1、大家好大家好猪圆环猪圆环病毒病毒2型型疫苗研究进展疫苗研究进展汇报人：赵微2目录圆环流行情况介绍A存在问题及展望C国内、外圆环疫苗情况B3猪圆环病毒病猪圆环病毒病是危害全球养猪业的重大经济影响性疾病，是危害全球养猪业的重大经济影响性疾病，也是我国养猪业的三大疾病之一，与也是我国养猪业的三大疾病之一，与猪瘟猪瘟和和猪蓝耳病猪蓝耳病并称我并称我国养猪业的三座大山。国养猪业的三座大山。4567 目前，对于猪目前，对于猪2 2型圆环病毒（）造成的相关型圆环病毒（）造成的相关疾病尚无有效的治疗措施，而且圆环病毒对各种消毒剂都有疾病尚无有效的治疗措施，而且圆环病毒对各种消毒剂都有很强的抵抗性，猪场难将其净
2、化，预防该病的首要方案是采很强的抵抗性，猪场难将其净化，预防该病的首要方案是采用用疫苗疫苗进行预防接种。进行预防接种。8PCV2 PCV2 属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种共价闭合、单股环属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种共价闭合、单股环状负链状负链DNADNA病毒，呈二十面体对称，无囊膜。病毒，呈二十面体对称，无囊膜。PCV2 PCV2 病毒粒子直径为病毒粒子直径为17nm 17nm，基因组大小约，基因组大小约1.7kb 1.7kb，是目前发现的最小的动物病毒。，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2 PCV2 的基因组结构存在的基因组结构存在11 11 个开放阅读框个开放阅读框(ORF
3、s)(ORFs)，即，即ORF1-ORF11 ORF1-ORF11，ORFs ORFs 之间大小相差悬殊，所编码的蛋白大小在之间大小相差悬殊，所编码的蛋白大小在2 236ku 36ku。ORF1 ORF1 与与ORF2 ORF2 是是PCV2 PCV2 最大的个开放阅读框，分别编码与病毒复制相关的蛋白最大的个开放阅读框，分别编码与病毒复制相关的蛋白epep和和epep以及病毒的结构蛋白以及病毒的结构蛋白apap。91011ap ap 蛋白作为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，是蛋白作为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，是PCV2 PCV2 的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生特异性
4、免疫应答，是研的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生特异性免疫应答，是研制制PCV2 PCV2 基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。ORF3 ORF3 为病毒复制的非必为病毒复制的非必需基因，其编码的蛋白可诱导需基因，其编码的蛋白可诱导PCV2 PCV2 感染的细胞发生凋亡。许多学者感染的细胞发生凋亡。许多学者在在PCV2 PCV2 基因组结构与功能方面开展了大量研究，除基因组结构与功能方面开展了大量研究，除ORF1,ORF1,ORF2 ORF2 与与ORF3 ORF3 的功能研究较为透彻外，其他的功能研究较为透彻外，其他ORFs ORFs 的功能尚不十分清楚。的
5、功能尚不十分清楚。12目前，国际上统一将PCV2 分为PCV2a、PCV2b、PCV2c 三个基因亚型，其中PCV2a 和PCV2b 是目前存在的主要基因型，PCV2a 仅分离自无PMWS感染猪场，PCV2b 多分离自PMWS发生的猪群，PCV2c亚型毒株仅在20世纪80年代于丹麦分离，在致病性方面未见报道。PCV2在世界范围内广泛分布并且在猪群中存在至少有50多年，血清学和病原学调查己证实全世界范围内许多国家和地区的猪群均存在PCV2感染，几乎100%的商品化养猪场感染过PCV2，严重影响世界养猪业的发展。13目前对该病毒的防控主要依靠疫苗，灭活疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒灭活疫苗已投入使用，
