1、一、生命大分子的概念一、生命大分子的概念生命大分子是指生物机体（动物、植生命大分子是指生物机体（动物、植物和微生物）经过新陈代谢产生的物和微生物）经过新陈代谢产生的蛋白蛋白质质（多肽、酶类）（多肽、酶类）核酸、糖类核酸、糖类以及它们以及它们的复合物。的复合物。概概 述述各种方法的基本原理基本上可归纳为两个方面：各种方法的基本原理基本上可归纳为两个方面：1 1、根据混合物中几个、根据混合物中几个组分分配系数的差别组分分配系数的差别将它们分将它们分配于两个或几个物相中（如有机溶剂抽提、盐析、配于两个或几个物相中（如有机溶剂抽提、盐析、层析、结晶等）。层析、结晶等）。2 2、将混合物置于某一物相中（
2、固相或液相）、将混合物置于某一物相中（固相或液相）外加一外加一定的作用力，使各种成份分配于不同区域，定的作用力，使各种成份分配于不同区域，达到达到分离目的（如电泳、离心、超滤等）。分离目的（如电泳、离心、超滤等）。1 1、生物材料存在的状态多样性：结合态、混合物、生物材料存在的状态多样性：结合态、混合物、游离形式、分泌型。游离形式、分泌型。2 2、生物材料组成非常复杂，不断代谢变化。、生物材料组成非常复杂，不断代谢变化。3 3、有效成份在材料中含量极微。、有效成份在材料中含量极微。4 4、生物材料离体后丧失生理活性。、生物材料离体后丧失生理活性。5 5、分离制备的溶液各种参数难以控制。、分离制
3、备的溶液各种参数难以控制。6 6、一般采用温和的、多阶式程序。、一般采用温和的、多阶式程序。7 7、材料来源、含量、存在状态、稳定性的差异，制、材料来源、含量、存在状态、稳定性的差异，制备方法的通用性差。备方法的通用性差。四、生物大分子分离提纯的基本程序四、生物大分子分离提纯的基本程序1 1、前处理：将欲分离的生物大分子组分从原来的、前处理：将欲分离的生物大分子组分从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。组织或细胞中以溶解的状态释放出来。2 2、粗分级：选用一套适当的方法，将所要的成分、粗分级：选用一套适当的方法，将所要的成分与其他的杂质成分分离开来。与其他的杂质成分分离开来。3 3、细分级
4、：将粗分级后的样品进一步地提纯。、细分级：将粗分级后的样品进一步地提纯。4 4、结晶：样品（如蛋白质）分离纯化的最后步骤、结晶：样品（如蛋白质）分离纯化的最后步骤及最终结果。及最终结果。生物大分子分离纯化的一般步骤生物大分子分离纯化的一般步骤层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 超滤超滤盐析盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等电点沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀透析透析前处理前处理粗分级粗分级细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、细胞破碎（机械破碎、溶涨和自溶、酶解、化溶涨和自溶、酶解、化学处理）学处理）生物组织生物组织无细胞提取液无细胞提取液粗产品粗产品结晶结
5、晶l材料的选择与处理材料的选择与处理l确定测定方法确定测定方法l有效成份的抽提有效成份的抽提l粗制品的纯化粗制品的纯化l纯化产品的分析与鉴定（定性与定量）纯化产品的分析与鉴定（定性与定量）一、有效成份一、有效成份：指欲纯化的某种单一的生命：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。大分子物质。二、选材的原则二、选材的原则：遵循有效成份含量多、稳：遵循有效成份含量多、稳定性好；来源丰富；提取工艺简单；有综合定性好；来源丰富；提取工艺简单；有综合利用价值等原则。利用价值等原则。三、材料的处理三、材料的处理：目的是去除影响有效成份：目的是去除影响有效成份的杂质，要求保持材料的活力，保持提取率的杂质，要求保
6、持材料的活力，保持提取率高。高。三、常用的测定方法三、常用的测定方法（一）光谱法（一）光谱法 （二）电化学法（二）电化学法（三）生物活性检测法（三）生物活性检测法（四）免疫分析法（四）免疫分析法（四）免疫分析法（四）免疫分析法（五）生物传感器（五）生物传感器 DNA DNA和和RNARNA样品的纯度可根据样品的纯度可根据不同吸收值的比例进行判断不同吸收值的比例进行判断,蛋白质的吸收峰蛋白质的吸收峰A A280280，纯净纯净DNADNA的在中性及稍碱性的的在中性及稍碱性的PHPH时时A260/A280A260/A2801.81.8，纯，纯RNARNA的比的比例例2.02.0各种核酸的浓度吸收曲
