1、专题 3、5 植物的组织培养技术、DNA 和蛋白质技术考纲内容能力要求命题分析植物的组织培养实验：(1)蛋白质的提取和分离(2)PCR 技术的基本操作和应用(3)DNA 的粗提取与鉴定实验与探究能力实验与探究能力实验与探究能力本专题内容与必修内容关联度大，多分拆于必修的相关内容中，多以选择题形式出现考点植物的组织培养技术1.菊花的组织培养：(1)理论基础：植物细胞的_。(2)基本过程：全能性接种移栽(3)实验操作步骤：制备 MS 培养基外植体消毒_培养_栽培。2.月季的花药培养：(1)理论基础：花粉具有_。(2)花粉发育过程：_、_、_等阶段。全能性四分体时期单核期双核期(3)产生花粉植株的两
2、种途径：3.植物组织培养所用的培养基为固体培养基。【考点对应练】1.(2013 年重庆)某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材消毒愈伤组织培养出芽生根移栽”。下列有关叙述中，错误的是()A.消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害B.在愈伤组织培培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞C.出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控D.生根时，培养基通常应含 萘乙酸等生长素类调节剂解析消毒剂的使用既要杀死表面微生物，又要防止伤害组织细胞，影响组织培养，A 项正确；植物细胞融合是指经纤维素酶和果胶酶处理后得到的原生质体的诱导融合，带有细胞壁的愈
3、伤组织细胞不能诱导融合形成染色体加倍的细胞，B 项错误；出芽和生根都是细胞再分化的结果，其实质是基因的选择性表达，C 项正确；萘乙酸为生长素类似物，可诱导愈伤组织生根，D 项正确。答案B考点DNA 和蛋白质技术1.DNA 的粗提取与鉴定：不同0.14 mol/L(1)实验原理：DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中的溶解度_，浓度为_时其溶解度最小。DNA_溶于酒精溶液。不蓝色杂质DNA 与二苯胺在沸水浴中呈_。(2)实验步骤：选材、制备鸡血细胞液破碎细胞，获取含DNA 的滤液去除滤液中的_DNA 析出与鉴定。2.血红蛋白的提取和分离：(1)凝胶色谱法：也称分配色谱法，是根据_分离蛋白质的方法
4、。相对分子质量较小的移动速度较慢，而相对分子质量较大的无法_，移动速度较快。相对分子进入凝胶内部(2)缓冲溶液：能够抵制外界的_对溶液 pH的影响，维持 pH_。酸和碱基本不变(3)电泳：带电粒子在_ 的作用下发生迁移的过程。电场质量的大小(4)实验操作：凝胶色谱柱样品处理及粗分离：红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液透析。凝胶色谱柱操作：凝胶色谱柱的制作_样品的加入和洗脱。纯度鉴定：用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。的装填3.多聚酶链式反应扩增 DNA 片段：(1)PCR 原理：在一定的缓冲溶液中提供_、分别与两条模板链结合的两种引物、_、_，同时控制温度使 DNA 复制在_反复进行。DN
5、A 模板四种脱氧核苷酸(2)PCR 的反应过程：变性_延伸。耐热的 DNA 聚合酶体外复性【考点对应练】2.(2013 年江苏)某同学用洋葱进行 DNA 粗提取和鉴定实验，操作错误的是()A.加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨B.用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的 DNAC.加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌D.加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热解析加入洗涤剂后研磨动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作，A 错误；利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的 DNA 与蛋白质分开，起到纯化的作用，B 正确；加入酒精溶液，静置溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的 DNA，用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌
6、，防止断裂，C 正确；用二苯胺鉴定 DNA 需要水浴加热，D 正确。答案A3.(2013 年江苏双选)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是()A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列B.用 PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列C.PCR 体系中一定要添加从受体细胞中提取的 DNA 聚合酶D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞解析设计引物时应当与表达载体两端的序列进行互补配对，A 错误；PCR 法扩增目的基因只需要知道基因两端的序列设计合适的引
