1、 药品生产企业 微生物实验室的质量控制 内容n微生物实验室规范的控制n微生物检验方法的控制 相关法规要求nGMP(2010年修订版)n中国药典2010版药品微生物实验室规范指导原则n中国药典2010版微生物限度检查法n中国药典2010版无菌检查法n中国药典2010版微生物限度检查法应用指导原则n中国药典2010版药品微生物检验替代方法验证指导原则 应用范围 n药品生产所使用的原料及制剂都必须遵守法规要求n药品生产及销售都必须符合法律要求。n微生物质量的标准可能会因地域及应用方式的不同而不同。n各国药典中都有相应微生物试验的详细要求。原则 n必须使用经验证的检验方法n严格按照药品微生物试验室规范
2、要求进 行试验(实验室控制系统GMP实施指南）2010版GMPn第六十四条n第六十六条n第六十九条n第二百二十六条n第二百三十三条 药品微生物实验室规范药品微生物实验室规范包括以下几个方面：n人员n培养基n菌种n实验室的布局和运行n设备、文件、实验记录，结果的判断等 人员n人员资质n培训要求实验室的布局和运行n具有良好微生物实验室操作规范和实验室安全的要求。n既要最大可能防止微生物的污染，又要 防止检验过程对环境和人员造成危害。n合适的规划及活动区域的合理区分将提 高微生物实验室操作的可靠性。实验室的布局n检验洁净区n菌种处理、微生物鉴别、阳性对照实验室（P2实验室）n培养室n实验结果观察区n
3、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区n样品接收和储藏区n标准菌株储藏区n污染物处理区n文档处理区等辅助区域 实验室的运行n人流n物流n水系统n洁净装修n实验室管理：环境监测、清洁消毒、制度及标准操作规程的制定 实验室的布局和运行n总结 设备n实验室应配备与检验能力和工作量相适应的的仪器设备。n完成相应的检定，校准，验证，确认。n形成相应的操作，维护和保养的标准操 作规程。n使用要有记录。设备n无菌隔离器（如使用）、生物安全柜 n实验室用层流台 n培养箱 n蒸汽灭菌柜、干热灭菌柜n空调高效过滤器n其他n灭菌消毒方式 设备n 重要的仪器设备，应由专人负责n 对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅对关键参数（如
4、温度、压力）和记录（有条件的情况下尽量使用自动记录装置），如果发生偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。设备n 容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期进 行清洁和消毒。n 对试验需用的无菌器具应有明确标识，实施正确的清洗、灭菌措施，并形成相 应的标准操作规程。培养基n培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。n适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质 量控制试验是提供优质培养基的保证。培养基n培养基的制备n培养基的储藏n质量控制实验 菌种 菌种n标准菌株的复活n培养物的制备n工作菌株的传代次数n菌种的管理文件及记录菌种的管理实验室必须建立菌种
5、保存和使用文件化的程序管理制度；包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。文件n 文件应当充分表明实验是在实验室按可 控的检查法进行的 文件n 人员培训和资格确认n设备验收；验证；检定（或校准期间核查）和维修n设备使用中的运行状态（设备的关键参数）n培养基制备、储存和质量控制n检验规程中的关键步骤n数据记录与结果计算的确认n质量责任人对实验报告的评估n数据偏离的调查文件n 每一个进行检验的实验
6、室必须建立并遵 守质量保证（QA）的政策和程序，用所 建立的QA政策和程序来监测和评价整个 检验过程。n 所有QA活动都必须文件化。实验记录n实验结果的可靠性依赖于实验严格按照标准操作规程进行。n标准操作规程应指出如何进行正确的实验操作。n实验记录应包含所有关键的实验细节，以便确认数据的完整性。实验记录n正确的试验研究和实验记录是微生物试验成功的关键。要使实验结果可信最基本的原则是试验应按SOP规定的内容进行操作；如正确的试验操作、完整的实验记录，以便确认数据的完整性。结果的判断n微生物实验的特殊性n影响结果观察的条件和因素n不符合要求和规定的原因调查n异常结果的分析n重新抽样复检微生物实验的
7、特殊性影响试验结果的因素 药品微生物检验较为特殊，因是活微生物，受到外界影响因素较，因此检验结果分析比较困难，其影响因素有以下几方面：1、微生物在自然界中普遍存在。2、实验人员在样品处理过程或其它操作步骤可能受微生物污染。3、微生物在样品或环境中分布不均匀等。异常结果分析 以上原因造成试验结果的误差大和重现性差，因此，在试验时应尽最大程度的避免外来的污染。应对实验结果进行全面分析，如果实验结果不符合标准规定，应立即通知实验室管理人员，组织进行原因调查分析。分析内容包括：实验室环境 抽样区的防护条件 样品本身是否具有影响微生物存活或繁殖的成分和作用 实验操作是否规范 以上都是评价实验结果真实性的
8、重要依据。n如果依据分析调查结果发现，试验全过程中任何一个环节有错误，可判实验结果无效，那么应重新制定实验方案，按照正确的方案进行实验，在这种情况下，应特别认真对试验过程及正确的试验操作进行监控，实验室必须认可复试程序，如果需要，重新抽样，但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查，这种情况必须详细记录。微生物限度检查法n细菌数n霉菌数、酵母菌数n控制菌n检查方法的验证n微生物限度标准n结果判断 无菌检查法微生物限度检查法应用指导原则n对微生物限度检查法中的标准、方法中 的特定内容、标准的应用做进一步的说 明。n 10项内容药品微生物检验替代方法验证指导原则n为微生物实验室所采用的试验方法能否
