌体的大小和介介质的黏度质的黏度。v细胞絮凝技术细胞絮凝技术是近年来发展很快的一种行之有效的方法。v发酵液中杂质很多，对后续分离影响最大的是高价无机离子高价无机离子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和杂蛋杂蛋白白等。v在预处理时，应尽量出去这些物质。第二节第二节 预处理的目的和方法预处理的目的和方法v一、预处理的目的v改变发酵液的物
3、理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离提高固液分离器的效率器的效率。v尽可能使产物转入便于后处理便于后处理的某一相中(多数是液相)。v去除去除发酵液中部分杂质部分杂质，以利于后续各步操作。二、预处理方法二、预处理方法v1.加热法v此法的关键取决于产品的热稳定性热稳定性。v是最简单廉价最简单廉价的预处理方法，加热可降低悬浮液的强度，加速聚集作用，去除某些蛋白质杂质，破坏凝胶状结构，增加滤饼孔隙度，使固液分离变容易。v2.调节悬浮液的pH值v这个方法也很简便很简便。v全细胞的聚集作用取决于pH值的大小，恰当的pH能够促进聚集作用促进聚集作用，一般用草酸或草酸或无机酸或碱无机酸或碱来调
4、节。v3.凝聚和絮凝v都是悬浮液预处理悬浮液预处理的重要方法。v都是将化学药剂化学药剂预先投入悬浮液，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，分散状态，破坏其稳定性破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮絮凝体凝体，再进行分离。v凝聚和絮凝都能有效增加颗粒尺寸增加颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率沉降或浮选速率，提高滤饼的渗透性或在深层过滤时产生较好的颗粒保留作用。v深层过滤深层过滤：颗粒尺寸比介质的孔道直径小得多，但孔道弯曲细长，颗粒进入之后很容易被截住，更由于流体流过时所引起的挤压和冲撞作用，颗粒紧附在孔道的壁面上，这种过滤是在介质内部进行的，介质表面无滤饼形成。凝聚和絮凝凝聚和絮凝凝聚凝
5、聚：在投加的化学物质(如：水解的凝聚剂，铝、铁的盐类或石灰等)作用下，胶体脱稳胶体脱稳并使粒子相互聚集使粒子相互聚集成1mm大小的块状凝聚体的过程。v凝聚剂的作用：对粒子表面电荷的中和；消除双电荷层而脱稳；通过氢键或其他复杂的形式与粒子结合发生凝聚。凝聚和絮凝凝聚和絮凝v絮凝：使用絮凝剂(通常是天然或合成的大分子质量聚电解质)将胶体粒子交联成网交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。v絮凝剂的作用：桥架作用。v絮凝剂絮凝剂相对凝聚剂而言更昂贵更昂贵，其使用剂量必须正确使用并仔细优化正确使用并仔细优化。v最佳的絮凝剂使用剂量为：一般为大概一一半的粒子半的粒子表面被聚合物覆盖时所使用的絮凝剂剂量。
6、凝聚剂和絮凝剂的类型凝聚剂和絮凝剂的类型v凝聚剂：主要是无机类电解质无机类电解质，大多为阳阳离子型离子型，分无机盐类、金属氢氧化物类和聚合无机盐类等。v絮凝剂：其官能团分为阴离子、阳离子和非离子三大类型。4.去除杂蛋白质的其他方法去除杂蛋白质的其他方法v等电沉淀法v蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀除去。v很多蛋白质的等电点在酸性范围内(pH为4.0-5.5)。有些蛋白质在等电点时仍有溶解度，可结合其他方法。v变性沉淀v蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称变性，变性蛋白质在水中的溶解度较小而产生沉淀。v方法：加热、大幅改变pH、加有机溶剂(丙酮、乙醇等)、加重金属离子(Ag+,Cu2+,
7、Pb2+等)、加有机酸(三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等)及表面活性剂。v吸附v吸附作用常能有效除去杂蛋白质。v在发酵液中加入一些反应剂，它们相互反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。5.不溶性多糖的去除不溶性多糖的去除v不溶性多糖较多时，发酵液黏度增大，固液分离困难，采用酶酶将其转化为单糖以提高过滤速度。v如在蛋白酶发酵液中加入淀粉酶，能将培养基中多余的淀粉水解成单糖，降低发酵液黏度，提高滤速。6.高价金属离子的去除高价金属离子的去除v对成品质量影响较大的无机杂质主要有：Ca2+,Mg2+,Fe3+等高价金属离子，预处理中应将它们除去。1、概念、概念 细胞破碎是用细胞破碎是用