7、物即可，而不必知道其全部序列，B 正确；PCR中应用耐高温的 DNA 聚合酶，C 错误；根据目的基因的编码产物选择合适的受体细胞，以有利于基因的表达，D 正确。答案BD一、植物的组织培养1.影响植物组织培养的因素：(1)内部因素：材料的选取。(2)外部因素：营养成分的种类及配比；植物激素的用量及使用顺序；pH、温度、光照等。2.获得成功的关键：(1)植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗逆性差，对培养条件要求较高。(2)培养材料一旦被微生物污染，就会导致实验失败。原因是微生物增殖快，生长迅速，消耗养分多，并产生代谢废物毒害培养材料。(3)无菌技术主要包括对操作空间、实验用具、实验材料以及操作者
8、的消毒或灭菌。使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先使用细胞分裂素，后使用生长素细胞既分裂又分化同时使用分化频率提高3.植物激素在组织培养过程中的重要作用：(1)使用顺序不同，结果不同：(2)用量比值不同(生长素比细胞分裂素)，结果也不同：高：利于根的分化、抑制芽的形成。低：利于芽的分化、抑制根的形成。适中：促进愈伤组织的形成。4.实验操作中应注意的几个问题：(1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝；月季花药的培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。(2)外植体消毒：所用的消毒剂是体积分数为 70%的
9、酒精和质量分数为 0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。(3)培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照，月季花药的培养不需光照，而在后期均需光照。单倍体育种与花药组织培养的区别花药组织培养形成的是高度不育的单倍体植株；而单倍体育种则需要把对花药进行组织培养得到的单倍体植株诱导为染色体数目正常的纯合植株，以使其有正常的繁殖能力，再从中挑选出具有优良性状的个体。【典例】植物微型繁殖技术属于植物组织培养的范畴。请回答下列问题。(1)该技术可以保持品种的_，繁殖种苗的速度_。离体的叶肉细胞在适宜的条件下培养，最终能够形成完整的植株，说明该叶肉细胞具有该植物的全部_。(2)把试管苗转接到新的培养基
10、上时，需要在超净工作台上进行，其原因是避免_的污染。(3)微型繁殖过程中，适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗_，而与_配比适宜时可促进芽的增殖。若要抑制试管苗的生长，促使愈伤组织产生和生长，需要使用的生长调节剂是_(填“脱落酸”或“2,4D”)。(4)将某植物试管苗培养在含不同浓度蔗糖的培养基上一段时间后，单株鲜重和光合作用强度的变化如下图所示。据图分析，随着培养基中蔗糖浓度的增加，光合作用强度的变化趋势是_，单株鲜重的变化趋势是_。据图判断，培养基中不含蔗糖时，试管苗光合作用产生的有机物的量_(填“能”或“不能”)满足自身最佳生长的需要。(5)据上图推测，若要在诱导试管苗生根的过程中提高其
11、光合作用能力，应_(填“降低”或“增加”)培养基中蔗糖浓度，以便提高试管苗的自养能力。解析植物组织培养技术是利用植物细胞全能性的原理进行的，是植物细胞工程的基础。操作过程中应注意无菌操作，避免杂菌污染，因为培养过程中使用的培养基营养物质丰富；适宜浓度的生长素可以诱导试管苗生根，而如果要促进愈伤组织形成芽，则需要与细胞分裂素配比；促进愈伤组织产生和生长，应使用 2,4D。快遗传信息答案(1)遗传性状(2)微生物(3)生根细胞分裂素2,4D先增加后下降不能(4)逐渐减弱(5)降低【举一反三 1】将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是()
12、解析虽然培养基中没有激素，但幼苗叶片本身可以产生生长素，促进生根；而细胞分裂素的产生部位在根尖，所以细胞分裂素不能产生，所以植物能够在一定时间后长出少量的根而没有长出新芽。答案B二、DNA 的粗提取与鉴定1.实验原理：(1)DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中的溶解度不同，其变化曲线如下图所示：(2)DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的其他某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取含杂质较少的 DNA。步骤具体措施分析选材、制备鸡血细胞液鸡血柠檬酸钠用离心机离心，再放冰箱内静置鸡血红细胞、白细胞都具有细胞核，含大量 DNA；柠檬酸钠(抗凝剂)使血液分层，血细胞处于底部提取血细胞核物质鸡血细胞液蒸馏水
13、，快速沿一个方向搅拌 5min纱布过滤血细胞吸水涨破，快速搅拌加速血细胞破裂过滤得到含染色质的滤液，滤出细胞膜、细胞器等破碎结构溶解 DNA滤液2 mol/L 的NaCl 溶液 40 mL(搅拌)纱布过滤不溶杂质高盐溶液溶解 DNA，去除不溶于高盐溶液的杂质析出含 DNA的黏稠物溶液蒸馏水，轻轻搅拌，析出丝状物(直至不再增加为止)NaCl 溶液相当于被稀释到 0.14mol/L，这一浓度下 DNA 的溶解度最低，所以 DNA 析出2.实验流程：步骤具体措施分析过滤多层纱布过滤得到含 DNA 的黏稠物DNA 黏稠物再溶解2 mol/L NaCl 溶液20 mL上述黏稠物溶解高盐溶液溶解 DNA，