7、线各种核酸的浓度吸收曲线定义：定义：在不破坏有效成份的条件下，采在不破坏有效成份的条件下，采用适当的生物学、化学、物理学的方法，用适当的生物学、化学、物理学的方法，对动物、植物、微生物的组织或细胞结对动物、植物、微生物的组织或细胞结构进行破碎加工，除去任何不想要的组构进行破碎加工，除去任何不想要的组织与成份，以便提取生物活性成份的过织与成份，以便提取生物活性成份的过程。程。提取是利用适当的方法，适当的溶剂，使有效提取是利用适当的方法，适当的溶剂，使有效成份充分释放到溶剂中，即由固相转入液相或从成份充分释放到溶剂中，即由固相转入液相或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。细胞内的生理状况转入外
8、界特定的溶液中。一、定义一、定义1 1、极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于、极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；非极性溶剂；2 2、碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱、碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；性溶剂；3 3、温度升高，溶解度加大；、温度升高，溶解度加大；4 4、远离等电点的、远离等电点的pHpH值，溶解度增加。值，溶解度增加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。的增加和保持其生物活性。1 1、缓冲液（、缓冲液（buffer)buffer)的的pHpH：提取蛋白质时应远离其：提
9、取蛋白质时应远离其 pIpI 的的 pH pH 条件下进行，以不危及蛋白质的化学属性条件下进行，以不危及蛋白质的化学属性,并并使其有良好的溶解性。故酸性蛋白选择高的使其有良好的溶解性。故酸性蛋白选择高的pHpH，碱，碱性蛋白质选择低的性蛋白质选择低的pHpH。2 2、离子强度：适宜用等渗溶液、离子强度：适宜用等渗溶液3 3、金属离子螯和物：加入、金属离子螯和物：加入EDTAEDTA、EGTAEGTA防止沉淀产生防止沉淀产生4 4、水解酶：加入蛋白酶抑制剂、水解酶：加入蛋白酶抑制剂5 5、氧化：加入还原剂、氧化：加入还原剂HS-OHHS-OH、DTT DTT 6 6、温度：大多数适合低温操作，利
10、于保存、稳定生物、温度：大多数适合低温操作，利于保存、稳定生物活性活性n水溶液提取：能溶解于水、稀酸、稀盐、稀碱缓冲水溶液提取：能溶解于水、稀酸、稀盐、稀碱缓冲液的蛋白质液的蛋白质n有机溶剂提取：利用有机溶剂的亲水性和亲脂性提有机溶剂提取：利用有机溶剂的亲水性和亲脂性提取脂蛋白取脂蛋白(与脂质结合的、含非极性侧链较多的蛋白与脂质结合的、含非极性侧链较多的蛋白质和酶质和酶,不溶于水不溶于水)蛋白质的提取蛋白质的提取核酸的提取核酸的提取性质特征性质特征:n核酸溶解于水核酸溶解于水,不溶解于有机溶剂。不溶解于有机溶剂。n核酸在细胞内与蛋白质形成核酸在细胞内与蛋白质形成DNP,RNPDNP,RNP复合
11、物。复合物。nDNPDNP在在1mol1molL L的的 NaClNaCl中溶解度大中溶解度大,在在 0.14mol0.14molL L的的 NaClNaCl中溶解度小中溶解度小;RNP;RNP在在0.14mol0.14molL L的的 NaClNaCl中中溶解度大。根据上述特征将二者分开。溶解度大。根据上述特征将二者分开。核酸与结合蛋白质的分离核酸与结合蛋白质的分离n阴离子表面去垢剂阴离子表面去垢剂:SDS:SDS、脱氧胆酸钠等具有溶解、脱氧胆酸钠等具有溶解病毒蛋白质外壳病毒蛋白质外壳,细菌表壁蛋白质的作用细菌表壁蛋白质的作用,使核酸使核酸释放游离于溶液中释放游离于溶液中;n蛋白质变性剂蛋白
12、质变性剂:酚酚-氯仿抽提氯仿抽提,破坏蛋白质的结构破坏蛋白质的结构,使核酸得到分离使核酸得到分离.例例:DNA:DNA的分离的分离;RNA;RNA的分离的分离四、选用方法的考虑因素四、选用方法的考虑因素1.1.利用样品组分之间的溶解度差别进行分离：硫酸铵利用样品组分之间的溶解度差别进行分离：硫酸铵或乙醇分级沉淀方法或乙醇分级沉淀方法2.2.利用蛋白质的分子大小差别进行分离：利用蛋白质的分子大小差别进行分离：SDS-PAGESDS-PAGE、凝胶过滤等方法凝胶过滤等方法3.3.根据不同电荷性质进行分离：离子交换、等电点聚根据不同电荷性质进行分离：离子交换、等电点聚焦层析、毛细管电泳等方法焦层析、