6、核酸疫苗、活载体疫苗和标记疫苗等新型疫苗已成为PCV2 疫苗研究的热点。14PCV2 国外流行情况 2003 2008Olvera15Dupont 等对GenBank 中1997 年至2006 年间上传的218 个PCV2 全基因组进行遗传进化分析，结果发现2003 年前猪群中主要流行PCV2a,之后世界范围内猪群PCV2 感染存在转型趋势，主要以PCV2b 基因型流行为主，同时PCVAD 临床表现较2003 年之前更为严重，但是这些国家不包括韩国、日本和澳大利亚。16 基于以上研究，Tanja Oprissnig 等分析了1996-2013 年间分离自美国和加拿大的750 份样品，1996-
7、2004 年间分离到的毒株均属于PCV2a 基因型，2005 年出现新基因型PCV2b,2006-2013 年的流行株为PCV2b 基因型。172012年月，美国在一PCV2 免疫失败猪场首次分离到毒力均强于PCV2a 和PCV2b 的突变毒株(Mutant porcine circovirus type 2b,PCV2b），由于美国商品化疫苗基于PCV2a 基因型，PCV2b 毒株的发现让人们更加关注当前PCV2a 型疫苗的免疫效果。18北美地区在2004 年前仅流行PCV2a 基因型,2005 年爆发严重的PCVAD,PCV2b 基因型替代PCV2a 型在北美地区商业化猪场迅速蔓延，引起高
8、发病率和死亡率。随后在中国、泰国、韩国、丹麦、瑞士也相继报道了PCV2b 基因型的出现，并在一段时间内与PCV2a 基因型循环流行。192007 年Chae 等在韩国分离到36 株PCV2(PCVAD 发病猪场分离到29 株，PCVAD 未发病猪场株)，29 株均属于PCV2b，PCVAD 未发病猪场中有4 株属于PCV2b。2006-2007 年间，日本存在PCV2a 与PCV2b 两种亚型，但是以PCV2b 为主要流行基因型。20目前，PCV2b 基因型替代PCV2a 型成为优势基因型，有关PCV2 流行毒株遗传变异的报道也逐渐增多，在遗传变异及免疫压力下可能出现其它形式的突变毒株。200
9、8 年ess等报道了PCV2a 与PCV2b 重组毒株，随后有关不同PCV2b 毒株之间以及PCV1 与PCV2a 之间毒株发生基因重组相继报道。同时进一步研究发现，重组毒有很高的体外繁殖能力，且抗原性发生改变，这些改变对致病性的影响有待进一步研究。21PCV2 基因型的漂移最早起源于欧洲，发生于2003 年或更早时间，北美洲和亚洲约发生于2005 年，大洋洲发生这种优势流行株转变约在2006 年，时间上均比欧洲PCV2 基因型的改变有轻微的推迟，潜在原因还未得到证实，可能与进口处于该病潜伏期的动物有关。基因型发生漂移的同时伴随着严重的圆环病毒病的爆发，虽然现有数据不能直接证明这些爆发是由PC
10、V2b 毒株导致，但是时间和地点上的巧合推测PCV2 主导型的变化与PCVAD 的发生存在很大关系，而基因型转变的原因与机制目前尚不清楚。相对于PCV2 遗传变异，PCV2 自然重组变异的报道比较少，其重组与病毒致病性和遗传进化的关系尚不明确。22我国PCV2 流行情况ang等从全国分离到49 株PCV2，其中2001 年分离到株均属于PCV2a 型，2002-2006 年分离到34 株PCV2 中PCV2b 有18 株，2007-2008 年间分离到12 株均为PCV2b 型。Li 对2001-2009 年间分离自我国东部的136 株PCV2 进行遗传进化分析发现，PCV2b 有127 株，