8、物理、化学、酶或或机械的方法来破的方法来破坏细胞壁或细胞膜的方法。坏细胞壁或细胞膜的方法。细胞破碎技术是指利用外力破坏细细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。出来的技术。2、目的、目的 破坏细胞外围，使破坏细胞外围，使细胞内容物释放出来。释放出来。第三节第三节 细胞破碎技术细胞破碎技术v3.原理v细胞的结构v细胞壁的破碎最关键。v动物细胞无细胞壁，易于破碎。v植物和微生物细胞的细胞壁坚固，破碎困难。v细菌细菌v革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖肽聚糖层组成，细胞壁厚细胞壁厚，为15-50n
9、m。v革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌的细胞壁在肽聚糖肽聚糖外侧还有脂蛋白脂蛋白和和脂多糖脂多糖及及磷脂磷脂构成的两层外壁层，肽聚糖层1.5-2nm，外壁层8-10nm。v因此革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎。细胞壁的结构及组成图图3.13.1 细胞外层结构细胞外层结构 v真菌和酵母真菌和酵母v细胞壁细胞壁呈丝状呈丝状，比比革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌的细胞的细胞壁壁厚，约厚，约60nm，更难破碎更难破碎。v霉菌霉菌v细胞壁细胞壁较厚较厚，为，为100-250nm。v哺乳类细胞、嗜盐菌和支原体哺乳类细胞、嗜盐菌和支原体v哺乳类细胞和嗜盐菌缺乏坚硬的细胞壁，哺乳类细胞和嗜盐菌缺乏坚硬的细胞壁
10、，支原体没有细胞壁，易破碎。支原体没有细胞壁，易破碎。v藻类藻类v细胞壁较复杂较复杂，其主要成分是纤维状纤维状的多糖类物质多糖类物质。细胞壁的结构及组成微生物微生物革兰式阳性菌革兰式阳性菌革兰式阴性菌革兰式阴性菌酵母酵母壁厚（壁厚（nm）20801025100300层层单层单层多层多层多层多层主要组成主要组成肽聚糖肽聚糖(4090%)肽聚糖肽聚糖(510%)葡聚糖葡聚糖(3040%)多糖多糖脂蛋白脂蛋白甘露聚糖甘露聚糖（30）胞壁酸胞壁酸脂多糖脂多糖蛋白质蛋白质磷脂磷脂蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖蛋白质蛋白质脂类脂类破碎难易程度破碎难易程度难难相对易相对易最难最难各种微生物细胞壁的结构及组成各种微
11、生物细胞壁的结构及组成细胞破碎和产物释放原理v细胞破碎主要采用各种机械破碎法机械破碎法和化化学破碎法学破碎法，或二者的结合。v机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力压缩力和剪切力剪切力。v化学破碎又称化学渗透化学渗透，利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质溶解速率；或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压的作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。破碎方法细胞破碎机理细胞破碎机理破碎方式破碎方式机械法机械法非机械法非机械法液体剪液体剪切作用切作用固体剪固体剪切作用切作用干燥干燥处理处理溶胞溶胞作用作用珠磨法珠磨法压榨压榨高压高压匀浆匀浆超声超声破碎破碎酶溶酶溶法法化学法化学
12、法 物理法物理法细胞破碎方法分类细胞破碎方法分类细胞壁的破碎破碎方法的选择：破碎方法的选择：破碎目的破碎目的 待破碎生物体的类型待破碎生物体的类型v破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗；破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗；研究胞内产物在体内的功能，宜研究胞内产物在体内的功能，宜 采用软处理。采用软处理。v待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不 同的敏感度同的敏感度细胞壁的破碎 细胞对破碎的敏感度细胞对破碎的敏感度细胞细胞声波声波搅拌搅拌减压减压冷冻压力冷冻压力动物细胞动物细胞7777革兰式阴性芽孢杆菌和球菌革兰式阴性芽孢杆菌和球菌6566革兰式阳
