1、第四节第四节 目的基因制备和常用分离方法目的基因制备和常用分离方法 一、已知基因的获得：一、已知基因的获得：（一）人工合成（一）人工合成n根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸序列，再用核苷酸序列，再用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成目的基目的基因。因。n适用于合成适用于合成分子量较小分子量较小的目的基因（的目的基因（100bp100bp以内）。以内）。（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（PCR）P333图8-16n1 1、定义：、定义：又称基因又称基因体外扩增
2、体外扩增；是在引物的介导；是在引物的介导下，通过下，通过变性、退火、延伸变性、退火、延伸三步循环反三步循环反应，体外快速的应，体外快速的DNADNA特异性扩增技术。特异性扩增技术。PCR技术的发明者技术的发明者DNA Replication:5 5 3 3dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol35 5 DNA Replication:32 2、PCRPCR反应原理反应原理n模拟体内模拟体内DNADNA复制过程复制过程，通过变性、退火、延伸三步反，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成，靶基因的双链应的循环完成，靶基因的双链DNADNA变性为单链变性为单链
3、，特异的，特异的引物在退火过程中与单链引物在退火过程中与单链DNADNA模板聚合模板聚合，在靶，在靶DNADNA的指的指导下导下引物的引物的33末端延伸末端延伸靶靶DNADNA的互补链，完成一个循的互补链，完成一个循环。理论上，每一循环使环。理论上，每一循环使DNADNA分子扩增一倍，分子扩增一倍，n n次循环次循环后，后，DNADNA分子扩增为分子扩增为2 2n n；n高温变性高温变性：9494，目的基因接连为单链，以作为扩增，目的基因接连为单链，以作为扩增的模板；的模板；低温复性低温复性：55556060，一对特异性引物分别与模板，一对特异性引物分别与模板33端互补结合；端互补结合；适温延
4、伸适温延伸：7272，延伸反应；，延伸反应；5 5 Template DNA5 Primer 15 Primer 2 5 5 5 5 The 1st cycleThe 2nd cycle 5 5 5 5 5 5 5 5 平台期平台期指数扩增期指数扩增期到达平台期所需到达平台期所需PCRPCR循环次数取决于循环次数取决于模板模板拷贝数拷贝数、PCRPCR扩增效扩增效率率及及DNADNA聚合酶的种聚合酶的种类及活性类及活性.3 3、PCRPCR产物特异性产物特异性n模板模板序列：应使用序列：应使用纯度和浓度较高纯度和浓度较高的的DNADNA模板；模板；n引物：引物：优化引物优化引物的设计的设计n使
5、用使用较高的退火温度较高的退火温度，较少的循环较少的循环次数次数；n使用使用较低浓度的引物、酶和镁离子较低浓度的引物、酶和镁离子；4 4、PCRPCR反应体系反应体系n模板模板：DNADNA或或RNA(RNA(逆转录合成逆转录合成cDNA)cDNA)nDNADNA聚合酶聚合酶：TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶n缓冲液系统缓冲液系统：Tris-HCl,KCl,MgTris-HCl,KCl,Mg2 2n底物底物：相同浓度的：相同浓度的dNTPdNTPn引物引物5 5、PCRPCR的主要用途的主要用途n目的基因的克隆目的基因的克隆n基因的体外突变基因的体外突变nDNADNA和和RNARNA的微量
6、分析的微量分析nDNADNA序列测定序列测定n基因突变分析基因突变分析PCR仪器设备：仪器设备：n自动移液器和枪头自动移液器和枪头n微量离心管微量离心管nPCR仪仪n电泳设备电泳设备nSimple and rapid operationn Wide applicability二、未知基因获得二、未知基因获得(一一)基因组基因组DNADNA文库：文库：P336P336图图8 81717 采用限制酶将采用限制酶将基因组基因组DNADNA切成片段，每一切成片段，每一个个DNADNA片段都与一个载体分子拼接成重组片段都与一个载体分子拼接成重组DNADNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩然后将
