1、重组蛋白药物纯化与质量控制ContentsLOGO蛋白纯化原则与方法1蛋白质量控制方法2蛋白纯化原则LOGO生化分离技术基因重组技术免疫检测技术给人类带来了抗体和药物。现代生物技术蛋白纯化原则LOGO确定目标purity,quantity,biological activity,economy充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤e
2、xtra steps reduce yield and increase time,combine steps logicallyLOGO蛋白纯化原则Guidelines for Protein Purification纯化流程LOGO动物植物培养物纯化流程LOGO纯化流程LOGO细胞破碎蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素粗 提沉淀相分离分子筛精 提各种色谱电泳分离差速离心研磨超声渗透压酶保 存预处理原材料的获取浓缩保存状态保存条件保存期限纯化流程LOGOCapture LOGOResolutionSpeedRecoveryCapacity Initial purification of the ta
3、rget molecule from crude or clarified source material Concentration and stabilization(e.g.removal of proteases)Intermediate Purification LOGO ResolutionSpeedRecoveryCapacity Removal of bulk impuritiesPolishing LOGO ResolutionSpeedRecoveryCapacity Final removal of trace contaminants,e.g.structural va
4、riants of the target protein 纯化流程LOGO一般生产纯化不超过4个步骤。分离纯化机制LOGO带电基团不同的大小和尺寸疏水基团相互作用极性不同LOGO分离纯化机制不同层析介质的成本：离子交换，金属螯合，疏水层析，分子筛，亲和层析LOGO稳定性（PH值，活性）等电点疏水性分子大小，形状。关键辅助因子关键杂质产品浓度引进污染物产品纯度单位成本产量检测方法-质量控制纯化方法纯化总结LOGO纯化总结Develop assay methodsSet the aims Characterize the target proteinUse different separation
5、 principlesUse few stepsLimit sample handling between purification stepsRemove proteases quicklyReduce volume in early stepTRY!LOGO纯化总结LOGO19Contents 效 价（活性）鉴 定安 全 性杂 质稳 定 性一 致 性蛋白质含量细胞生物学微生物学免疫学生物化学纯 度分子生物学重组蛋白药物的质量控制LOGO常规质量控制方法20SDS-PAGEWestern BlotELISAHPLCLOGO聚丙烯酰胺凝胶(PAG)21单体：丙烯酰胺(Acr)交联剂：甲叉双丙烯
6、酰胺(Bis)聚合剂：过硫酸铵（APS）催化剂：四甲基乙二胺(TEMED）产物：三维网状结构的凝胶.电泳(E)带电颗粒（蛋白质）在电场作用下，在PAG上向着与其电荷相反的电极移动，从而达到分离的效果。SDS-PAGELOGO蛋白质在PAGE中的分离因素 22电荷因素分子大小分子形状SDS-PAGE23灵敏度1mg(1)纯度分析(2)分子量的测定(3)初步鉴定(4)含量的测定(配合扫描半定量)(5)水解的分析(如酶谱法)(6)Western Blotting的前部分(7)氨基酸序列分析-结合质谱SDS-PAGELOGOSDS-PAGELOGO电泳出现两条或者两条以上条带免疫印迹SDS-PAGEL
7、OGO将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品。印迹法(Blotting)通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。Western印迹法Werstern BlotLOGO膜的特点 27LOGO28p 半干转 v 用滤纸吸Buffer来做转移体系v 适合转移小分子量的蛋白；v 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据 蛋白分子大小定的；v 56mA/膜 1h p 湿转v 将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里v 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白；v 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定；v 30
8、0mA 1hWerstern Blot转移方法LOGOWerstern Blot直接法v 优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带v 缺点：1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便LOGO间接法Werstern Blotv 优点：1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Markerv 缺点：1.交叉反应引起的非特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化LOGO显色 显色方法代表类型特点酶促底物发光法酶促底物发光法 DAB显色法显色法稳定性好，灵敏度较高稳定性好，灵敏度
9、较高（250pg），背景一般，），背景一般，成像性较差，药品疑有成像性较差，药品疑有一定致癌性。一定致癌性。化学发光法化学发光法（推荐使用）（推荐使用）ECL发光法发光法稳定性好，灵敏度高稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以），背景可以很低，成像性好，且可很低，成像性好，且可以重复标记。以重复标记。放射自显影 底物化学发光ECL 底物荧光ECF 底物DAB呈色 ECL:（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。Werstern Blot灵敏度1-5ngq 目的蛋白的表达特性分析q 目的蛋白的组织定位q 目的蛋白与其它蛋白的互作q
10、 目的蛋白的表达量分析32Werstern BlotLOGO3333Step4 转膜Step6 免疫反应 Step7 显色检测Step2 蛋白定量Step3 SDS-PAGEStep1 蛋白提取 Step5 封闭Werstern BlotLOGOELISAELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。优点：快速、灵敏、定性、定量、定位，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。LOGOELISA LOGOELISALOGO用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温育加入底物
11、，显色ELISALOGOELISA 待测抗原酶标抗原39灵敏（纳克水平）、特异、简单、快速、易于自动化操作。一天之内可以检查几百甚至上千份标本，高通量检测筛选。应用：1、定量检测抗原或抗体成份。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。ELISA40输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统HPLC是以液体为流动相，并用高压输送，色谱柱采用填充颗粒十分细小的高效分离柱，柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测.HPLC41类 型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备 分配色谱疏水分配作用各种有机物分
12、离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析HPLC HPLC的图形结果42l色谱图(Chromatogram):l 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间色谱峰时间(分)基线峰高峰宽响应值HPLC43 从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：根据色谱峰的个数，可以判断样品中所 含组分的最少个数 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析 根据色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 根据色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据(R值）HPLC在生化中,主要用在下面几处:1纯度；2分子量；3肽谱;4分离制备蛋白质和肽；5脱盐。44Application灵敏度0.1ng/mLHPLCLOGO常规质量控制方法45SDS-PAGEWestern BlotELISAHPLCLOGOSOP:Standard Operation Procedure 标准作业程序LOGOLOGOWhat is QCQA?LOGOLOGOLOGO