13、性芽孢杆菌革兰式阳性芽孢杆菌5（4）54酵母酵母3.5342.5革兰式阳性球菌革兰式阳性球菌3.5（2）325孢子孢子2（1）21菌丝菌丝16（1）5 生物体的大小，形态，龄期，品系，生生物体的大小，形态，龄期，品系，生长条件，细胞壁结构，长条件，细胞壁结构，pH，温度以及细胞，温度以及细胞的变化也影响对破碎的敏感度。的变化也影响对破碎的敏感度。1.机械破碎方法HC23-HC23-高压细胞破碎机高压细胞破碎机 高压匀浆法高压匀浆法DY89-1 型电动玻璃匀型电动玻璃匀浆机浆机作用机理：作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速阀之间的环隙高速(可达到
14、可达到450m450ms)s)喷出后喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为作压力通常为505070MPa70MPa。高压匀浆法高压匀浆法1.机械破碎方法影响细胞破碎的因素：影响细胞破碎的因素：温度温度压力压力循环操作次数循环操作次数细胞浓度细胞浓度阀座形式阀座形式 高压匀浆法高压匀浆法影响破碎效率的因素温度：温度：破碎率随温度的增加而增加破碎率随温度的增加而增加例如：操作温度由例如：操作温
15、度由55增加到增加到3030，破碎率约提高破碎率约提高1.51.5倍。倍。高温对破碎有利，但应考虑热变性高温对破碎有利，但应考虑热变性压力每增加压力每增加10MPa10MPa，温度，温度22。适用于酵母和细菌细胞的破碎。适用于酵母和细菌细胞的破碎。高压匀浆法高压匀浆法1.机械破碎方法珠磨机简图珠磨机简图 珠磨法珠磨法生产厂商生产厂商:瑞士瑞士WAB公司公司 德国西门子德国西门子机械公司机械公司形式：形式：立式立式卧式卧式（效率高）（效率高）原理：原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲
16、击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套带走。和撞击而破碎。产热由夹套带走。珠磨法珠磨法珠磨机主体：珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体立式和卧式圆筒型腔体一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为因为立式机中向上流动的液体在某种程度上会立式机中向上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。研磨珠：研磨珠：玻璃玻璃(密度为密度为2.5g2.5gcmcm3 3)或氧化或氧化锆锆(密度为密度为6.0 g6.0 gcmcm3 3)微球微球(粒径约粒径约0.10.11
17、0mm)10mm)，填充率为，填充率为80808585。1.机械 破碎方法动力学方程：遵循一级动力学方程动力学方程：遵循一级动力学方程珠磨法珠磨法1.3.)(RRkdtdRmR：t时间内释放的蛋白质数量（时间内释放的蛋白质数量（mg/g）Rm：能释放的蛋白质最大数量，即：能释放的蛋白质最大数量，即100破碎破碎 k：破碎速率常数，与珠粒大小、填充率、细胞浓度等有关：破碎速率常数，与珠粒大小、填充率、细胞浓度等有关2.3.1100ktxLnkdtRRdRtRm其中：其中：SR/Rm，破碎率，破碎率1.机械 破碎方法影响破碎效率的因素：影响破碎效率的因素：v转盘外缘速度转盘外缘速度v细胞浓度细胞浓
18、度v珠粒大小及装载量珠粒大小及装载量v温度温度v流速流速珠磨法珠磨法1.机械 破碎方法v珠磨法破碎过程产生大量热能，设珠磨法破碎过程产生大量热能，设计时需考虑换热问题。计时需考虑换热问题。v适用于绝大多数真菌菌丝和藻类等适用于绝大多数真菌菌丝和藻类等微生物细胞的破碎。微生物细胞的破碎。v影响破碎率的操作参数较多，操作影响破碎率的操作参数较多，操作过程优化设计较复杂。过程优化设计较复杂。珠磨法珠磨法1.机械 破碎方法原理：原理：v细胞是弹性体，比一般刚性固体粒子难于细胞是弹性体，比一般刚性固体粒子难于破碎。将弹性细胞冷冻使其成为刚性球体，破碎。将弹性细胞冷冻使其成为刚性球体，降低破碎难度，撞击破
19、碎正是基于这样的降低破碎难度，撞击破碎正是基于这样的原理。原理。操作：操作：v细胞悬浮液以喷雾状高速冻结细胞悬浮液以喷雾状高速冻结(冻结速度冻结速度为每分钟数千摄氏度为每分钟数千摄氏度)，形成粒径小于，形成粒径小于50um50um的微粒子。高速载气的微粒子。高速载气(如氮气，气流如氮气，气流约为约为300m/s)300m/s)将冻结的微粒子送入破碎室，将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。撞击破碎法撞击破碎法1.机械 破碎方法特点：特点：v细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎均匀，可