7、所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为增，得到的分子克隆的混合体称为“基因文基因文库库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。基因片段。n基因文库（基因文库（gene librarygene library）(G-(G-文库文库)：是含有某种生物是含有某种生物全部基因随机片段全部基因随机片段的重的重组组DNADNA克隆群。克隆群。n基因文库含有基因组内全部基因片段，基因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列包括外显子和无表达功能的内含子序列。n每一个克隆只含有一个基因片段，应用每一个克隆只含有一个基
8、因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。的基因的克隆。（二）（二）cDNAcDNA文库文库 将将不同细胞类型不同细胞类型或或不同阶段细不同阶段细胞的胞的mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA后后,将所有将所有cDNAcDNA混合体与载体进行连接后，将混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为混合体称为 cDNAcDNA文库。文库。ncDNAcDNA文库文库(C-(C-文库文库)：是以是以mRNAmRNA合成的合成的互补
9、互补cDNAcDNA的随机片段的随机片段的重组的重组DNADNA克隆克隆群。群。ncDNAcDNA文库文库不含内含子序列不含内含子序列，易于表达。，易于表达。n具有具有组织细胞特异性组织细胞特异性：不同组织细胞、：不同组织细胞、不同发育阶段，基因表达的情况都不不同发育阶段，基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态；相同，应选择特异表达的细胞及状态；nC-C-文库比文库比G-G-文库小得多文库小得多，更容易筛选。，更容易筛选。第五节第五节 载体载体DNA与目的基因的连接与目的基因的连接 一、黏性末端一、黏性末端DNA片断的连接：片断的连接：n当在当在载体载体和和目的基因目的基因上有相上
10、有相同的限制酶酶切位点时，用同的限制酶酶切位点时，用同种限制酶（或同尾酶）使同种限制酶（或同尾酶）使二者产生二者产生相同的黏性末端相同的黏性末端，从而将二者连接。从而将二者连接。G G A T C CC C T A G GB a mH 的 识 别 序列 及 切 割 部 位G G A T C CC C T A G GB a mH 含 目 的 基 因 的 D N A 片 段B a mH GC C T A G5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 G G A T C CC C T A G G G A T C C G目 的 基 因 片 段混 合、退 火G C C T A G G A T C C
11、 G G A T C C GG C C T A G质 粒 载 体含 目 的 基 因 的 重 组 质 粒G C C T A G G A T C C GD N A 连 接 酶1 1、插入失活法、插入失活法（单酶切）（单酶切）n将外源目的基因插入载体选择性标记处，并使其失活。将外源目的基因插入载体选择性标记处，并使其失活。nP340P340图图8 82020n质粒质粒pBR322pBR322的抗性基因筛选示意图的抗性基因筛选示意图 2 2、定向克隆法（定向克隆法（双酶切双酶切）n为实现定向克隆，可采用为实现定向克隆，可采用两种不同的限制酶同时酶两种不同的限制酶同时酶切切，使目的基因，使目的基因两端具
12、有两端具有不同的黏性末端不同的黏性末端；定向克；定向克隆法构建重组分子隆法构建重组分子P341P341 双酶切双酶切DNADNA片段粘性末端的连接片段粘性末端的连接 G G A T C CC C T A G GB a mH B a mH B a mH G C C T A G5 3 5 3 5 5 5 3 5 3 3 G A A T T CC T T A A G A A T T C G目 的 基 因 片 段混 合、退 火G C T T A A G A T C C G A A T T C GG C C T A G重 组 质 粒D N A 连 接 酶Ec o RIEc o RI5 G A T C C