11、PCV2a 仅有9 株，其中8 株PCV2a 分离自2001-2005 年间，从2005年以后，几乎所有的分离株都是PCV2b 型，PCV2a 型越来越少，中国东部地区PCV2 流行毒株存在由PCV2a 向PCV2b 漂移的现象。23王佳慧利用PCR 方法对中国16 个省市75 个规模化猪场2010-2011 年间的688 份样品进行检测，被检猪场PCV2 阳性率为58.67%,共分离到53 株PCV2,与GenBank下载的192 株中国分离株进行遗传变异分析，结果发现，53 株PCV2 中PCV2b 基因型有50 株,且2001 年前我国优势PCV2 基因型为PCV2a 型,2002 年之
12、后流行的PCV2 基因型转变为PCV2b 型,但同期仍有PCV2a 型毒株存在。24赵英杰对2011-2012 年间采集自我国18 个省市932 份样品分析发现，2011-2012 年我国主要养猪地区规模化猪场PCV2 的感染率高达67.8%，并选取具有代表性的74 株PCV2 进行全基因组测序，其中56 株PCV2b 基因型。同一时期，Wei 等自我国南方14 个商业化猪场分离到66 株PCV2，其中92.42%的毒株属于PCV2b 基因型。流行病学调查显示，我国优势流行基因型为PCV2b。25目前，国外有很多关于PCV2 流行毒株的变异的报道，但是我国对此研究比较少。2011 年Cai 分
13、离到了5 株PCV2a 和PCV2b 基因型间重组毒，重组位点均位于ORF2 区段内。Guo 对2004-2008 年采集自我国10 个省份疑似PCV2 感染的病料中分离到19 株PCV2，有4 株病毒ORF2 编码基因发生突变，同时选取了2 株突变株进行致病性实验，发现突变株所造成的病理损伤、病毒血症、淋巴组织等免疫器官损伤明显严重，新出现的突变株如何增强毒力的分子机制还需进一步研究。26PCV2在我国猪群中已经广泛存在，主要有PCV2a 和PCV2b 两种基因型，自2005 以来主要以PCV2b 基因型流行为主，同时出现mPCV2b 毒株，未发现PCV2c 基因型。27国外上市疫苗有灭活疫
14、苗、Cap亚单位疫苗和PCV1-2 嵌合病毒灭活疫苗,均基于PCV2a 基因型，虽然PCV2a 疫苗能降低猪临床PCVAD,减少PCV2a 的流行,但是不会显著减少PCV2b 在猪群中的传播。日本研究者发现,PCV2 疫苗的免疫效果与PCV2 基因型有很大关系,流行毒株与疫苗株遗传关系越近，疫苗产生的免疫保护效力越好。为了进一步证实这一发现，Tanja Opriessniga 用PCV2a 型疫苗和PCV2b 型疫苗分别免疫猪群，PCV2进行攻毒，检测结果发现，PCV2b 型疫苗可以抵抗PCV2b、PCV2a/PCV2b 共感染提供更好的免疫保护。28国内上市疫苗属于PCV2b 型灭活疫苗，虽
15、然与流行毒株属于同一基因型，但是传统灭活疫苗抗原制备上病毒滴度低，生产周期长，且诱导的免疫应答主要为体液免疫，忽视了细胞免疫应答在PCV2 免疫保护中的作用。虽然商品化疫苗的应用为有效防控PCV2 感染发挥了重要作用，但是疫苗株与流行株分属不同基因型，且传统疫苗在免疫保护效力和生产制备上存在缺陷。随着基因工程技术的发展，基于PCV2b 型的活载体疫苗、核酸疫苗及标记疫苗等新型疫苗也展现出良好的研究前景。29PCV2灭活疫苗PCV2 灭活疫苗是将PCV2 感染的细胞培养物通过理化方法处理，使其丧失感染性但仍保持良好的免疫原性，然后加入佐剂乳化制备而成。该类疫苗具有使用安全，易于保存，性能稳定等优
16、点。303132333435国外学者较早投入PCV2 灭活疫苗的研究工作中，法国梅里亚公司于2006年成功研制出通过欧盟认证的首例PCV2 全病毒灭活疫苗Circovac。Opriessnig 等研究发现，用Circovac免疫妊娠母猪和仔猪均能降低仔猪PCV2 病毒血症和各组织器官中病毒载量，促进新生仔猪的生长，其原因可能是由于在给妊娠母猪注射疫苗后，诱导机体产生了抗PCV2 的特异性抗体，仔猪通过吮吸初乳获得了抵抗PCV2 感染的被动免疫力。36Kurmann用该疫苗免疫PCV2 亚临床感染的母猪，共分次免疫，首免和二免分别在妊娠前周和周进行，三免在妊娠期第12 周进行，结果发现免疫母猪的