9、替代药典规定方法用于药品微生物的检验提供指导n微生物定性检验方法的验证n微生物定量检验方法的验证 三类微生物检验的新技术n 基于微生物生长信息的检验技术，如生物发 光技术、电化学技术、比浊法等；n 直接测定被测介质中活微生物的检验技术如 固相细胞计数法、流式细胞计数法等；n 基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析 技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时，新技术的使用也促进了
10、生产成本降低及检验水平的提高，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。若替代方法只是针对药典方法的某一环节进行技术修改，则验证仅针对该替代技术而非整个检验方法。药品微生物检验方法分为定性试验和定量试验。定性试验是测定样品中是否存在活的微生物；定量试验是测定样品中存在的微生物数量。替代方法的验证也分为定性和定量两类，不同类型需要验证的参数不同，验证参数的设定借鉴了美国和欧洲药典的规定，但又结合了我国国情。具体参数的设定见下表。参数定性检验定量检验准确度精密度专属性检测限定量限线
11、性范围重现性耐用性注：表示需要验证 表示不需要验证替代方法的一般要求n 在以替代方法对样品检验的适用性进行验证前，必须证明所选用的替代方法具有方法适用性，即表明在不含样品的情况下，替代方法的专属性、精密度、检测限等参数。n 确认方法的适用性后，用样品按上表规定的参数进行验证。验证至少用2个批号的样品，每批样品每个菌应至少平行进行三次独立实验。n 参数验证的菌种应包括培养基适用性检查规定的菌种，必要时，还应根据替代方法及样品的特性增加相应的菌种。定性检验的方法验证 1、专属性：是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。强调应关注样品存在对检验结果的影响 在使用依赖培养技术（以微生物生长作为判
12、断）的替代方法时，样品的存在会导致检验出现假阴性，应特别确认培养基的促生长试验及样品的存在对检验结果的影响。对于不依赖培养技术的替代方法，样品的存在还可能导致检验出现假阳性，应特别确认检测系统中的外来成分不得干扰试验，确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。2、检测限：是指在替代方法设定的检验条件 下，样品中能被检出的微生物的最低数量，该数量是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。验证的关键是确定接种菌的最低数量（每单位不超过5cfu），分别用药典方法和替
13、代方法对该菌进行检验，比较两种方法的差异。与国外药典规定相同，要求试验菌的接种量应能够在采用药典方法检验时，有50的检出率。检测限验证至少应重复进行5次。3、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时，应排除样品均一性的影响 4、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。对替代方法进行耐用性评价，确定方法操作的关键注意点。在开展了上述评价后，可以不必比较替代
14、方法的耐用性与药典方法的差异。定量检验的方法验证 1、准确度：是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果的一致程度。准确度的确认应在检验的范围内。通常用微生物的回收率（）来表示准确度。验证的菌浓度应该在检测范围内，一般应选择能够准确计数的最高浓度，系列稀释至较低浓度，并且至少应该有5种浓度，每种浓度重复检验5次。替代方法的回收率应该达到70以上。当替代方法并不依赖微生物生长出菌落或出现混浊来进行定量时，可能出现回收率高于药典方法的情况，此时应结合专属性的内容对准确性进行评价。2、精密度：是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度。通常采用标准偏差或相对标准偏差（变
15、异系数）来表示。验证的菌浓度同准确度，每种浓度重复检验10次。可以接受的相对标准偏差（RSD）应不大于35。一般来说，替代方法的相对标准偏差（RSD）应不大于药典方法。在该项目上，USP 的规定是1535，研究表明，当含菌浓度在30300cfu/ml时，计数结果的RSD完全可能在15以内，因此，指导原则中对该指标作了修改。3、专属性：是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。验证的关键是合理评价样品的
16、存在对检验结果的影响，当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时，这种评价显得尤为必要。4、定量限：是指样品中能被准确检验的微生物最低数量。验证的关键是在检验范围的低限，选择尽可能低的5种菌浓度，每种浓度重复测定5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。5、线性：是指在检验范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。线性验证时必须覆盖能够准确检测的所有浓度范围。每株菌至少应该有5种浓度，每种浓度至少测定5次。在对验证数据进行处理时，应以样本中预期的菌浓度为自变量，以不同方法的计数结果为因变量，进行线性回归分析，计算相关系数，替代方法的相关系数不得低于0.95。6、范围：是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。7、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时应制备均一的实验样本 8、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。当检验方法采用基于培养的技术时，一般的参数变化是指对培养温度和时间进行调整，上述调整对检验结果的影响并不显著。谢谢！