13、 G G C T T A A A A T T C G G C C T A G G A T C C G G C T T A AEc oR I G A T C C G G C C T A G3 5 载 体3 3、载体载体55端脱磷端脱磷法法 n载体酶切后，用载体酶切后，用APAP（碱性磷酸（碱性磷酸酶）水解酶）水解55端的磷酸基团端的磷酸基团防防止载体的自身环化止载体的自身环化。n重组分子在体内修复缺口重组分子在体内修复缺口 P342图822二、平末端二、平末端DNA片断的连接：片断的连接：n在载体和目的基因上没有相同的在载体和目的基因上没有相同的限制酶酶切位点时，采用平末端限制酶酶切位点时，采用
14、平末端连接。连接。1 1、由、由连接酶连接酶进行的连接：限制酶进行的连接：限制酶直接切割生成平末端，或用核酸直接切割生成平末端，或用核酸酶酶S1S1切去黏性末端的单链部分；切去黏性末端的单链部分；P310P310 在连接时，所用的在连接时，所用的ATPATP及及T T4 4DNADNA连接酶的浓度连接酶的浓度要比连接粘末端的要比连接粘末端的高高些些2 2、同聚物尾同聚物尾连接：连接：P343P343图图8 82323n利用末端转移酶在载体和目的基利用末端转移酶在载体和目的基因的因的3OH3OH上加上互补的同聚物上加上互补的同聚物尾尾，两者重组后，空隙由，两者重组后，空隙由DNADNA聚聚合酶合
15、酶填补。填补。3 3、人工接头人工接头法：法：P343P343图图8 82424 n人工接头（人工接头（linkerlinker）：）：也称衔接物，是用化也称衔接物，是用化学方法合成的一段由学方法合成的一段由10102020个核苷酸个核苷酸所组成所组成的，具有的，具有一个或几个限制酶识别位点的平头一个或几个限制酶识别位点的平头末端双链寡核苷酸短片段末端双链寡核苷酸短片段。n人工接头法：用连接酶将人工接头分子连接人工接头法：用连接酶将人工接头分子连接在目的基因的末端，再用相关的限制酶切割在目的基因的末端，再用相关的限制酶切割就可以使目的基因产生黏性末端。就可以使目的基因产生黏性末端。n双衔接物法
16、构建重组分子双衔接物法构建重组分子P344P344图图 连接物分子连接平末端的连接物分子连接平末端的DNADNA片段示意图片段示意图5335G G A T C CC C T A G G3 5 53B a mH 接 头多 核 苷 酸 激 酶连 接 酶53G G A T C CC C T A G G3 5 G G A T C CC C T A G GB a mH 切 割G C C T A G53 G A T C C G5 3B a mH 切 割 的 质 粒 载 体5353G C C T A G G A T C C GG C C T A G G A T C C G G A T C C GG C C
17、T A G重 组 质 粒目 的 基 因第六节第六节 重组分子引入受体细胞重组分子引入受体细胞 一、受体细胞的选择一、受体细胞的选择 1 1、原核原核/真核真核表达系统；表达系统；2 2、克隆克隆/表达表达；3 3、限制和修饰：应为、限制和修饰：应为限制酶缺陷型（限制酶缺陷型（R-R-），），重组缺陷型（重组缺陷型（Rec-Rec-）；）；4 4、互补互补功能：敏感型，营养缺陷型；功能：敏感型，营养缺陷型；5 5、易于、易于转化或转导转化或转导；6 6、感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型。n其他：其他：n7.遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。生长。n8.内源蛋白水解
18、酶缺失或蛋白酶含量低内源蛋白水解酶缺失或蛋白酶含量低细胞，有利于外源蛋白质在胞内积累。细胞，有利于外源蛋白质在胞内积累。n9.具有较好的翻译后加工机制。具有较好的翻译后加工机制。二、受体细胞的类型二、受体细胞的类型n1 1、原核表达系统：、原核表达系统：大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌；枯草杆菌、链球菌；n2 2、真核表达系统：、真核表达系统：酵母酵母、昆虫、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细细胞、植物细胞、哺乳动物细胞（胞（组织培养细胞组织培养细胞、胚胎干细、胚胎干细胞）；胞）；三、受体细胞的感受态三、受体细胞的感受态 重组重组DNADNA导入大肠杆菌的导入大肠杆菌的转化效转化效率率的高低与的