13、毛细管电泳等方法4.4.已制备有该产物的抗体进行分离：亲和层析、免疫已制备有该产物的抗体进行分离：亲和层析、免疫沉淀等方法沉淀等方法5.5.产物的浓缩产物的浓缩：离子交换、亲和层析、透析、超滤、：离子交换、亲和层析、透析、超滤、冷冻干燥等方法冷冻干燥等方法6.6.产物纯度的鉴定：上述方法产物纯度的鉴定：上述方法2 2，3 3可用于对样品纯可用于对样品纯度的鉴定，还有末端分析、质谱分析、反相层析、度的鉴定，还有末端分析、质谱分析、反相层析、活力反应等活力反应等定义：定义：当有效成份浓度太低，体积较大时，用适当当有效成份浓度太低，体积较大时，用适当的方法，使其浓度加大，体积缩小的过程。的方法，使其
14、浓度加大，体积缩小的过程。方法：方法：n中性盐沉淀法中性盐沉淀法n超过滤法超过滤法n吸附法吸附法n减压蒸馏法减压蒸馏法n透析法透析法 n冷冻干燥法冷冻干燥法 八、样品的保存八、样品的保存 保存方法与生物大分子稳定性及保持生物活性保存方法与生物大分子稳定性及保持生物活性的关系很大，生物大分子的保存可分为干粉和液态的关系很大，生物大分子的保存可分为干粉和液态两种。但不论是干粉或液态都应避免长期暴露于空两种。但不论是干粉或液态都应避免长期暴露于空气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定性和生物活性影响很大，故一般生物大分子物质都性和生物活性影响很大，故
15、一般生物大分子物质都在低温在低温(O(O一一4)4)保存，保存时间也不宜过长，否则，保存，保存时间也不宜过长，否则，会招致样品的变质或失活。会招致样品的变质或失活。1 1干粉保存干粉保存 干燥的制品一般比较稳定，如制干燥的制品一般比较稳定，如制品含水量很低，在低温情况下，生物大分子活性可品含水量很低，在低温情况下，生物大分子活性可在数个月甚至数年没有显著变化。在数个月甚至数年没有显著变化。n 储藏方法很简单，只将干燥后的样品置于干燥器储藏方法很简单，只将干燥后的样品置于干燥器内内(内装有干燥剂内装有干燥剂)密封，在密封，在O O一一44冰箱中保存即可。冰箱中保存即可。n 有时为了取样方便和避免
16、取样时样品吸水和污染，有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染，可先将样品分装成许多小瓶，每次用时，只取出一可先将样品分装成许多小瓶，每次用时，只取出一小瓶。小瓶。2.2.液态保存液态保存 对保持生物大分子活性是不利的，对保持生物大分子活性是不利的，故只在一些特殊情况下采用，并需要严格的防腐保故只在一些特殊情况下采用，并需要严格的防腐保护措施，保存时间也不宜过长。护措施，保存时间也不宜过长。n常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白质和常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵、蔗糖、甘油等，某些金酶常用的稳定剂有硫酸铵、蔗糖、甘油等，某些金属离子如钙、镁、锌等对某些
17、酶也有一定的保护作属离子如钙、镁、锌等对某些酶也有一定的保护作用。液态核酸可保存在缓冲液中。大多数生物活性用。液态核酸可保存在缓冲液中。大多数生物活性物质液态保存时，在物质液态保存时，在0 044冰箱即可。冰箱即可。nDNADNA，RNARNA，蛋白质和酶等不宜在，蛋白质和酶等不宜在OO以下保存，因为以下保存，因为溶液结冰会造成大分子构象破坏，使其失活。溶液结冰会造成大分子构象破坏，使其失活。n生物大分子和各种生化制品的保存，总的来说，温生物大分子和各种生化制品的保存，总的来说，温度和水分是影响稳定性的两个重要因素，其次是各度和水分是影响稳定性的两个重要因素，其次是各种稳定剂的应用是否适当，关
18、系也很大。实际应用种稳定剂的应用是否适当，关系也很大。实际应用时，必须对各种影响因素都加以考虑。时，必须对各种影响因素都加以考虑。纯化方案是由几种纯化方法组成的，故在设计纯化方案是由几种纯化方法组成的，故在设计纯化方案时，首先应确定纯化方法。即根据有效成纯化方案时，首先应确定纯化方法。即根据有效成份和杂质之间理化性质的差异考虑设计分级分离纯份和杂质之间理化性质的差异考虑设计分级分离纯化的各种方法化的各种方法,依各方面的性质，难易程度，效率依各方面的性质，难易程度，效率的高低，分离体积的大小等诸因素的考虑，把各方的高低，分离体积的大小等诸因素的考虑，把各方法排列成序，组成纯化有效成份的一套完整方案。法排列成序，组成纯化有效成份的一套完整方案。例：大肠杆菌碱性磷酸酶的制备纯化步骤例：大肠杆菌碱性磷酸酶的制备纯化步骤每步有效成份的总活力每步有效成份的总活力提取液中有效成份的总活力提取液中有效成份的总活力 每步每步有效成份的比活力有效成份的比活力提取液中有效成份的比活力提取液中有效成份的比活力 总活力单位数（总活力单位数（u）总蛋白量（总蛋白量（mg)l 增大纯化倍数增大纯化倍数l 提高收得率提高收得率l 保持样品的活性保持样品的活性