14、再次去除不溶于高盐溶液的杂质过滤用两层纱布过滤滤液中含 DNA，去除不溶杂质提取含杂质较少的 DNA上述滤液冷却的95%酒精 50 mL析出 DNA，去除溶于 95%冷酒精的杂质DNA 鉴定丝状物0.015 mol/LNaCl 溶液 5 mL二苯胺(现配)4 mL，沸水浴5 min，对照组不加丝状物试管 1 和试管 2 的自变量是有无丝状物，因变量为有无浅蓝色出现0.015 mol/L NaCl 溶液溶解 DNA(续表)3.实验关键：(1)取材不能用哺乳动物的血细胞，原因是其成熟红细胞无细胞核。(2)获取 DNA 时要向鸡血细胞液中加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，把核内物质释放出来。
15、(3)实验中有 6 次搅拌，除最后一次搅拌外，前 5 次搅拌均要朝一个方向。并且在析出 DNA、DNA 再溶解和提取 DNA 中，各步骤搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止 DNA分子断裂。(4)两次加蒸馏水的目的：第一次加蒸馏水是为了使血细胞吸水膨胀破裂(注：植物细胞是用洗涤剂溶解细胞膜)。第二次加蒸馏水是为了稀释 NaCl 溶液，析出 DNA。(5)三个浓度的 NaCl 溶液：2 mol/L NaCl 溶液：为了溶解 DNA，使 DNA 与蛋白质分离。0.14 mol/L NaCl 溶液：为了析出 DNA。0.015 mol/L NaCl 溶液：为了溶解 DNA。(6)DNA 易吸附
16、在玻璃容器上，所以实验中最好使用塑料烧杯、试管、容器，以减少 DNA 的损失。4.去除滤液中的杂质的其他方案：(1)方案一：用嫩肉粉(蛋白酶)，它能水解蛋白质，但对DNA没有影响。(2)方案二：加热至 6075，大多数蛋白质不能忍受 6075 的高温而变性，但 DNA 不变性。【典例】下列关于 DNA 粗提取与鉴定的说法正确的是()A.析出 DNA 时要缓慢地加蒸馏水，当析出黏稠物时即不再加水B.在探究洗涤剂对植物细胞 DNA 提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐C.提取的 DNA 溶解后加入二苯胺试剂即可染成蓝色D.将含有 DNA 的滤液放在 6075 的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白
17、质杂质解析DNA 在 0.14 mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度最低而析出，方法是用蒸馏水进行稀释，直至 DNA 析出量不再增加为止；探究洗涤剂对植物细胞 DNA 提取的影响实验中，自变量是洗涤剂；提取的 DNA 溶解后加入二苯胺试剂后要进行加热和分设对照组。答案D【举一反三 2】在 DNA 粗提取过程中，先后两次向烧杯中加入蒸馏水的作用分别是()A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低 NaCl 浓度使 DNA 析出C.使血细胞破裂、增大 DNA 溶解量D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的 DNA解析第一次是使血细胞破裂；第二次是降低 NaCl 浓度使DNA 析出。答案B三、蛋白质的
18、提取和分离(以血红蛋白的提取和分离为例)1.样品处理：(1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白，分离时采用低速短时间离心，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯(溶解细胞膜)的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。2.粗分离：(1)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离下层的红色透明液体。(2)透析：取 1 mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300 mL、物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液中，透析 12 h，去除样品中分子量较小的杂质。分离的种类相
19、对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大分子物质大大于凝胶颗粒空隙垂直向下的运动较快较短先小分子物质小小于凝胶颗粒空隙垂直向下、无规则扩散的运动较慢较长后3.纯化：利用凝胶色谱柱可对血红蛋白进行纯化。凝胶色谱法分离蛋白质的原理，见下表：4.纯度鉴定：使用最多的是 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(可测定蛋白质的相对分子质量)。项目DNA 粗提取与鉴定血红蛋白的提取与分离材料选择鸡血细胞等含 DNA 丰富的生物组织哺乳动物成熟的红细胞破碎细胞方式动物细胞：吸水涨破植物细胞：洗涤剂、食盐搅拌研磨等加蒸馏水和甲苯搅拌去除杂质方式用不同浓度的 NaCl 溶液处理用酒精处理用蛋白酶处理等透析处理纯化
