1、微生物的实验室培养了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。的培养。一、课题目标：一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法、稀释涂布法等基本掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法、稀释涂布法等基本操作技术，操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：二、课题重点和难点：三、技能目标：三、技能目标：一、基础知识：一、基础知识：（一）培养基（一）培养基 1.培养基种类及用途培养基种类及用途培养基是
2、由人们按照微生物对营养物质的培养基是由人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供微生物生长繁殖的营不同需求，配制出供微生物生长繁殖的营养基质。养基质。按物理状态不同划分按物理状态不同划分固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%1.5%-2.0%琼脂含量一般为琼脂含量一般为0.2%-0.7%0.2%-0.7%不加任何凝固剂不加任何凝固剂半固体培养基半固体培养基固体培养基常用来进行固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保
3、藏定、活菌计数及菌种保藏 观察微生物的运动特征、分类鉴定及观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定噬菌体效价滴定 大规模工业生产及在实验室进行微生大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究物的基础理论和应用方面的研究 液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长液体培养基液体培养基固体培养基：固体培养基：微生物的分离、鉴定、微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏活菌计数及菌种保藏菌落菌落菌落：菌落：n单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构
4、的子细胞群体，叫做菌落。可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。n菌落是鉴定菌种的重要依据菌落是鉴定菌种的重要依据。细菌的菌落特征细菌的菌落特征因种而异因种而异 菌落：菌落：霉菌的菌落霉菌的菌落特征因种而特征因种而异异无动力无动力 有动力有动力(弥散弥散)(是否运动是否运动)半固体培养基：半固体培养基：观察微生物的运动特征、分类鉴定观察微生物的运动特征、分类鉴定按用途不同划分按用途不同划分基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生
5、物从混杂的微生物用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基选择培养基微生物产生某种代谢产物，与培养基中的微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化明显的特征变化在培养基中加入相应的特殊营养物质或化在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长利于所需微生物的生长选择培养基选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌
6、、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞分离杂交瘤细胞选择培养基选择培养基（耐高浓度食盐的金黄色葡（耐高浓度食盐的金黄色葡萄球菌萄球菌）大肠杆菌呈 黑色中心,有金
7、属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝培养基伊红美蓝培养基上典型特征上典型特征深紫色，并带有金属光泽深紫色，并带有金属光泽 鉴别培养基：鉴别培养基：鉴定所培养生物的类型鉴定所培养生物的类型按成分不同划分按成分不同划分天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基化学成分不恒定的天然有机物化学成分不恒定的天然有机物牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁琼脂培养基。用于工业琼脂培养基。用于工业生产生产化学成分完全了解的物质配化学成分完全了解的物质配制而成的培养基制而成的培养基高氏高氏1 1号培养基、查氏培养号培养基、查氏培养基。用于基。用于分类和鉴定分类和鉴定分类分类根据细胞生存所需物质的种类
8、和数量，用人工方法模拟合成的。根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。一些辅助物质。优点：优点：标准化生产，组分和含量相对固定标准化生产，组分和含量相对固定;成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基合成培养基:天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：优点：营养成分丰富，培养效果好营养
9、成分丰富，培养效果好缺点：缺点：来源受限来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的 分析分析;易发生支原体污染易发生支原体污染;天然培养基：天然培养基：血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞
10、生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。一定量的天然培养基（如血清）。标准标准培养基类型培养基类型配制特点配制特点主要应用主要应用物理性质物理性质固体培养基固体培养基加入琼脂较多加入琼脂较多菌种菌种分离分离,鉴定鉴定,计数计数半固体培养基半固体培养基加入琼脂较少加入琼脂较少菌种保存菌种保存液体培养基液体培养基不加入琼脂不加入琼脂工业工业生产，生产，连续连续培养培养化学组成化学组成合成培养基合成培养基由已知成由已知成分配制分配制而成而成，培养基培养基成分明确成分明确菌种分类、鉴定菌种分类、鉴定天然培养基天然培养基由天然成分配制而成由天然成分配制而成，培养基培养基成分不明确成分不明确工业
