1、蜡样芽胞杆菌检测 Examination of Bacillus cereus 蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)?是芽胞杆菌属（Bacillus）的一种，属于土壤细菌 。?在自然界广泛分布于尘土、污水、河流和食品中，在蔬菜、谷类等农作物和食品原料中主要以芽胞状态存在。?已从多种食品中分离出该菌。涉及的食品有米、肉、乳制品、蔬菜、鱼、糊、调味汁、布丁、汤、糕点、沙拉等。在食品混合物如酱油、布丁、汤、红烧蔬菜炖肉中也发现该菌。?1950年首次在挪威明确报告其致病作用。蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒?蜡样芽胞杆菌食物中毒以夏季（6 10月）最高。?引起中毒的食品往往由于食前保存温度不当，放
2、置时间较长或食品加热不彻底而导致中毒。蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒?该菌引起的食物中毒发病率较高?有可能在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌?一般认为该菌为条件致病菌，中毒是产生肠毒素所致?进食其中污染菌量105g的食物时，就可能发生食物中毒。引起食物中毒的原因肠毒素?呕吐毒素：一种环形，小分子量、热稳定多肽，10030min 不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。?腹泻毒素：一种大分子量蛋白，水样腹泻、腹部痉挛和疼痛，呕吐很少见。能在各种食物中形成;引起食物中毒的主要食物种类?美国 炒米饭?欧洲 甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品?中国 米饭、淀粉类制品?在国内，于1973年首次报告了南
3、京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒后，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位。临床表现?“呕吐型呕吐型”：潜伏期为：潜伏期为0.5h5h，是由于人摄入本菌在食品中产生的毒素引起的，原因食品主要为米饭类、面类（挂面、荞麦面饼）等。症状以恶心、呕吐为主，病程不超过 24h。?“腹泻型腹泻型”：潜伏期为：潜伏期为8h16h，是由于本菌在肠道内增殖过程中产生肠毒素引起的，原因食品主要为肉类、肉汤和其它食物。症状为水泻、腹痛、腹痉挛为主，病程约24h。芽胞杆菌属?70个种，临床上可以分离到的有一下种类：蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第 I群
4、。蜡样芽胞杆菌生物学特性 革兰氏阳性大杆菌，需氧或兼性需氧 芽胞位于菌体的中心或次末端，不突出菌体 菌体两端较平整，多呈链状排列 生长温度2537，最佳3035?在营养肉汤中在营养肉汤中32培养培养3d后，芽胞形成率在后，芽胞形成率在90以以上，80-85 水浴5min-10min 可刺激芽胞萌发。新国标编制说明 背景 现行标准不足处 重新修订的意义 新国标编制说明?为了在食品中有效开展蜡样芽胞杆菌检测，以保障食品安全，降低蜡样芽胞杆菌感染的风险，防止食源性蜡样芽胞杆菌疾病的发生，我国在 1984年制定了食品卫生微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验（GB/T 4789.14-1988）标准，该标准的
5、颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测，为蜡样芽胞杆菌病的监测、预防、控制起到了重要的作用。背景?在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞杆菌检测标准经过1994年、2003年二次修订，但内容可以说完全与1984年版相同。现行GB/T 4789.14-2003标准不足处?1.对蜡样芽胞杆菌含量少于 1000cfu/g的样品计数效果差。?2.采用的361培养温度并非是蜡样芽胞杆菌最适生长条件。?3.检验结果与现行的其它国家的标准存在一定差异。重新修订的意义 提高检出率 扩大检测范围 与国际接轨 适用性和可操作性 提高检出率?蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为 3032。?经标准修订协作组验证：?30 1 培养48h
6、，平均生长率93.69%。?30 1 培养24 h，平均生长率92.28%。?36 1 培养24 h。平均生长率82.32%。提高检出率?经统计学分析，经统计学分析，30 1 培养温度的生长率显著培养温度的生长率显著高于36 1 (P0.05），但在培养温度相同的情况下，培育时间24h和48h蜡样芽胞杆菌生长率无显著差异（P0.05）。表1 MYP培养条件选择结果 比对单位 菌量（cfu/皿）MYP平板计数结果 30 1 24h 30 1 48h 36 1 24h 36 1 48h 计数结果cfu/皿 生长率（%）计数结果cfu/皿 生长率（%）计数结果cfu/皿 生长率（%）计数结果cfu/
7、皿 生长率（%）吉林省CDC 86 88 102.33 88 102.33 64 74.42 64 74.42 湖北省CDC 40 48 120.00 48 120.00 45 112.50 45 112.50 江苏省CDC 67 25 37.31 26 38.81 50 74.63 50 74.63 浙江省CDC1 70 73 104.28 73 104.28 64 91.43 64 91.43 广东微生物研究所 59 81 137.29 88 149.15 61 103.38 71 120.34 浙江省CDC2 91 65 71.42 59 64.84 59 64.84 50 54.95
8、浙江省CDC3 34 37 108.82 37 108.82 25 73.53 25 73.53 平均值 63.86 59.57 92.28 59.86 93.69 52.57 82.32 52.71 82.54 扩大检测范围?在定量检测方面，美国 FDA、ISO、以及SN 0176-92 标准除采用平板计数外，还采用了 MPN法。?新标准增加MPN 法，以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于103 cfu/mL 时用平板计数法计数不准的问题；?该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。便于与国际接轨?随着经济全球化的发展，食品贸易不断扩大，食品安全问题越来越到受各国政府的重视，为了保护我
9、国消费者健康，避免贸易摩擦，急需对原标准进行修订，使其与国际接轨。提高方法的适用性和可操作性?新标准将考虑我国的实际情况，使蜡样芽胞杆菌检测方法具有更好的适用性和可操作性。并保持与原标准的连续性。新标准与GB/T 4789.14-2003相比主要修改如下:?-修改了标准的中英文名称；?-增加了第二法 蜡样芽胞杆菌MPN 计数法；?-将选择性分离培养基（MYP）培养条件由37 培12 h-20 h改为30 1 培养24 h-48 h；?-增加了根状生长试验和溶菌酶试验。?-增加了附录A、附录B。食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验（修订版）1 范围?本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌
10、的检验方法。?本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数；第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。2 设备和材料?除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：?冰箱：2-5;?恒温培养箱：30 1、36 1;?均质器;?电子天平：感量0.1 g;?无菌锥形瓶：100 mL、500 mL;?无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头;?无菌平皿：直径90 mm;?无菌试管：18 mm180 mm;?显微镜：10倍-100倍（油镜）;?L涂布棒。3 培养基和试剂?3.1 磷酸盐缓冲液（PB
11、S）?3.2 甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂?3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤?3.4 营养琼脂?3.5过氧化氢溶液?3.6动力培养基?3.7硝酸盐肉汤?3.8酪蛋白琼脂 3 培养基和试剂?3.9 硫酸锰营养琼脂培养基硫酸锰营养琼脂培养基?3.10 糖发酵管?3.11 V-P培养基?3.12 胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂?3.13 溶菌酶营养肉汤?3.14 西蒙氏柠檬酸盐培养基?3.15 明胶培养基 蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）4 检验程序 5 操作步骤操作步骤 5.1 样品处理?冷冻样品应在45以下不超过15 min或在28不超过18 h解冻。若不能及时检验，应放于-15左右保存；?非
12、冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应置于28冰箱保存，在24 h内检验。5.2 样品制备?以无菌操作取样品25 g（mL），加入PBS 225 mL，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min 10000 r/min 均质1 min 2 min，或拍击式均质器拍击 2 min。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后称取25 g（mL）置合适的容器中，加 225 mL PBS，充分振荡混匀。制成 1:10的样品匀液。5.3 样品的稀释?吸取上述1:10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS 或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成 1:100 的样品匀液。?据对样品污染状况的
13、估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。5.4 样品接种?根据对样品污染状况的估计，选择 2个 3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块MYP琼脂平板，然后用无菌 L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。?使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25 50 的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。5.5 分离、培养?5.5.1 分离?在通常情况下，涂布后，将平板静置 10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30 1 培养 1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，
14、倒置于培养箱，30 1 培养 24 h2 h。?如果菌落不典型，可继续培养 24 h2 h再观察。分离分离 在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色(表示不发酵甘露醇)，周围有白色至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）。5.5.2 纯培养?从每个平板中至少挑取 3个典型菌落（小于3个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 1 培养 24 h2 h，进行确证实验。?在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm 10 mm。营养琼脂平板纯化培养 6 确证实验?6.1 形态?挑取纯培养的单个菌落，作革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌
15、为革兰氏阳性芽胞大杆菌，大小为（11.3）m（35）m，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。蜡样芽胞杆菌革兰氏染色蜡样芽胞杆菌革兰氏染色 蕈状芽胞杆菌革兰氏染色蕈状芽胞杆菌革兰氏染色 菌体，游离芽胞 巨大芽胞杆菌巨大芽胞杆菌 6.2 生化鉴定?挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。?蜡样芽胞杆菌的主要生化特征见表 1。表1 蜡样芽胞杆菌的主要生化特征 项目 蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus 苏云
16、金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis 蕈状芽胞杆菌 Bacillus mycoides 炭疽芽胞杆菌 Bacillus anthracis 巨大芽胞杆菌 Bacillus megaterium 革兰氏染色 +a+过氧化氢酶 +动力 +/-b+/-c-+/-硝酸盐还原 +/-+-/+d 酪蛋白分解 +/-/+/-溶菌酶耐性 +-卵黄反应 +-葡萄糖利用（厌氧）+-V-P试验 +-甘露醇产酸 -+溶血（羊红细胞）+-/+-根状生长 -+-蛋白质毒素晶体 -+-a：+表示 90%100%的菌株阳性；b：+/-表示大多数的菌株阳性；c：-表示 90%100%的菌株阴性；d：-/+表
17、示大多数的菌株阴性。蜡样芽胞杆菌生化特征蜡样芽胞杆菌生化特征 过氧化氢酶；葡萄糖利用（厌氧）；硝酸盐还原；V-P试验；甘露醇产酸；酪蛋白分解；6.2.1 溶血试验?挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB琼脂平板上，30 1 培养24 h2 h。?蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽胞杆菌为不溶血。蜡样芽胞杆菌完全溶血环（24h）苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，巨大芽胞杆菌不溶血。6.2.2 根状生长试验?挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上，挑取单个可疑菌落
18、划线接种于营养琼脂平板上，30 1 培养24 h2 h。?蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。?多数蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。根状生长 根状生长根状生长 30，24h培养，室温放置3天后根状生长观察。6.2.3 蛋白质毒素结晶试验?取经30 1 培养24 h2 h并于室温放置3 d4 d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满0.5碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min 2 min，移去火焰，再更换染色液再次加温染色 30 s，倾去染液用洁净自来水彻底