17、血清抗体水平比未免疫母猪的血清抗体水平提高了倍，新生仔猪的血清抗体水平也随之增加，并能提高仔猪平均日增重率，缩短仔猪育肥期。由此可见，Circovac具备优良的免疫效果，能使免疫母猪和免疫仔猪获得稳定的群体免疫力，保护其免受PCV2 感染。37在国内，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘长明研究员成功地研制出中国首例PCV2 灭活疫苗(LG株)，该疫苗具有抗原含量高、免疫原性强、安全性好、抗母源抗体干扰及免疫效果好等特点，临床试验结果表明，疫苗接种猪群与空白对照组对比，主动免疫仔猪发病率下降15.1%，死淘率下降3.6%；被动免疫母猪结果显示，出生时死胎率下降2.3%，初生仔猪成活率提高7.6%，
18、断奶时成活率提高7.5%。该疫苗的使用对我国PCV2 流行有效地进行防控，给养猪业带来巨大的经济效益。此外，南京农业大学姜平教授研制的PCV2 灭活疫苗（SH株）也已注册上市，目前正在全国大部分地区推广使用，展现出广阔的应用前景。这种疫苗的成功研制和应用对防控我国PCV2 感染发挥了重大作用。383940414243444546PCV2弱毒疫苗弱毒疫苗又称为减毒活疫苗，是将病原体的致病力通过自然筛选或人工致弱等方式减弱制备而成。尽管该类疫苗的毒力已经致弱，但仍然保持着原有的免疫原性，并能在动物体内繁殖，刺激动物机体免疫系统，从而诱导产生坚实的免疫力和持久的保护力。47国内外对PCV2 弱毒疫苗
19、研究的报道较少，目前还没有商品化的PCV2 弱毒疫苗，主要原因与病毒毒力易返强、致弱毒株毒力评价困难等因素有关。Fenaux等将PCV2 分离株在PK15 细胞上连续传代培养，结果发现第120 代病毒(VP120)滴度约为第代病毒(VP1)滴度的10 倍，VP120 感染的仔猪出现病毒血症的发生率明显低于VP1 感染的仔猪，并且感染仔猪的血清中PCV2 DNA拷贝数更低，眼观和病理组织学变化也更轻，表明体外传代可促进PCV2 在细胞内的繁殖能力，并能减弱其致病力，这为研制PCV2 弱毒疫苗提供了科学依据。由于单一PCV2 感染对猪的致病性并不十分典型，病毒在体内持续存在，其毒力是否返强等关键问
20、题没有阐明，试验数据有限，这种方法得到的毒力减弱毒株作为疫苗离应用还有很长的路要走。48PCV2亚单位疫苗Cap 蛋白是PCV2 的主要结构蛋白和免疫保护性抗原，能刺激动物机体产生针对PCV2 的特异性免疫应答，是研制PCV2 基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2 亚单位疫苗生产的表达系统主要是昆虫细胞杆状病毒表达系统。国外已有3种PCV2 亚单位疫苗注册上市，分别是勃林格公司研制的Ingelvac CircoFLEX，英特威公司研制的Circumvent 以及先灵葆雅公司研制的Porcilis PCV，这3种疫苗均为杆状病毒表达的Cap 蛋白亚单位疫苗。49Opriessnig 等
21、比较了单剂量的Ingelvac CircoFLEX 和两剂量的Circumvent对周龄以上仔猪的免疫保护效力，结果发现在用PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪流感病毒(SIV)感染免疫仔猪后，无论以单剂量还是两剂量疫苗免疫，均能明显降低病毒血症的发生率，减轻PCV2、PRRSV 及SIV 混合感染对淋巴组织的损伤。50Fort等研究了单剂量Porcilis PCV 对不同地区、不同基因型PCV2 感染的免疫保护效果，结果发现该疫苗对来自不同地区、不同基因型的PCV2 感染具有良好的免疫保护力，既能诱导免疫仔猪产生针对PCV2 的特异性体液免疫应答，又能诱导产生细胞免疫应答，能显
22、著减轻病毒血症，减少鼻腔和排泄物中PCV2 的排出量，降低各组织器官中PCV2 的病毒载量。515253 青岛易邦生物工程有限公司常务副总经理范根成博士介绍了易邦“易圆净”拥有的几个突出特点：1）率先建立猪圆环疫苗评价体系，引领行业标准；2）表达病毒样颗粒抗原（VLPS/CAP），抗原性好，能高效诱导机体产生良好体液免疫与细胞免疫，免疫后15-20天100%转阳，持续时间可达5个月；3）水性佐剂+免疫增强剂，注射方便，无副反应；4）100多万头猪临场使用表明“易圆净”安全、高效、无副作用，免疫猪各项生产性能良好。只需一针，保护至出栏；5）2-4周龄猪免疫，每头2ml；管理良好猪场每头1-1.5