19、高低与受体的感受态受体的感受态有关。有关。n1 1、感受态细胞感受态细胞：细胞膜结构改变、：细胞膜结构改变、通透性增加、具有摄取外源通透性增加、具有摄取外源DNADNA的能的能力的细胞。力的细胞。n2 2、制备感受态细胞的方法：冰浴中，、制备感受态细胞的方法：冰浴中，用一定浓度的用一定浓度的CaClCaCl2 2处理。处理。四、重组子导入细胞的方法四、重组子导入细胞的方法n1 1、转化转化：重组：重组质粒质粒导入受体细胞导入受体细胞的过程。的过程。n2 2、转染转染：重组：重组DNADNA包装成包装成病毒病毒颗颗粒再来粒再来 感染受体细胞。感染受体细胞。n3 3、微注射技术；、微注射技术；n4
20、 4、电转化法；、电转化法；n5 5、基因枪技术；、基因枪技术；n6 6、脂质体介导法；、脂质体介导法；以以噬菌体、粘粒和真核病毒噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组为载体的重组DNADNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（此过程又叫转导（transductiontransduction）。）。使用机械的方法直使用机械的方法直接将外源接将外源DNADNA注射到细胞注射到细胞核或细胞质的方法。核或细胞质的方法。第七节第七节 重组体的鉴定和分析重组
21、体的鉴定和分析 n阳性重组子的鉴定和筛选阳性重组子的鉴定和筛选 根据根据遗传标记表型特征遗传标记表型特征：抗药性、：抗药性、互补、营养标记；互补、营养标记；根据根据重组子结构特征重组子结构特征：大小、酶切图：大小、酶切图谱、谱、PCRPCR扩增、核酸分子杂交、扩增、核酸分子杂交、DNADNA测序；测序；根据根据重组子表达产物重组子表达产物：免疫分析筛选；：免疫分析筛选；一、生物学方法一、生物学方法（一）表型筛选法（一）表型筛选法1 1、双抗生素双抗生素筛选法筛选法n结合结合载体上所含有的原核抗药性标记载体上所含有的原核抗药性标记，利用抗生，利用抗生素和选择培养基（不完全培养基），十分便于筛素和
22、选择培养基（不完全培养基），十分便于筛选阳性重组子。选阳性重组子。2 2、半乳糖苷酶筛选法半乳糖苷酶筛选法na a 互补（互补（a-complementationa-complementation）某些质粒（如某些质粒（如PUCPUC系列），含有大肠杆菌的系列），含有大肠杆菌的laclacZ Z基因片段，在该基因区又有基因片段，在该基因区又有MCSMCS，这些质粒将导入，这些质粒将导入 laclacZ Z-的宿主菌中表达。的宿主菌中表达。如果无外源基因插入：如果无外源基因插入：则质粒则质粒laclacZ Z基因正常表达和宿基因正常表达和宿主菌的主菌的laclacZ Z基因互补，产生有活性的基因
23、互补，产生有活性的 半乳糖苷半乳糖苷酶，经酶，经IPTGIPTG诱导后，分解诱导后，分解X-galX-gal底物，产生底物，产生blue blue clonyclony。如果有外源基因插入：如果有外源基因插入：则质粒编码的则质粒编码的laclacZ Z基因失活、基因失活、菌体不可能互补产生菌体不可能互补产生 半乳糖苷酶，产生半乳糖苷酶，产生a a 互补筛选重组体示意图互补筛选重组体示意图3 3、营养标记筛选法、营养标记筛选法n例如例如酵母人工染色体上的酵母人工染色体上的TRP1H TRP1H URA3URA3基因，分别是酵母色氨酸和基因，分别是酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型尿嘧啶营养缺陷型trp
24、1-trp1-和和ura3-ura3-的野生型等位基因，在相应的缺的野生型等位基因，在相应的缺陷型酵母细胞中作为选择标记；陷型酵母细胞中作为选择标记；n（二）噬菌斑形成筛选法：含有外源基（二）噬菌斑形成筛选法：含有外源基因的噬菌体载体可以形成噬菌斑，反之因的噬菌体载体可以形成噬菌斑，反之不能。不能。n（三）遗传互补法（三）遗传互补法利用遗传选择标利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞记筛选哺乳动物转基因细胞 利用表达产物与宿主细胞中营养缺陷突变利用表达产物与宿主细胞中营养缺陷突变发生互补。发生互补。n（四）利用报告基因筛选植物转化细胞（四）利用报告基因筛选植物转化细胞二、核酸分子杂交：二、核酸