11、生产，工业生产，降低降低成本成本目的用途目的用途鉴别培养基鉴别培养基添加某种指示剂或添加某种指示剂或化学化学药剂药剂菌种的鉴别菌种的鉴别选择培养基选择培养基添加（或缺少）某种添加（或缺少）某种化化学成学成分分菌种的分离菌种的分离2、培养基配制原则：、培养基配制原则：（1）目的要明确：）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：要适宜：各种微生
12、物适宜生长的各种微生物适宜生长的pH范围不同。范围不同。细菌细菌pH为：为：6.5-7.5；放线菌放线菌pH为：为：7.5-8.5；真菌真菌pH为：为：5.0-6.0。3、培养基的营养构成、培养基的营养构成不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源水、碳源、氮源、无机盐、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物等营养物质，另外还需要满足微生物生长对生长对pH、特殊营养物质以及氧气、二氧化碳、特殊营养物质以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。、渗透压等的要求。,例如例如:生长因子生长因子(即细菌生即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物长必需，而自身不能合成的化合物,如如培养乳
13、酸培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素杆菌需要在培养基中添加维生素)碳源、氮源、生长因子的比较碳源、氮源、生长因子的比较来来 源源常用原料常用原料功功 能能碳源碳源CO2、NaHCO3、糖、糖类、脂肪酸、花生粉类、脂肪酸、花生粉饼、石油等饼、石油等糖类糖类构成细胞物质和一构成细胞物质和一些代谢产物，有些些代谢产物，有些还是异养生物的主还是异养生物的主要能源物质要能源物质氮源氮源N2、NH3、铵盐、硝、铵盐、硝酸盐、尿素、核酸、酸盐、尿素、核酸、牛肉膏和蛋白胨等牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝铵盐、硝酸盐等酸盐等合成蛋白质、核酸合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产以及含氮的代谢产物物生长因子生长因子维生素、
14、氨基酸、碱维生素、氨基酸、碱基基酶、核酸等的组成酶、核酸等的组成成分。参与酶促反成分。参与酶促反应应n根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。两大营养类型。n自养菌（自养菌（autotrophautotroph）n异养菌（异养菌（heterotrophheterotroph）腐生菌、腐生菌、寄生菌（大部分病原菌）寄生菌（大部分病原菌）n 获得纯净培养物的关键是什么？获得纯净培养物的关键是什么？不是。比如不是。比如病毒只能寄生在活细胞内，目前常用于培病毒只能寄生在活细胞内，目前常用于培养动物病毒的是活鸡胚。养动物病毒的是活鸡胚。所有微
15、生物都可以用培养基进行培养吗？所有微生物都可以用培养基进行培养吗？防止外来杂菌的入侵。防止外来杂菌的入侵。无菌技术无菌技术思考思考（二）无菌技术（二）无菌技术 无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。成功地培养微生物的关键。无菌技术包括：无菌技术包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在）为避免周围
16、微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附酒精灯火焰附近旁进行；近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。（二）（二）无菌无菌技术技术避免杂菌污染的四个方面：避免杂菌污染的四个方面：01实验实验操作的空间、操作者的衣着和手操作的空间、操作者的衣着和手超净工作台超净工作台清洁清洁消毒消毒 无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。成功培养微生物的关键。成功培养微生物的关键。02微生物微生物培养的器皿、接种用具和培养基等培养的器皿、接种用具和培养基等灭菌灭菌接种环接种环
17、接种针接种针涂布器涂布器03实验实验操作应在酒精灯火焰附近进行操作应在酒精灯火焰附近进行04避免避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触消毒消毒指使用指使用较为温和较为温和的物理或化学方法仅杀死物体的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部表面或内部一部分一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。某种细菌的芽孢某种细菌的芽孢毛霉的孢子毛霉的孢子休眠体休眠体繁殖体繁殖体 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体休眠体，叫做，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低
18、温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸例如，有的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。成一个细菌。消毒消毒煮沸消毒法煮沸消毒法在在100，煮沸煮沸56min巴氏消毒法巴氏消毒法7075煮煮30min或或80煮煮15min化学药剂消毒法化学药剂消毒法紫外线消毒法紫外线消毒法灭菌灭菌指使用指使用强烈的强烈的理化因素杀