23、ml；在未免疫或免疫失败猪群，在发病早期可以紧急接种，每头2ml。5455重组重组PCV2活载体疫苗活载体疫苗PCV2病毒活载体疫苗腺病毒活载体疫苗伪狂犬病毒活载体疫苗假型杆状载体疫苗猪繁殖与呼吸综合症病毒载体疫苗噬菌体载体疫苗PCV2细菌活载体疫苗乳酸菌口服活载体疫苗博德特氏菌载体疫苗56腺病毒活载体疫苗腺病毒作为基因转移载体具有诸多优势：宿主范围广，插入外源基因能力强，能在许多哺乳动物细胞和组织中表达重组蛋白，表达外源基因效率高，能对表达的外源蛋白进行精细的修饰。基于以上优势，腺病毒载体现已广泛应用于基因工程疫苗研发，基因治疗以及肿瘤治疗等领域。57Wang 等成功构建了表达PCV2 OR
24、F2 基因的重组腺病毒rAD-Cap，然后通过动物免疫保护试验评价rAD-Cap 对仔猪的免疫保护效果，结果发现，在首免后即能检测到抗PCV2 的高水平ELISA 抗体和病毒中和抗体，免疫仔猪的相对日增体质量率显著高于攻毒对照组，而组织损伤程度和病毒血症的发生率却明显低于攻毒对照组。58Liu等成功构建了融合表达PCV2 ORF2 基因与猪IFN-基因的重组腺病毒PCV2 ORF2-IFN-，并证实PCV2 ORF2-IFN-在小鼠体内诱导产生PCV2 特异性抗体的能力比单独表达Cap蛋白的PCV2 ORF2 强，表明猪IFN-作为细胞因子佐剂可以显著增强Cap蛋白的免疫原性。59由此可见，表
25、达Cap 蛋白的重组腺病毒能诱导动物机体产生针对PCV2的特异性免疫应答，保护动物抵抗PCV2 感染，是一种具有潜在应用价值的PCV2 候选疫苗。然而，腺病毒作为表达载体也存在些许不足，如腺病毒载体由于不能整合到靶细胞的基因组DNA 中，因此不能形成外源基因的稳定表达；腺病毒的靶向性差；腺病毒颗粒可被肝脏的Kupffer 细胞非特异性吸收，表现出很强的首过效应等。因此，只有对腺病毒载体不断进行改进和完善，才能充分发挥其潜在的应用价值。60伪狂犬病毒活载体疫苗伪狂犬病毒基因组是线状双链DNA 分子，大小约150，含有许多病毒非必需基因，可以插入和表达多种病原体的免疫保护性抗原基因。伪狂犬病毒较稳
26、定，免疫原性持久；缺失毒力基因的伪狂犬病毒安全性好，能诱导动物机体产生持续的体液免疫与细胞免疫应答，因此，该病毒已逐渐发展成为哺乳动物细胞系统的高效表达载体之一，广泛应用于基因工程药物和基因工程疫苗的开发与研制等领域。61Ju 等成功构建了表达PCV2 ORF1-ORF2 融合蛋白的重组伪狂犬病毒PRV-PCV2，Western blot 试验证实ORF1-ORF2 融合蛋白在重组病毒中正确表达，用PRV-PCV2 免疫小鼠后，能在小鼠体内诱导产生抗PRV-PCV2 的特异性抗体，保护小鼠抵抗PRV Ea 强毒株攻击；而且，仔猪免疫试验也证实PRV-PCV2 能诱导仔猪产生针对PRV和PCV2
27、 的特异性免疫应答。62Song 等将PCV2 ORF2 基因插入IECMV 质粒中，并同伪狂犬病毒Tk-/gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，通过同源重组成功构建了Tk-/gE-/ORF2重组病毒，Western blot和间接免疫荧光试验证实PCV2 ORF2基因在重组病毒中正确表达。周龄仔猪接种Tk-/gE-/ORF2后，PRV-ELISA、PRV中和试验、ORF2-ELISA和ORF2特异性淋巴细胞增殖试验证实重组病毒具有良好的免疫原性，能产生针对PRV和PCV2 的特异性免疫应答。由此可见，重组伪狂犬病病毒能诱导动物机体产生针对PRV和PCV2 的特异性免疫应答，保护动物