25、分子杂交：1、原理：、原理：n利用序列互补的利用序列互补的单链单链DNADNA和和RNARNA可利用可利用碱基配碱基配对产生氢键对产生氢键而形成杂交分子的特性，检测核而形成杂交分子的特性，检测核酸分子中特异性序列的存在。酸分子中特异性序列的存在。2、类型：、类型：n菌落原位杂交；菌落原位杂交；nDNADNA印迹分析；印迹分析；nRNARNA印迹分析；印迹分析；n斑点杂交和狭缝杂交；斑点杂交和狭缝杂交；三、免疫学方法三、免疫学方法四、四、PCR技术技术五、酶切鉴定五、酶切鉴定六、序列分析双脱氧终止法测序六、序列分析双脱氧终止法测序（Sanger法）法）链末端终止法的链末端终止法的原理原理：P35
26、4P354n1 1、利用、利用DNADNA聚合酶，以单链聚合酶，以单链DNADNA为模板，以为模板，以dNTPdNTP为底物，在为底物，在四组互相独立的反应体系四组互相独立的反应体系中中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸作为分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸作为链反链反应终止剂应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成引导下，合成四组有序列梯度的互补四组有序列梯度的互补DNADNA链链，然后通过高分辨率的变性然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影检测泳，放射自显影检测后识读待测后识读待测DNADNA序列。序列。n2 2、引入双脱氧核苷
27、三磷酸（、引入双脱氧核苷三磷酸（2 2,3,3-ddNTPddNTP）作为链终止剂，）作为链终止剂，2 2,3,3-ddNTPddNTP与普通的与普通的dNTPdNTP不同之处在于其不同之处在于其3 3位又少了个羟基位又少了个羟基。其。其5 Pi5 Pi可以和可以和多核苷酸链的多核苷酸链的3 3羟基形成磷酸二酯键，羟基形成磷酸二酯键，但但3 3不能再与下一个核苷酸缩合不能再与下一个核苷酸缩合，结，结果使得多核苷酸链的延伸终止于果使得多核苷酸链的延伸终止于ddNTPddNTP。n3 3、如果在、如果在DNADNA的合成反应中，在的合成反应中，在4 4种正常的种正常的dNTPdNTP之外，再加入一
28、之外，再加入一种少量的种少量的ddNTPddNTP，那么多核苷酸，那么多核苷酸链的链的延伸将与偶然发生但却十分延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争特异的链终止展开竞争，所以反，所以反应产物是一系列长短不一的核苷应产物是一系列长短不一的核苷酸链。酸链。n4 4、在、在4 4组独立的组独立的DNADNA合成反应中，合成反应中，分别加入分别加入4 4种不同的种不同的ddNTPddNTP，结果，结果将生成将生成4 4组核苷酸链，它们将分组核苷酸链，它们将分别终止于每一个别终止于每一个A A、G G、C C、T T的位的位置上。对这置上。对这4 4组核苷酸链同时进组核苷酸链同时进行聚丙烯酰胺凝胶
29、电泳，就可读行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列出序列目的目的DNADNA片段片段5 5 端端引入引入NdeINdeI（CATATGCATATG）酶切位点，利用）酶切位点，利用其中的其中的ATGATG作为起始密码子。作为起始密码子。优点为较稳定，不易被菌体蛋白酶优点为较稳定，不易被菌体蛋白酶水解；原核多肽部分有利于分离纯化；水解；原核多肽部分有利于分离纯化；原核部分可被水解；原核部分可加入原核部分可被水解；原核部分可加入信号肽，构成分泌蛋白。信号肽，构成分泌蛋白。读框漂移（读框漂移（frame shiftframe shift）在载体的起始密码子在载体的起始密码子ATGATG的的3 3 紧接一段紧接一段编码原核信号肽的核苷酸序列。紧接着是多编码原核信号肽的核苷酸序列。紧接着是多克隆位点，用限制酶切开后，将目的基因插克隆位点，用限制酶切开后，将目的基因插入信号肽核苷酸序列的入信号肽核苷酸序列的3 3 端。表达的蛋白即端。表达的蛋白即为分泌性蛋白。为分泌性蛋白。