20、避免反复受力发生过度细胞破碎均匀，可避免反复受力发生过度破碎的现象。破碎的现象。v细胞破碎程度可通过无级调节载气压力细胞破碎程度可通过无级调节载气压力(流速流速)控制，避免细胞内部结构的破坏，控制，避免细胞内部结构的破坏，主要用于细胞器主要用于细胞器(如线粒体、叶绿体等如线粒体、叶绿体等)的的回收。回收。v撞击破碎适用于微生物细胞和植物细胞的撞击破碎适用于微生物细胞和植物细胞的破碎。破碎。撞击破碎法撞击破碎法1.机械 破碎方法JY92-JY92-型超声波细胞粉碎机型超声波细胞粉碎机 超声波法超声波法1.机械 破碎方法作用机理：作用机理：在超声波作用下，液体发生空化作用在超声波作用下，液体发生空
21、化作用(cavitaton)(cavitaton)，空穴的形成、增大和闭合产，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。声波的声频、声能有关。超声波法超声波法1.机械破碎方法超声波的负面影响：超声波的负面影响：1 1、温度上升：悬浮液预冷，夹套冷却、温度上升：悬浮液预冷，夹套冷却 短期冷却与短期破碎交替。短期冷却与短期破碎交替。2 2、超声处理会引起诸如游离基这样的化学、超声处理会引起诸如游离基这样的化学效应，破坏目的产物，可加入游离基清除
22、效应，破坏目的产物，可加入游离基清除剂（组氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。剂（组氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。3.3.影响因素：声强、声频、温度、时间、离影响因素：声强、声频、温度、时间、离子强度、子强度、pHpH、细胞类型。、细胞类型。超声波法超声波法1.机械 破碎方法机械法破碎细胞的优缺点：机械法破碎细胞的优缺点：优点：优点：v内含物全部释放内含物全部释放v时间短，效率高，成本低时间短，效率高，成本低v通用性强，适于实验室和工业生产通用性强，适于实验室和工业生产缺点：缺点：v需要高的能量需要高的能量v产生高温，高剪切力，引起产品变性失活产生高温，高剪切力，引起产品变性失活v非专一性，碎片分布宽，
23、给分离造成困难非专一性，碎片分布宽，给分离造成困难2.化学和生物化学渗透法化学和生物化学渗透法(非机械法非机械法)作用机理：作用机理：用化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分用化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分处理方法：处理方法：酸碱处理；化学试剂；表面活性剂；有机溶剂酸碱处理；化学试剂；表面活性剂；有机溶剂EDTAEDTA螯合剂；变性剂螯合剂；变性剂化学渗透法化学渗透法2.化学和生物化学渗透法化学和生物化学渗透法(非机械法非机械法)v酸碱处理v调节pH，改变蛋白质的荷电性质，提高产物的溶解度。v化学试剂处理v用表面活性剂或有机溶剂(甲苯)处理细胞，增大细胞壁的通透性，降低胞内产物的相互作
24、用，使之容易释放。2.化学和生物化学渗透法化学和生物化学渗透法(非机械法非机械法)优点：优点：v产物释放有一定的产物释放有一定的 选择性选择性v不需要特殊设备不需要特殊设备v细胞外形保持完整，细胞外形保持完整，细胞碎片少，浆液粘细胞碎片少，浆液粘 度低，利于后续分离度低，利于后续分离化学渗透法化学渗透法缺点：缺点：v通用性差通用性差v时间长，效率低时间长，效率低v某些化学试剂有毒某些化学试剂有毒2.化学和生物化学渗透法化学和生物化学渗透法(非机械法非机械法)应用：应用：v检测胞内酶活性检测胞内酶活性v释放胞内物质研究释放胞内物质研究化学渗透法化学渗透法2.化学和生物化学渗透法化学和生物化学渗透
25、法(非机械法非机械法)作用机理：作用机理：酶溶法酶溶法(Enzymaticlysis)(Enzymaticlysis)利用溶解细利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大脑内产物的遇透性。增大脑内产物的遇透性。溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTAEDTA使之更有效地作用于使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用细胞