28、抵抗PRV和PCV2 感染，与重组腺病毒对比，该重组伪狂犬病毒能在猪体内很好地繁殖，因此，在PRV-PCV2 二联活载体疫苗研制方面具有巨大的潜力和应用价值。63假型杆状病毒载体疫苗an等将水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac多角体蛋白基因启动子下游，并在VSV-G 表达元件下游引入巨细胞病毒早期（CMV-1E）启动子和BGH poly(A),成功构建了一种类似杆状病毒的假型杆状病毒BV-G-CMV，但其能感染哺乳动物细胞，并能在病毒粒子囊膜展示VSV-G。64随后，Fan等将PCV2 ORF2 基因定向插入BV-G-CMV CMV-1E启动子下游，转
29、染Sf9昆虫细胞后获得了重组假型杆状病毒BV-G-ORF2，Western blot与流式细胞术检测结果显示BV-G-ORF2 能在PK15细胞中高效表达Cap蛋白。65以1108 或1109 PFU 剂量的BV-G-ORF2 免疫小鼠，结果发现能诱导小鼠产生抗PCV2 特异性ELISA 抗体、中和抗体及细胞免疫应答，而且即使以1108 PFU 剂量免疫，BV-G-ORF2也展现出比PCV2 DNA 疫苗更强的免疫原性。BV-G-CMV作为基因转移载体具有操作简单、病毒易培养、无毒性、免疫原性强及宿主体内不存在抗杆状病毒的抗体等优点，因此，假型杆状病毒可用于新型PCV2 活载体疫苗的研究。66
30、猪繁殖与呼吸综合征病毒载体疫苗Pei 等在PRRSV cDNA克隆的ORFs 1b与2a 之间插入个限制性酶切位点和个转录调控序列TRS6，将其改造成一个通用的病毒载体，然后将PCV2 ORF2 基因插入个限制性酶切位点之间，由TRS6启动转录，构建了表达Cap 蛋白的重组质粒，用重组质粒转染Marc-145 细胞成功获得了P129-PCV 重组PRRSV。67动物免疫试验证实：免疫周后，在P129-PCV 免疫的猪体内能诱导产生抗PCV2 特异性抗体应答，表明重组PRRSV 能在体内和体外成功表达Cap 蛋白，并诱发特异性免疫应答，可作为一种表达载体用于PCV2 及其他猪病活载体疫苗的研究。
31、然而，该重组PRRSV 体外传代是否稳定、目的基因经传代是否会丢失等问题有待进一步的试验数据加以证实。68噬菌体载体疫苗研究表明，噬菌体表面展示技术现已应用于疫苗的开发与研究。将病原体的保护性抗原与噬菌体的外壳蛋白以融合蛋白形式展示于噬菌体的表面，以此来构建表达外源抗原的重组噬菌体颗粒，即噬菌体载体疫苗。噬菌体载体疫苗因安全，稳定，不需要佐剂及易于规模化生产等特点而日益受到研究人员的重视。69Gamage 等将PCV2 Cap 蛋白的优势表位区克隆至噬菌体展示颗粒(LDP)头部蛋白(D)基因下游形成融合基因，成功构建了表达融合蛋白D-CAP 的重组噬菌体展示载体LDP-D-CAP，ELISA和
32、Western blot 检测结果显示D-CAP 在LDP 的表面正确表达，用LDP-D-CAP 免疫仔猪后，没有出现任何不良反应，首免后即可诱导产生抗PCV2 的特异性免疫反应，不仅能诱导产生PCV2 中和抗体，而且能诱导产生细胞免疫应答，表明PCV2 噬菌体载体疫苗有望作为一种新型的活载体疫苗用于防控PCV2 感染。70乳酸菌口服活载体疫苗乳酸菌在食品工业中具有广泛的应用，是一类安全的口服细菌，可以作为活疫苗载体表达外源抗原，因而日益受到研究者的重视。Wang 等将缺失核定位信号区的PCV2 ORF2 基因克隆入大肠杆菌乳酸链球菌穿梭载体pSEC:LEISS，构建了重组穿梭载体pSEC:L
33、EISS-dCap,电转化乳酸菌后获得了重组乳酸菌NZ9000/pSEC:LEISS-dCap,Western blot试验证实Cap 蛋白在乳酸链球菌中正确表达，在给小鼠口服重组乳酸链球菌培养物后可检测到高水平的PCV2 特异性抗体，表明乳酸链球菌作为抗原转移载体可用于PCV2 口服活疫苗的研发，具有开发潜力和应用前景。71博德特氏菌载体疫苗研究证实，支气管炎博德特氏菌具有很强的感染性，这使得其很容易定植于呼吸道黏膜，因此，应用致弱的支气管炎博德特氏菌作为活载体将异种抗原递呈至哺乳动物乃至人的呼吸道是可以实现的。Kim 等将PCV2 ORF2 基因定向克隆入aroA 突变的支气管炎博德特氏菌