20、处理鉴定方式二苯胺，沸水浴SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量DNA 与血红蛋白的提取和分离过程比较【典例】下列关于 DNA 和血红蛋白的提取与分离实验的叙述中，错误的是()A.可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪红细胞中提取到 DNA和蛋白质B.用不同浓度的 NaCl 溶液反复溶解与析出 DNA 可去部分杂质C.透析法分离蛋白质的依据是利用蛋白质不能通过半透膜的特性D.进一步分离与纯化血红蛋白可用凝胶色谱法、离心法、电泳法等解析猪红细胞中没有细胞核，只能用于蛋白质的提取和分离实验中；DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同，低浓度和高浓度都可使 DNA 溶解，但在 0.14 mol/L
21、 的 NaCl 溶液中，溶解度最小，可析出 DNA，从而去除部分杂质；透析法分离蛋白质的依据是蛋白质是大分子物质，不能通过半透膜，从而去除样品中分子量较小的杂质。答案A【举一反三 3】下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是()A.是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法B.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，以致最后流出C.凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系D.一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来解析凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法，
22、凝胶是由多糖类化合物构成的，其内部有很微细的多孔网状结构，小分子蛋白质可以进入凝胶内部，路程较长，移动速度慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较短，移动速度快，因此在洗脱过程中分离。选用不同种凝胶，其网状结构不同，孔隙大小不同，可分离的分子大小不同，二者是相关的，故 C 项不正确。答案C四、PCR 反应的过程及结果1.过程：(1)变性：当温度上升到 90 以上时，双链 DNA 解聚为单链。(2)复性：系统温度下降至 50 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合。(3)延伸：当系统温度上升至 72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在 DNA 聚合酶
23、的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链。细胞内 DNA 复制PCR不同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80100 高温解旋，双链完全分开酶DNA 解旋酶、DNA 聚合酶TaqDNA 聚合酶引物RNADNA 或 RNA温度体内温和条件高温相同点需提供 DNA 复制的模板四种脱氧核苷酸作原料子链延伸的方向都是从 5端到 3端2.结果：(1)PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸。(2)两引物之间的固定长度的 DNA 序列呈指数扩增。3.细胞内 DNA 复制与 PCR 技术的比较：【典例】多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增 DNA片段的技术。PCR 过程一
24、般经历下述三十多次循环：使模板DNA 变性、解链复性(引物与 DNA 模板链结合)引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关 PCR 过程的叙述中，不正确的是()A.变性过程中破坏的是 DNA 分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B.复性过程中引物与 DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的C.延伸过程中需要 DNA 聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D.PCR 与细胞内 DNA 复制相比，所需要酶的最适温度较高解析变性的目的是破坏 DNA 分子内碱基对之间的氢键，让 DNA 解链，在体内可在解旋酶的作用下进行，体外则是高温；引物是脱氧核苷酸小片段，在复性时，能与 DNA 模板链结
25、合；延伸过程中需要 DNA 聚合酶、ATP、四种脱氧核糖核苷酸；PCR 是体外的 DNA 复制，需要高温才能让 DNA 解旋，所以要求酶的最适温度较高。答案C【举一反三 4】PCR 利用了 DNA 热变性的原理，PCR 仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对 PCR 过程中“温度的控制”的说法错误的是()A.酶促反应需要较高的温度，是为了确保模板是单链B.延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度C.所使用的 DNA 聚合酶具有耐高温的能力D.所使用的 DNA 解旋酶具有耐高温的能力解析PCR 是体外 DNA 扩增，DNA 双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双链螺旋结构解体，双链分开，在复性前，在耐高温的 DNA 聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的 DNA，因此延伸的温度要大于复性温度小于变性温度。答案D