26、壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。酵母细胞的酶溶需用不同的酶。酵母细胞的酶溶需用Zymo1yase(Zymo1yase(几种细菌几种细菌酶的混合物酶的混合物)、-1,6-1,6葡聚糖酶葡聚糖酶(或甘露糖酶）；破或甘露糖酶）；破坏植物细胞壁需用纤维素酶。坏植物细胞壁需用纤维素酶。酶法胞溶酶法胞溶2.化学和生物化学渗透法化学和生物化学渗透法(非机械法非机械法)优点：优点：v产品释放选择性高产品释放选择性高v抽提速率和收率高抽提速率和收率高v产品破坏少产品破坏少vpHpH、温度外界条件要求低、温度外界条件要求低v不残留细胞碎片不残留细胞碎片酶法胞溶酶法胞溶缺点：缺点：v费用高费用高
27、v通用性差通用性差v存在产品抑制存在产品抑制v不适于工业生产不适于工业生产2.化学和生物化学渗透法化学和生物化学渗透法(非机械法非机械法)应用：应用：v原生质体融合原生质体融合v释放出克隆出的胞内蛋白释放出克隆出的胞内蛋白v制取特殊的壁葡萄糖聚合物制取特殊的壁葡萄糖聚合物v与机械法破碎细胞协同使用与机械法破碎细胞协同使用v从细胞内不同的位置选择性的释放蛋白从细胞内不同的位置选择性的释放蛋白酶法胞溶酶法胞溶3.物理渗透法渗透压冲击法：渗透压冲击法：将细胞置于高渗透压的介质中，使之将细胞置于高渗透压的介质中，使之脱水收缩，达到平衡后，将介质突然稀脱水收缩，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低
28、渗透压的水或缓冲释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲液中，在渗透压的作用下，外界的水向液中，在渗透压的作用下，外界的水向细胞内渗透，使细胞变得肿胀，膨胀到细胞内渗透，使细胞变得肿胀，膨胀到一定程度，细胞破裂，它的内含物随即一定程度，细胞破裂，它的内含物随即释放到溶液中。释放到溶液中。物理法物理法3.物理渗透法渗透压冲击法：渗透压冲击法：渗透压冲击渗透压冲击(Osmotic shock)(Osmotic shock)是在各种是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细咆，如动物细胞和革兰氏阴于破碎的细咆，如动物细胞和革兰氏阴性菌。性菌。物理法物理法3.
29、物理渗透法冻融法：冻融法：将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，出于胞内水结晶使胞内外另一方面，出于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。胞膨胀而破裂。物理法物理法3.物理渗透法冻融法：冻融法：操作：将细胞急剧冻结至操作：将细胞急剧冻结至-20-15，使之凝固，然使之凝固，然后在室温缓慢融化，
30、此后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。胞受到破坏。缺点：反复冻融使蛋白质变性，影响缺点：反复冻融使蛋白质变性，影响活性蛋白质的回收率。活性蛋白质的回收率。冻融法适用于比较脆弱的菌体。冻融法适用于比较脆弱的菌体。物理法物理法3.物理渗透法干燥法：干燥法：将细胞用不同的方法干燥（真空、冷冻将细胞用不同的方法干燥（真空、冷冻、喷雾和气流等），细胞膜结合水丧失，渗、喷雾和气流等），细胞膜结合水丧失，渗透性发生变化而破裂透性发生变化而破裂缺点：条件变化剧烈，易引起生物物质变性缺点：条件变化剧烈，易引起生物物质变性物理法物理法机械破碎法和非机械破碎法
31、的比较机械破碎法和非机械破碎法的比较比较项目比较项目 机械法机械法 非机械法非机械法比较项目比较项目 机械法机械法 非机械法非机械法破碎机理破碎机理 切碎细胞切碎细胞溶解局部溶解局部壁膜壁膜效率效率效率高效率高效率低效率低碎片大小碎片大小 碎片细小碎片细小 碎片较大碎片较大设备设备需专用需专用设备设备不需专不需专用设备用设备内含物内含物释放释放全部全部部分部分通用性通用性强强差差粘度粘度高（核酸高（核酸多）多）低（核酸低（核酸少）少）经济经济成本低成本低成本高成本高时间时间时间短时间短时间长时间长应用范围应用范围实验室、实验室、工业范围工业范围实验室实验室范围范围破碎技术的选择原则：破碎技术的
32、选择原则：v目的产物在细胞质中，需机械破碎法目的产物在细胞质中，需机械破碎法v目的产物在细胞膜附近，可采用非机械目的产物在细胞膜附近，可采用非机械破碎法破碎法v目的产物与细胞膜或细胞壁结合，可采目的产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用两种方法结合用两种方法结合破碎技术的研究发展方向：破碎技术的研究发展方向：v 多种破碎方法结合多种破碎方法结合v 与上游过程结合与上游过程结合 1 1、培养过程控制、培养过程控制 2 2、寄主细胞选择、寄主细胞选择 3 3、克隆噬菌体溶解基因、克隆噬菌体溶解基因 4 4、耐高温产品的基因表达、耐高温产品的基因表达v 与下游结合与下游结合 从后分离过程考察细胞破碎技术从