19、清洗、晾干后镜检。?观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富，应将培养物置室温 2 d3 d再行检查。放置3d4d以上的苏云金芽胞杆菌培养物有大量的结晶体，但是只有在芽胞裂解通过上述染色方法才能见到。然而，除非见到芽胞，否则培养物应在室温继续放置几天以重新检查毒素晶体。其它芽胞杆菌不产生蛋白质毒素晶体。苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶 游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶 蛋白质毒素结晶形态观察 芽孢形成期的菱形晶体蛋白
20、扫描电镜观察（扫描电镜观察（20kv，9.5mm15.0k）光学显微镜观察光学显微镜观察 100倍油镜 6.2.4 溶菌酶耐性试验?用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，36（or30）1 培养24h。蜡样芽胞杆菌在本培养基（含0.01溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。巨大芽胞杆菌不生长。6.6 生化分型?可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别。7 结果计算?7.1 典型菌落计数和确认?7.1.1 选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在 20 CFU 200 CFU 之间的
21、平板，计数典型菌落数。?如果：?a）只有一个稀释度的平板菌落数在 20 CFU200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；?b）所有稀释度的平板菌落数均小于 20 CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；?c）某一稀释度的平板菌落数大于 200 CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；?d）若所有稀释度的平板菌落数大于200 CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；?e）若所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU-200 CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200 CFU时，应计数最接
22、近20 CFU或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。?以上按公式（1）计算。?f）若2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU-200 CFU之间，按公式（2）计算。?4.4.1.2从典型菌落中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 1 培养24 h2 h。?4.4.2 计算公式?4.4.2.1 公式（1）?T=AB/Cd?(1)式中：?T样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；?A某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；?B鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；?C用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；?d 稀释因子。公式（2）?)式中：?T 样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；?A1第一
23、稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；?A2第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；?B1第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；?B2第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；?C1第一稀释度（低稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；?C2第二稀释度（高稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；?1.1计算系数（如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；?d 稀释因子（第一稀释度）。.1d1222111CBACBAT?8 结果报告?根据MYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按公式计算，报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌菌数，
24、以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。蜡样芽胞杆菌MPN计数法（第二法）10.1-10.3 样品处理、样品制备和样品稀释同平板计数法 10.4 样品接种?取三个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），接种于10 mL 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，每一稀释度接种3管，每管接种1 mL（如果接种量需要超过 1 mL，则用双料胰酪胨大豆多粘菌素肉汤）。?于30 1 培养48 h2 h。10.5 培养?用接种环从各管中分别移取 1环，划线接种到MYP琼脂平板上，30 1 培养24 h2 h。如果菌落不典型,可继续培养24 h2 h再观察。10.6 确证实验?从每个平板选取至少 5个典型或可疑菌落，划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 1 培养24 h2 h，进行确证实验。11 结果报告?MPN计数结果报告方式：根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数，查MPN 检索表，报告每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌的MPN 值。注意事项?MPN法法可以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于 103 cfu/mL 时用平板计数法计数不准的问题，同时该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。?某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。谢 谢！放映结束 感谢各位的批评指导！让我们共同进步