19、死物体内外理化因素杀死物体内外所有的所有的微生物，包括芽孢和孢子。微生物，包括芽孢和孢子。灼烧灭菌灼烧灭菌接种工具接种工具（接种环、接种针（接种环、接种针或其他金属工具）或其他金属工具）160170加热1-2h干热灭菌干热灭菌玻璃器皿（吸管、培玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等养皿）和金属用具等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌100kPa,温度为121，维持1530min培养皿及容器的灭菌培养皿及容器的灭菌1、煮沸消毒法、煮沸消毒法:100煮沸煮沸5-6min2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 下煮下煮30min或或 80 下煮下煮15min3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%酒精、
20、新洁尔灭等进行皮肤消毒酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源4、紫外线消毒：、紫外线消毒：P16附录五附录五(1)消毒的方法：消毒的方法：1、灼烧灭菌、灼烧灭菌2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 下加热下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持下维持 15-30min.(2)灭菌的方法：灭菌的方法：最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分
21、不被破坏。坏。有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。物的污染而设计的。消毒消毒灭菌灭
22、菌概念概念指使用指使用较为温和较为温和的物理或化的物理或化学方法仅杀死学方法仅杀死物体表面或内物体表面或内部一部分部一部分对人体有害的微生对人体有害的微生物物(不包括芽孢和孢子不包括芽孢和孢子)指使用指使用强烈强烈的理化因素杀死的理化因素杀死物体内物体内外所有外所有的微生物，包括芽孢和孢子的微生物，包括芽孢和孢子常用方法常用方法煮沸消毒法煮沸消毒法、巴氏消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消化学药剂消毒法、紫外线消毒法毒法灼烧消毒法、干热灭菌、高压蒸汽灼烧消毒法、干热灭菌、高压蒸汽灭菌灭菌适用对象适用对象操作空间、液体、双手等操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿，培养接种环、接
23、种针、玻璃器皿，培养基等基等1、器具的灭菌、器具的灭菌2、培养基的配制、培养基的配制3、培养基的灭菌、培养基的灭菌4、倒平板、倒平板5、微生物接种、微生物接种6、恒温箱中培养、恒温箱中培养7、菌种的保存、菌种的保存1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择 合适的方法。合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、
24、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。3、为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?营养成分不被破坏（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）二二、实验操作、实验操作1计算、称量计算、称量2溶化溶化3调调pH：pH7.64过滤：这一步可以省去。过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而
25、引起污染。分装三角或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞加塞7包扎包扎8灭菌灭菌:将将50ml培养基培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为温度为121，灭菌，灭菌 1530min。将将培养皿培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160 170 下灭菌下灭菌2h。9倒平板倒平板:待培养基冷却到待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附
26、近倒平板。（倒平板操作左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作 见课本）见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10无菌检查：无菌检查：将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37的温室中培养的温室中培养2448小时，以检查灭菌小时，以检查灭菌 是否彻底。是否彻底。3.倒平板操作倒平板操作右手火焰大于瓶口的缝隙倒过来右手右手火焰火焰大大于瓶口的缝隙倒过来倒过来培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0 g 源、源、磷酸盐和维生素蛋白胨10.0 g 源、源和维生素NaCl 5.0 g_琼脂20.0 g/蒸馏水定容至1 000 mL氢元素、氧元素1.牛肉膏蛋白胨
27、培养基的成分及各成分提供的营养碳氮碳氮基础梳理 夯实教材基础无机盐2.制备步骤计算 依据牛肉膏蛋白胨培养基 的比例，计算配制100 mL的培养基时，各种成分的_称量 可用称量纸称取，牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要 ，称后及时 瓶盖溶化 牛肉膏和称量纸水 取出称量纸加 和 加 至完全熔化(注意：不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂)补加蒸馏水至_配方用量迅速盖上蛋白胨氯化钠琼脂100 mL灭菌 培养基用 法灭菌(压力100 kPa、温度121、时间1530 min)；培养皿用 法灭菌(温度160170，时间2 h)倒平板 待培养基冷却至 左右时，在 附近倒平板高压蒸汽灭菌干热灭菌5