33、后分离过程考察细胞破碎技术第四节第四节 离心沉降与过滤分离技术离心沉降与过滤分离技术v一、离心沉降v 沉降基本原理v重力沉降重力沉降：适用于分离较大的颗粒较大的颗粒。v重力沉降过程中固体颗粒受到重力重力、浮力浮力和摩擦阻力摩擦阻力的作用。v当浮力、摩擦阻力和重力达到平衡时，球形固体颗粒匀速沉降。沉降基本原理沉降基本原理v沉降速度：v式中：dp球形粒子直径，mv s 粒子的密度，kg/m3v L 介质的密度，kg/m3v g 重力加速度，m/s2v L 流体介质的黏度，Pas2PsLLd-g18V 离心沉降离心沉降离心沉降：离心沉降：依靠惯性离心力的作用而实现的沉降过程。依靠惯性离心力的作用而实
34、现的沉降过程。适于分离两相密度差较小，颗粒粒度较细的非均相物系。适于分离两相密度差较小，颗粒粒度较细的非均相物系。气固物系：旋风分离器；气固物系：旋风分离器；液固物系：旋液分离器或沉降离心机。液固物系：旋液分离器或沉降离心机。离心沉降离心沉降v离心沉降速度：v式中：N转鼓转速，r/minv r 球形粒子半径，mv S 沉降系数v 转鼓的旋转角速度，rad/sL2 22PsL22 d-Nr=r9VS 离心沉降离心沉降从该式可以看出：当s L，则S 0，粒子顺着离心方向沉降。当s=L，则S=0，粒子到达某一位置后达到平衡。当sL，则S 0，粒子逆着离心方向上浮。蛋白质离心沉降时，蛋白质的相对分子质
35、量越大，沉降系数越大，离心沉降速度越大。L2PsLd-1 8S离心分离法离心分离法v1.差速离心分离法v原理：v 利用不同粒子在离心力场中沉降的差别(大而重的颗粒沉降最快，最先到达底部)，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分级沉淀。v操作：v 一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。v优点：操作最简便，使用最广泛。v缺点：分辨率不高，沉淀系数在同一数量级内的各种粒子不容易分开，常用于粗制品提取。v2.区带离心分离法v 根据操作条件不同，分
36、为差速区带离心和平衡区带离心。v3.差速区带离心分离法v在离心前将密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)装入离心管内，溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加，待分离的样品铺在梯度液的顶部，同梯度液一起离心。差速区带离心分离法差速区带离心分离法v离心后在近旋转轴(r1)处的介质密度最小，离旋转轴最远(r2)处介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即s L。v梯度液在离心过程中和离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免分层粒子的再混和。v此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。v4.等密度离心分离法v在
37、离心前预先配制介质的密度梯度，密度梯度液包含被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，梯度液形成底浓顶稀的密度梯度，原来分布均匀的粒子也发生重新分布。v在管顶处粒子密度大于介质密度，粒子沉降；当管底介质的密度大于粒子密度，粒子上浮；粒子进入它本身的密度位置，粒子不再移动。v只要转速、温度不变，延长离心时间也不改变粒子的成带位置。v此法应用于物质的大小相近，密度差异较大时。Centrifuges 离心分离设备离心分离设备SuprenatantWet SolidsFigure 3.2 Schematic representation of centrifu
38、gal separationcentrifugation 常用的离心机：常用的离心机：a、Tubular bowl:管式离心机管式离心机v最简单，可提供较大离心力；最简单，可提供较大离心力；v管状离心机可以冷却，在蛋白质生产中很管状离心机可以冷却，在蛋白质生产中很有利；有利；v悬浮液由管底进，澄清液由管口流出。悬浮液由管底进，澄清液由管口流出。管式离心机管式离心机 特点是转鼓(管)直径小、长度大、转速高、分离效率很高，可以处理颗粒粒径为0.01mm的悬浮液和难分离的乳浊液。可连续操作，悬浮液或乳浊液由转鼓下端加入，被转鼓内的纵向肋板带动迅速达到与转鼓同角速度旋转。在离心力作用下，颗粒或重液层甩