34、，电转化后获得了表达Cap 蛋白的重组博德特氏菌(BBS-MCP)，然后用活BBS-MCP 免疫小鼠和猪，ELISA 检测结果显示在血清中存在高水平的抗Cap 蛋白特异性IgG 抗体，用PCV2 感染后，在活BBS-MCP 免疫的猪淋巴结中检测不到PCV2 DNA，结果表明BBS-MCP 免疫能有效保护猪群抵抗PCV2 感染，这一发现为PCV2 减毒活疫苗的研发提供了新的思路。72此外，酵母表达系统作为一种真核表达系统，因其操作简单、细胞生长快速、能大规模发酵生产，而且能对重组蛋白进行相对正确的折叠和翻译后加工修饰等优点，现已广泛应用于外源蛋白的商品化疫苗研发。Bucarey 等将PCV2 C
35、ap 蛋白基因密码子优化后克隆入大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体(pYES2)，然后转化宿主菌INVSc1，Western blot 试验证实Cap 蛋白在酵母细胞中正确表达，电镜下观察到Cap 蛋白表达后可以自我组装形成类似PCV2 的病毒样颗粒，给小鼠口服含Cap 蛋白的酵母提取物后，在血清中可检测到抗Cap 蛋白的特异性抗体，表明酿酒酵母作为一种非常有吸引力的表达载体可用于PCV2 口服活疫苗的研制。73PCV2核酸疫苗核酸疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，因免疫效果好，免疫应答持久，制备简便，稳定性强，安全性好，成本低廉，适于规模化生产等优点，现已成为疫苗学领域研究的热点。研究证实，含PCV2
36、ORF2 基因的质粒载体（ORF2）能在小鼠体内诱导PCV2 特异性抗体阳转，能诱导仔猪产生抗PCV2 感染的保护性免疫应答，而且ORF2免疫的小鼠诱导产生PCV2 中和抗体的能力比单独用Cap 蛋白免疫的小鼠强，攻毒后免疫组小鼠临床症状和病理变化明显减轻，PCV2 病毒载量也显著下降。74Fenaux 等用PCV1-2 嵌合病毒DNA 疫苗免疫仔猪，免疫后42d，检测到大部分仔猪PCV2 抗体阳转，攻毒后21d，对照组仔猪出现病毒血症，淋巴结肿大，淋巴组织衰竭等症状，而免疫组仔猪未出现病毒血症，淋巴组织损伤程度较轻，淋巴组织的病毒载量显著降低，表明PCV1-2 嵌合病毒DNA 疫苗可以有效预
37、防PCV2 感染。75 等分别构建了含PCV2 ORF-1、ORF-2、ORF-3 的重组质粒p3224-ORF-1、-2和-3，3种重组质粒单独或联合免疫小鼠周后，用相应的MVA-ORF-1、-2和-3以单独或联合形式加强免疫，结果发现ORF-2/-3 与ORF-1/-2/-3这种组合免疫诱导产生的IFN-、TNF-、GM-CSF 以及PCV2 抗体水平均较其它免疫组高，攻毒后这种组合免疫组PCV2 病毒载量显著减少，小鼠的肺部病变也明显减轻。尽管核酸疫苗具有诸多优点，但外源基因在体内的表达调控及其在体细胞中的转移可能会产生意外的免疫病理反应等瓶颈问题使得目前绝大部分核酸疫苗的研究还仅局限于
38、实验室。76PCV1-2嵌合疫苗嵌合疫苗是应用基因工程手段来构建的一类新型疫苗，美国富道公司已经研发出商品化的PCV1-2 嵌合疫苗Suvaxyn PCV2 One DoseTM，其原理是用PCV2 ORF2 基因置换无致病性的PCV1 ORF2 基因，构建PCV1-2 嵌合病毒，然后将其灭活制备而成，该类疫苗现已在美国、加拿大、墨西哥、丹麦、菲律宾及新西兰等国申请注册。2011 年，美国辉瑞公司与富道公司合并后，将Suvaxyn PCV2 One DoseTM更名为FosteraTM PCV。77等对Suvaxyn-PCV2 的免疫保护效力进行了研究，结果发现免疫猪群的临床症状大大减轻，淋巴