28、0酒精灯火焰制备固体培养基的一般步骤可简记为：算、称、溶、灭、倒，即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中，减少误差。制备固体培养基的一般步骤可简记为：算、称、溶、灭、倒，即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒加琼脂的目的是什么?作为凝固剂制备固体培养基的一般步骤可简记为：算、称、溶、灭、倒，即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞，在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中 杂菌污染的作用。制备固体培养基的一般步骤
29、可简记为：算、称、溶、灭、倒，即计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。特别提醒培养皿能否用高压蒸汽灭菌？不能，因为培养皿要保持干燥，应该用 干热灭菌。1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板原因？你用左右时，才能用来倒平板原因？你用什么办法来估计培养基的温度？什么办法来估计培养基的温度？答：琼脂是一种多糖，在答：琼脂是一种多糖，在98 以上熔化，在以上熔化，在44 以下凝固，倒平板以下凝固，倒平板时高于时高于50 则会烫手，低于则会烫手，低于50 时若不及时操作，琼脂会凝固。可时若不及时操作，琼脂会凝固。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚
30、刚不烫以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养
31、基表面的湿答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。不要用这个平板培养微生物。5.怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？提示未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染
32、。（二）、纯化大肠杆菌（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法和稀释涂布平板法1.平板划线法平板划线法原理：原理：通过通过接种环接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后,可以分离到单个菌落。可以分离到单个菌落。平板划线法操作：火焰接种环烧红火焰旁火焰已冷却的接种环一条缝隙迅速伸入平板划破一末二最后一区的划线倒置1 1.线条不重叠线条不重叠 2 2-3.从上次的末端开始，交叉从上次的末端开始，交叉23条线条线3 4 4
33、.最后的划线不能与第一区相连。最后的划线不能与第一区相连。（3）平板划线法注意事项）平板划线法注意事项接种环接种环只蘸一次只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。划线多次。划线首尾不能相接。划线首尾不能相接。划线后，培养皿倒置培养划线后，培养皿倒置培养1224h。平板划线操作中三种灼烧的目的不同特别提醒项目目的沾取菌液前灼烧避免接种环上可能存在的微生物污染菌种每次划线前灼烧杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端划线操作结束后灼烧及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者1.为什么在操作的
34、第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的答：操作的第一步灼烧第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；污染培养物；每次划线前灼烧每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种
35、的数目次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端 开始划线？开始划线？答：划线
36、后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布平板法原理：将菌液进行一系列的 ，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。操作：在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成 ，从而能在培养基表面形成单个菌落。梯度稀释单个细胞A.系列稀释操作a.编号为101106试管中分别盛有9 mL水。b.用移液管
37、吸取 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。1提醒：移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。微量微量 移移液器液器B.涂布平板操作涂布器消毒：将涂布器浸在盛有 的烧杯中取菌液：取少量菌液(不超过0.1 mL)，滴加到 表面涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，810 s涂布平板：用涂布器将 均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动 培养皿，使菌液分布均匀酒精培养基冷却菌液提醒：取出涂布器时，应避免酒精滴落；燃烧后的涂布器，应冷却后再浸入酒精。稀释涂布
38、平板法：稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1个涂布蒸馏水作空白对照个涂布蒸馏水作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释103倍倍稀稀释释104倍倍稀稀释释105倍倍关键点拨两种接种方法的比较项目项目平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法用途用途一般用于菌种的纯化一般用于菌种的纯化一般用于筛选菌株一般用于筛选菌株优点优点可对混合菌进行分离可对混合菌进行分离可以计数可以计数缺点缺点不能计数不能计数操作复杂，若平板不干燥，则效果不操作复杂，若平板不干燥，则效果不好；若菌液浓度大，则长不出单菌落好