39、向鼓壁由重液出口引出，轻液则从转鼓中心部位溢出。离心分离因数可达65,000，工业上可用于油水分离，实验室中可用于分离微生物和蛋白质。管式离心机示意图 重相出口轻相出口进料Tubular bowlv管壁上沉积物为浓浆管壁上沉积物为浓浆v*可连续加料至流出物固体损失使离心不可连续加料至流出物固体损失使离心不能正常进行能正常进行v*须定时拆卸、清洗，这种间断性操作也须定时拆卸、清洗，这种间断性操作也是最大的缺点是最大的缺点SRBA2 圆筒式离心机圆筒式离心机p悬浮液沿圆筒的旋转轴连续悬浮液沿圆筒的旋转轴连续加入，通过筒壁上的小孔流出加入，通过筒壁上的小孔流出 p中空柱状料液的内径为一常中空柱状料液
40、的内径为一常数，不随料液的加入而改变数，不随料液的加入而改变 p滤饼在筒壁上沉积滤饼在筒壁上沉积适用于各种悬浮液或乳浊液、尤其是粒度细小、密度差不大的体系的分离。离心分离因素达 50,000 以上的超高速离心机甚至可以使不同分子量的蛋白质分子在具有密度梯度的溶液中分级。沉降离心机工作原理 RR 0悬浮液清液溢流转鼓碟式离心机碟式离心机(薄层分离沉降离心机薄层分离沉降离心机)转鼓内装有一叠随转鼓旋转的倒锥形碟片，碟片间隙为0.51.5mm，分离因素可达300010000。悬浮液由中心管引入转鼓，分配在碟片之间形成薄层流动。在离心力作用下，颗粒沉降到碟片内侧表面并向外滑动。清液则沿碟片外侧表面向内
41、流动。碟片扩展了沉降面，缩短了沉降距离，故具有较大的生产能力和较高的分离效率，适于处理粒径0.1100mm、固含量小于25%的悬浮液。喷嘴排渣碟式离心机底液进料溢流液b、Disc type centrifuge 碟片式离心机碟片式离心机v*这种离心机在生物分离中非常常见，这种离心机在生物分离中非常常见，可连续操作但结构复杂，价格较高。可连续操作但结构复杂，价格较高。v*料液由管顶进，清液从加料口附近环料液由管顶进，清液从加料口附近环行裂口流出行裂口流出v 和管式离心机最显著的区别：固体即非和管式离心机最显著的区别：固体即非间歇式的被移出，也不通过离心机管壁间歇式的被移出，也不通过离心机管壁上的
42、孔连续的去除上的孔连续的去除v 填充固体的性质决定离心机类型填充固体的性质决定离心机类型v 微粒在离心力场作用下微粒在离心力场作用下,将沿碟片底部将沿碟片底部运动到碟片外边缘运动到碟片外边缘,汇集到滤渣中汇集到滤渣中，再，再清除掉。清除掉。二、过滤二、过滤v1.过滤基本原理v利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固-液分离的方法。v是工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法。v对于一定形状的粗大、坚硬晶体来说，这一操作并不困难，但对于过滤的对象是生物体，发酵液中的微生物细胞均是易变形的柔软体，一经压缩就会变形，且发酵液黏度很大，因此过滤困难。v2.影响过滤的因素v混合物中悬浮微粒的
43、性质和大小v悬浮微粒越大，粒子越坚硬，大小越均匀，固-液分离越容易。v发酵液中细菌体积较小，分离较困难。v胶体粒子通常悬浮于流体中，须运用凝聚和絮凝技术，增大悬粒子体积，利于固-液分离。v混合液的黏度v流体的流动特性对固液分离的影响很大，流体的黏度越大，固液分离越困难。v通常黏度与组成和浓度有关，组成越复杂，浓度越高，黏度越大。v操作v温度、pH等的控制也会影响固液分离速率。温度升高，流体黏度降低；调整pH可改变流体黏度，使固液分离效率提高。v助滤剂的使用v惰性助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围，减轻过滤时的快速挤压和介质堵塞的现象。v助滤剂的机理：
44、v 助滤剂具有吸附胶体的能力，助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会全部堵塞，保持渗透性。既能使细小颗粒状胶态物质截留在格子骨架上，又能使清液有流畅的通道。v助滤剂的使用方法：v在滤布上预先涂一层助滤剂，作为过滤介质使用，待滤毕后与滤饼一起除去。v按一定比例均匀混入待滤的悬浮液中，一起进入过滤机，形成较疏松的滤饼，降低其可压缩性，让滤液顺畅流通。v惰性助滤剂的材料：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳渣、重质碳酸钙或这些材料的混合物。v选择和使用助滤剂时应考虑以下因素：v根据目标物的性质选择助滤剂品种。v若目标物存在于液相，应考虑目标物是否会被助滤剂吸附，是否可通过改变