39、组织和血液中PCV2的病毒载量、保育猪和育肥猪的死亡率以及PMWS 的发生率均显著降低，表明Suvaxyn-PCV2 能有效诱导动物机体产生PCV2 中和抗体，保护猪群抵抗PCV2 感染，并降低PMWS 的发生率，这与其他学者的研究结果一致。78众所周知，如果仔猪体内存在母源抗体，将会干扰疫苗的免疫效能，为验证母源抗体的存在对Suvaxyn PCV2 One DoseTM 免疫效能的影响，等选择有母源抗体存在的仔猪作为实验动物，在Suvaxyn PCV2 One DoseTM 免疫后28d 进行PCV2 感染试验，结果发现，与对照组对比，免疫组仔猪血清中PCV2 病毒载量显著降低，淋巴组织损伤
40、程度也明显减轻，表明即使存在母源抗体，Suvaxyn PCV2 One DoseTM 仍能显著提高仔猪对PCV2 感染的免疫力。7980PCV2标记疫苗PCV2 标记疫苗是指应用DNA 重组技术将分子标记插入PCV2 基因组中而研制的一类新型的重组疫苗，该类疫苗毒株可与野毒株相区别。81Beach 等将GLU 或KT3 标签定向克隆至PCV1-2 嵌合病毒Cap 蛋白的末端，成功构建了种带分子标记的PCV1-2 嵌合病毒，并证实其能在PK15 细胞上增殖，试验感染猪后能在血清中检测到PCV2 中和抗体和抗GLU 或KT3 标签的特异性抗体。Huang 等将V5 标签插入PCV2 Cap蛋白的末
41、端，成功构建了表达V5 标签的PCV2 重组病毒，并证实重组病毒和亲本毒株具有相似的生物学特征，用重组病毒免疫小鼠后能诱导产生PCV2 中和抗体和抗V5 标签的特异性抗体。82这些研究结果表明：带GLU 或KT3 标签的PCV1-2 嵌合病毒或带V5 标签的PCV2 重组病毒有望作为研制PCV2 标记疫苗的候选疫苗株，为临床区分PCV2 自然感染和疫苗免疫奠定了坚实的基础。83存在问题及展望猪圆环病毒疫苗市场充满机遇和挑战。根据2012 年中国农村统计年鉴显示，2011 年末，我国生猪出栏量约6.6 亿头，存栏量4.6 亿头。作为我国强制性免疫的猪瘟和猪蓝耳病，其每种疫苗的需求量都在15-20
42、 亿头份/年。以我国生猪存栏量,猪瘟疫苗和猪蓝耳疫苗的需求量为参照，猪圆环病毒疫苗市场需求远未饱和，优质的猪圆环病毒疫苗将能为企业带来新的经济增长点和竞争力，各生产厂家具有很大的市场空间。同时随着国际兽用生物制品企业进军中国建厂和寻求合作，兽用生物制品行业将面临更加激烈的竞争，也要求国内企业迎接竞争，尽快改进生产工艺，加快研发，提高圆环疫苗的质量。84诸多PCV2 疫苗效能试验已证实目前商品化的PCV2 疫苗在一定程度上可以有效防控PCV2 感染，能显著降低PCV2 感染猪群的临床症状，提高猪的生长性能，然而疫苗免疫并不能完全阻断PCV2 传播，亦不能完全清除体内已感染的病毒。此外，就目前商品
43、化的PCV2 疫苗而言，无论是国外进口的还是国产疫苗，市场价格普遍较高，这在一定程度上给养殖户造成了经济压力，因此，研制高效、低廉的新型疫苗是今后的必然趋势。85总之，PCV2 疫苗研究总体呈现出良好的发展态势，在国内外研究人员的不懈努力下，相继研制出PCV2 全病毒灭活疫苗、pcv1-2 嵌合病毒疫苗及基于Cap 蛋白的PCV2 亚单位疫苗。随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，活载体疫苗、核酸疫苗及标记疫苗等PCV2 新型基因工程疫苗正在研究中，展现出良好的应用前景。针对当前PCV2 商品化疫苗生产成本较高、病毒难培养的现实，开发高效、低廉的PCV2 新型活载体疫苗、核酸疫苗等基因工程疫
44、苗是今后研究的趋势。86目前国内外已商品化的圆环疫苗均是单苗，联合圆环疫苗开发将是未来研发方向之一，采用新技术、新材料将与一种或多种病原微生物组合在一起，免疫一针同时预防两种或多种疾病，既能降低动物应激，提高动物福利，又能减少员工免疫的工作量和降低免疫相关成本；目前国内外商品化的猪圆环病毒疫苗均为灭活疫苗，免疫有效期限短，如果有免疫效果好、安全性有保障的减毒活疫苗研发成功推向市场，将会是猪圆环病毒的有力克星。87 佐剂的应用也是疫苗开发的关键环节，无论是单苗还是联苗的佐剂的应用也是疫苗开发的关键环节，无论是单苗还是联苗的开发，佐剂对抗原协同作用的研究也越来越被重视。开发，佐剂对抗原协同作用的研究也越来越被重视。8889