39、；若菌液浓度大，则长不出单菌落培养培养结果结果 1.涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。2.平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？提示(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上
40、灼烧。(2)划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。(3)接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。(4)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划线后及时盖上皿盖。3.在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？4.稀释涂布平板操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？提示划线末端含有的细菌数目较少，每次从上一次划线的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。提示培养未接种培养基的作用是对照
41、。未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。(1)培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的后无菌落生长，说明培养基的 制备是成功的，否则需要重新制备。制备是成功的，否则需要重新制备。(2)接种操作是否符合无菌要求接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌 菌落的特点，则说明接种操作是符合
42、要求的；如果培养基上出现了其他菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌 落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。(3)是否进行了及时细致的观察与记录是否进行了及时细致的观察与记录 培养培养12 h与与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的 同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要 是培养学生良好的科学态度与习惯。是培养
43、学生良好的科学态度与习惯。三三、课题成果评价、课题成果评价 1、临时保藏法、临时保藏法 对象：对象：温度：温度：缺点：缺点：2、甘油管藏法：、甘油管藏法：对象：对象：温度：温度：频繁使用的菌种频繁使用的菌种 4（冰箱）（冰箱）容易被污染或产生变异容易被污染或产生变异 长期保存的菌种长期保存的菌种-20（冷冻箱）（冷冻箱）四、课题延伸四、课题延伸甘油冷冻管藏（甘油冷冻管藏（-20）固体培养基斜面保藏（固体培养基斜面保藏（-4）临时保藏临时保藏长期保存长期保存大肠杆菌分离后保存大肠杆菌分离后保存菌种保藏方法的比较项目临时保藏甘油管藏适用范围 的菌种 的菌种培养基 培养基 培养基保藏温度4 20 特
44、点需不定期转移菌种；保存时间短；菌种易被污染或产生变异保存时间长；菌种安全性和稳定性高具体方法接种到 培养基上在合适的温度下培养长成菌落 冰箱中保藏甘油瓶中装入甘油后 将菌液转移至甘油瓶中混匀后冷冻箱中保存频繁使用长期保存固体斜面液体固体斜面4 灭菌本课题知识小结本课题知识小结:【典例解析典例解析】例例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量解析：解析：不同
45、的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；种类繁多，功能也多样。如
46、二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于则只能提供无机盐。对于D选项，选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。可为硝化细菌提供能量和氮源。D例例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（）A.防止杂菌污染防止杂菌污染 B.消灭杂菌消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前B解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。解析
47、：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生
48、物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml例例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：右表是某微生物培养基成分，请据此回答：(1)右表培养基可培养的微生物类型右表培养基可培养的微生物类型 是是_。(2)若不慎将过量若不
49、慎将过量NaCl加入培养基中。如不想加入培养基中。如不想 浪费此培养基，可再加入浪费此培养基，可再加入_。自养型微生物自养型微生物 含碳有机物含碳有机物(3)若除去成分，加入若除去成分，加入(CH2O)，该培养基，该培养基 可用于培养可用于培养 。(4)表中营养成分共有表中营养成分共有 类。类。(5)不论何种培养基，在各种成分都溶化后不论何种培养基，在各种成分都溶化后 分装前，要进行的是分装前，要进行的是 。(6)右表中各成分重量确定的原则是右表中各成分重量确定的原则是 。(7)若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是_。固氮微生物固氮微生物 3 调整调整pH 依微生物的生长需要确定依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂）