45、pH来减少吸附；若目标物存在于固相，一般使用淀粉、纤维素等不影响产品质量的助滤剂。v根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种。v当使用粗目滤网时易泄漏，采用石棉粉、纤维素、淀粉等助滤剂可有效防止泄漏。v当使用细目滤布时，宜采用细硅藻土，若用粗粒硅藻土，料液中的细微颗粒仍将透过助滤层到达滤布表面，增大过滤阻力。v粒度选择。v助滤剂的粒度及粒度分布对过滤速率和滤液澄清度影响很大。v粒度一定时，过滤速率与澄清度成反比，过滤速率大，澄清度差；过滤速率小，澄清度好。v助滤剂的粒度必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应，如颗粒较小的悬浮液应采用较细的助滤。v用量的确定。v助滤剂的用量必须适宜。用量过少，助滤作用小
46、；用量过多，不仅浪费，还会因助滤剂成为主要的滤饼阻力而使过滤速率下降。3.过滤方程过滤方程v用数学形式描述过滤操作，可从流体力学的基本观点出发，即v从生物化工原理中可知，过滤的基本方程是达西公式：v式中，式中，A过滤断面积，过滤断面积，m2 Rm 介质阻力，介质阻力，m-1v p 压力差，压力差，Pa Rc 滤饼阻力，滤饼阻力，m-1v L 流体介质的黏度，流体介质的黏度，Pas推动力速率阻力LmcdA p=dt(R+R)Qv过滤的阻力来自于过滤介质和滤饼。通常，Rm是常量，Rc随着过滤时间的推移，逐渐增大。v滤饼阻力与滤饼干基质量m的关系为v式中，式中，Rc 滤饼阻力，滤饼阻力，m-1v m
47、 滤饼干重，滤饼干重，kgv 滤饼的平均比阻，滤饼的平均比阻，m/kgv A 过滤断面积，过滤断面积，m2mR c=Av不可压缩滤饼，是常数；可压缩滤饼的是压力差的函数：=k p mv生物过程中，可压缩滤饼最常见。v可压缩滤饼的比阻随压力差提高而增大，因此，过滤操作中，压力差是最重要的操作参数，对可压缩滤饼，一定要缓慢增大操作压力。v过滤时，按照外加压力和流速的变化，可将过滤操作分为：v恒压过滤用压缩空气或真空作为推动力；v恒速过滤用定容泵来输送料液；v变速变压过滤用离心泵来实现。v由于滤饼是影响过滤速度的主要因素，因此在过滤操作前，要对滤液进行絮凝等预处理，降低滤饼的阻力。4.过滤设备过滤设
48、备v生物分离常用的过滤设备主要有：加压叶滤机、板框过滤机、回转真空过滤机等。v 板框过滤机使用最为v 普遍。v(1)板框压滤机v板框压滤机最为常用，由滤板和滤框组成，两者间衬以滤布(过滤介质)。滤板起到支撑滤布和分布悬浮液的作用，滤框则起到存放滤饼的作用。v这里过滤机可以得到含水量较低的滤饼，但当产生有毒气体或生物危险物存在的场合，不宜使用。v其他三种过滤机则都是封闭式的，可用于存在有毒烟雾或生物危险物的场合。v(2)水平板式过滤机v适用于小规模分离操作，滤片的清洗和过滤介质的安装必须放在机外进行。v(3)垂直叶滤机v具有较大的比过滤面积。v(4)管状过滤机v管状垂直过滤机内过滤罐系悬挂在管板
49、上，滤饼在管子外表面形成，滤液流动通过沉积在管上的滤饼进入顶盖并排出，管子可用反冲法清洗。v(5)回转真空过滤机v教材p24三、包含体的分离和蛋白质复性三、包含体的分离和蛋白质复性v包含体：是很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物，在细胞内凝聚成没有生物活性的不溶于水的固体颗粒。v包含体主要由蛋白质构成，它的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。1.包含体的形成与分离包含体的形成与分离v包含体的形成有以下几种可能性：v少量蛋白质产生时是可溶的，其后积聚的量过多，在细胞内超过其溶解度而沉淀，并随诱导时间延长，不溶部分增加，但细胞裂解，并用适当溶剂稀释后，可转为溶解状态。v
50、蛋白质合成太快，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而不溶，此时即使稀释也不能溶解，生物活性受到影响。v高表达的蛋白质没有形成分子内正常的二硫键连接，这可能是由于肽键来不及形成正常的折叠构象而导致错误的二硫键连接，或是高表达时细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的二硫键连接。v蛋白质的溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导形成适当的和可溶性的构象，当产生的蛋白质量过多，所需其他成分相对不足，蛋白质就不能溶解。v包含体的形成亦与蛋白质自身稳定性有关。v因此，工程菌株产生的重组蛋白质的回收应包括以下步骤：v包含体的分离；v用变性剂溶解包含体中的蛋白质；v变性蛋白质的复性和重新氧
