1、第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得对于高等真核生物而言，对于高等真核生物而言，基因组基因组DNADNA十分庞大十分庞大,基因可达基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列编码序列，还有，还有非编码序列非编码序列及及调控序列调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。外，绝大多数基因难以直接分离得
2、到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是往往是未知基因未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。基因。生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的
3、获得目的基因的获得基因文库基因文库(gene library)概念概念又称又称DNA文库，是指某个生物的基因组文库，是指某个生物的基因组DNA或或cDNA片段与适当片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落得到大量的阳性菌落(或噬菌体或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。物的基因文库。按外源按外源DNA片段的来源分基因文库分为：片段的来源分基因文库分为：基因组基因组DNA文库文库从特定组织提取的染色体基因组从特定组织提取的染色体基因组DNA
4、cDNA文库文库mRNA反转录成的反转录成的cDNA拷贝拷贝基因文库由基因文库由外源外源DNA片段片段、载体载体和和宿主宿主组成。组成。生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(一一)基因组基因组DNA文库的类型文库的类型 根据所选用的载体可以分为：根据所选用的载体可以分为：质粒文库质粒文库噬菌体文库噬菌体文库粘粒文库粘粒文库人工染色体文库人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）载体能够容载的载体能够容载的DNADNA片断大小片断大小直接
5、影响到构建完整的基因文库所直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。需要的重组子的数目。载体系列：载体系列：容量为容量为 24 kp cosmid载体：载体：容量为容量为 50 kb YAC：容量为容量为 1 Mb BAC:容量为容量为 300 kb生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建B a m H IM b o IO HPO HH O脱 磷 酸 化重 组 D N AT 4 连 接 酶转 化 E.c o l i基 因 组 文 库总 D N AH i n d I I IB a m H IS a l IE c o R IP s t IS c a IT cA
6、 m pRRp B R 3 2 2(4.3 6 k b)O r iH i n d I I IE c o R IP s t IS c a IA m pRO r iS a l I 用质粒载体用质粒载体构建基因组文库构建基因组文库的流程的流程该法简单、快该法简单、快速、易于操作，但速、易于操作，但仅适合一些低等真仅适合一些低等真核生物和原核生物核生物和原核生物。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用用噬菌体载体构建基因组文库的流程噬菌体载体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用用黏粒黏粒载体构建基因组文库的流程载
7、体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(二二)基因组基因组DNA文库的质量标准文库的质量标准一个理想的基因组一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大
8、，以减轻筛选工作的压力。重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力。载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序。克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因组基因组DNA文库构建的程序文库构建的程序 1.1.载体载体DNADNA的制备；的制备；2.2.高纯
9、度大相对分子质量基因组高纯度大相对分子质量基因组DNADNA的提取和大片段的的提取和大片段的制备；制备；3.3.高纯度大相对分子质量基因组高纯度大相对分子质量基因组DNADNA的部分酶切与脉冲的部分酶切与脉冲电泳分级分离；电泳分级分离；4.4.载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；5.5.重组克隆的挑选和保存。重组克隆的挑选和保存。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因组基因组DNADNA文库构建的程序文库构建的程序1载体载体DNA片段的制备片段的制备 DNA分离纯化分离纯化限制酶切限制酶切 脱磷酸化反应
10、脱磷酸化反应2供体供体DNA片段的制备片段的制备总总DNA分离纯化分离纯化物理切割法物理切割法超声波（超声波（300bp）或）或机械搅拌（机械搅拌（8kb）或酶切法或酶切法（内切酶（内切酶Sau3A进行局部消进行局部消化。可得到化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。）分离特定大小分离特定大小DNA片段片段 超声波超声波300bp，剧烈搅拌：，剧烈搅拌：8Kb 部分酶切部分酶切 完全酶切完全酶切 酶法分离特定大小分离特定大小DNADNA片段片段生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建DNADNA的不完全酶切的不完全酶切目的片段低熔点琼脂糖回收目的片段低熔点
11、琼脂糖回收生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因组基因组DNADNA文库构建的程序文库构建的程序3.3.载体与基因组载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。（1）粘性末端直接连接粘性末端直接连接：载体与外源：载体与外源DNA大片段的两个末端都有大片段的两个末端都有相同的粘性末端相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。（2）人工接头法（）人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。接上人工接头接上人工
12、接头粘性末端粘性末端各种酶的接头可以向公司定做或购买。各种酶的接头可以向公司定做或购买。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因组基因组DNADNA文库构建的程序文库构建的程序3.3.载体与基因组载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接（3）同聚物加尾）同聚物加尾粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因组基因组DNADNA文库构建的程序文库构建的程序4.重组重组DNA转化受体细胞转化受体细胞（1）根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞）根据克隆载体的性质选择合适的
13、受体细胞常见的宿主细胞：常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与型菌株，可与pUC编码的编码的 半乳糖苷酶氨基端实现半乳糖苷酶氨基端实现 互互补。补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬
14、菌体启动子质粒载体启动子质粒载体的宿主菌的宿主菌生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(四四)基因组文库的大小基因组文库的大小理论值理论值:基因组文库的克隆数目基因组基因组文库的克隆数目基因组DNA总长总长/DNA插入插入片段的平均长度。片段的平均长度。例如：例如：细菌基因组细菌基因组DNA总长度总长度=3 106kb 酶切后的酶切后的DNA片段平均长度片段平均长度=15kb 基因组文库的克隆数基因组文库的克隆数=3 106kb/15kb=2 105个个克隆克隆生命科学学院生命科学学院一、基因
15、组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(四四)基因组文库的大小基因组文库的大小（必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任（必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何碱基序列。）何碱基序列。）经验值：经验值：N基因组文库克隆总数基因组文库克隆总数 P在基因组文库中目的基因在基因组文库中目的基因DNA片段的出现概率片段的出现概率f插入片段大小与基因组插入片段大小与基因组DNA大小比值大小比值N =Ln(1 P)Ln(1 f)生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建 ln(1-0.99)ln1-(2104/4.6106)Nhuman=6.9 105 ln(1
16、-0.99)ln1-(2 104/3 109)这个例子说明用质粒载体（插入片断这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。需要更大承载能力的载体。N E.coli=1.1 103For example:期望值为期望值为0.99，插入片断为，插入片断为20kb的的 E.coli(4.6106 bp)和和 human(3109 bp)基因组的克隆数的计算基因组的克隆数的计算生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建克
17、隆片段克隆片段平均大小平均大小（bp）基因组大小基因组大小/bp2106（细菌）（细菌）2107（真菌）（真菌）2109（动物）（动物）理论克理论克隆数隆数实际克隆实际克隆数数理论克隆理论克隆数数实际克隆数实际克隆数理论克隆数理论克隆数实际克隆数实际克隆数5103400183140001841860000027631101010320091920009208300000138155020103100458100046031500006907744010350278500230075000345 386基因组文库应具有的克隆子数基因组文库应具有的克隆子数生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因
18、组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文库的保存文库的保存1、影印膜滤保存法影印膜滤保存法生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文库的保存文库的保存2.液体培养基中扩增保存液体培养基中扩增保存方法：从平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生方法：从平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物合的细菌生长数代后，其培养物于于-70oC储存（加终浓度为储存（加终浓度为25%的甘油）。的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列
19、过多或过少。定的序列过多或过少。生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文库的保存文库的保存3.保存单个克隆子于含有甘油的培养基中保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为终浓度为25%的甘油，于的甘油，于-70 oC或或-25 oC下保下保存。存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 真
20、核生物基因组真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质十分庞大，其复杂程度是蛋白质和和mRNA的的100倍左右，而且含有大量的重复序列。倍左右，而且含有大量的重复序列。采用采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。困难。高等生物一般具有高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都尽有时间阶段的单个细胞或个体中，都尽有15%左右的基因得左右的基因得以表达，产生约以表达
21、，产生约15000种不同的种不同的mRNA分子。可见，由分子。可见，由mRNA出发的出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。克隆简单得多。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA以以mRNA为模板逆转录出的为模板逆转录出的DNA称称cDNA。mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 3 3 5 5 5 5 反转录酶反转录酶引物引物cDNA library利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建
22、 cDNA文库的特点文库的特点（1）不含内含子序列。）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达（一般选用的载体都是表达）可以在细菌中直接表达（一般选用的载体都是表达型的）。型的）。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比）比DNA文库小的多，容易构建。文库小的多，容易构建。cDNAcDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。文库既有种属特异性，也有组织特异性。基因特异性、基因特异性、器官特异性、器官特异性、代谢或发育特异性代谢或发育特异性生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 (一一)cDNA基因文库构建的步骤基因文库构建的步骤1.1.细胞总
23、细胞总RNARNA的提取和的提取和mRNAmRNA的分离的分离2.2.第一条第一条cDNAcDNA合成合成3.3.第二条第二条cDNAcDNA合成合成4.4.双链双链cDNAcDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖繁殖生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文库构建的步骤基因文库构建的步骤1.总总RNA（total RNA）提取和）提取和mRNA的分离纯化的分离纯化提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒
24、（kit）。）。mRNA的分离纯化的分离纯化（1）原理）原理利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，将尾巴，将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文库构建的步骤基因文库构建的步骤1.cDNA第一链合成第一链合成逆转
25、录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一的第一链。链。反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 5 5 AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOligo dTOligo dT引物引物生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建降解降解mRNAmRNA模板模板用用碱处理碱处理或用或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 5 5 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAmRNAcDNA
26、cDNA第一链第一链3 3 3 3 5 5 5 5 引物引物cDNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物或或RNaseHRNaseH碱碱生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文库构建的步骤基因文库构建的步骤3.cDNA第二链合成（第二链合成（自身引导法和自身引导法和置换合成法置换合成法）剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末端一般形成一个弯回来的双链末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引链的引物。用物。用DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链第一链5
27、 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建去掉发卡结构去掉发卡结构用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有中有用的序列被切掉！）。用的序列被切掉！）。核酸酶核酸酶S1cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 5 3 生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建1 1自身引导法自身引导法生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建生命科学学院生命科学学院二、二、c
28、DNA文库构建文库构建妙用妙用RNaseH这种酶能识别这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，并，并将其降解成许多小片断。将其降解成许多小片断。小片断正好成为小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。断。DNA Pol I除去引物并修补后再使用除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一连接酶连成一整条整条DNA链。链。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建mRNAcDNA第一链第一链3 5 引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA
29、第一链第一链3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建置换合成法置换合成法生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文库构建的步骤基因文库构建的步骤4.cDNA与载体连接与转化受体细胞与载体连接与转化受体细胞同基因组文库相似同基因组文库相似生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建cDNA文库构建的特殊方法文库构建的特殊方法OkayamaBerg法法OkayamaBerg改进法改进法SMART(Switch Mechanism
30、 At the 5 end of RNA Templates)方法方法聚合酶链式反应法（聚合酶链式反应法（PCR法）法）生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建p U C 1 9S IS mPH1)S a c I2)T d T+d T T P1)P s t I2)T d T+d G T PEES mPH1)S m a I2)分离大片段1)H i n d I I I2)分离小片段退火碱解 退火 连接T d T+d C T P2)分离大片段1)H i n d I I IK l e n o w 片段+d N T PT 4 l i g a s eA M V-R T+d N T PEPH
31、T T T TG G G GC C C CT T T TT T T TG G G GC C C CC C C CA A A AA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TG G G GC C C C5 G G G GC C C CG G G GOkayama-Berg cDNA文库构建文库构建生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建1)P s t I2)T d T+d G T PS m a I退 火G G G GG G G GG G G GP o l I
32、K+d N T PT 4 D N Al i g a s eT T T TA A A AC C C CG G G GC C C CG G G GC C C CG G G GC C C CG G G GC C C CG G G GT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AA A A AA A A AC C C C碱 解(d T)1 2-1 8A M V-R T d N T PU C 1 9OkayamaBerg改进法改进法生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建cDNA Library Construction KitGG GCCCpoly
33、A LD PCR(50 ng of total RNA)PC R-Select cDN AsubtractionEnriched full-length ds cDN ASfi I digestionSfi IASfi IBleft armright armSfi IASfi IBPackagingprim er extension(1g of poly A RNA)+Fractionation&ligation intoTrip Iex2arm sTM51SM ART M ethodGGGPoly A+RN APolyA M odified oligo(dT)Prim erFirst-str
34、and synthesiscoupled w ith(dC)tailing by RTGGGpolyATem plate switchingand extension by RTGG GCCCpolyAAm plify cD NA by LD PCRH igh-quality ds cD NAcDN A libraryconstruction VirtualN orthern bolts5131C DN A libraryInTripIEx25151CCC生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建3 PCR法构建法构建cDNA文库文库生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构
35、建文库构建(二二)cDNA文库的大小文库的大小一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时所需要的克隆时所需要的克隆数目。数目。N=ln(1-p)ln(1-1n)p:文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）:某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建基因组基因组DNA文库与文库与cDNA文库的比较文库的比较生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建基因组基因组DNA文库的
36、优点文库的优点 相对于相对于cDNA文库，基因组文库的优点：文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的分子结构，没有包括基因组的间隔序列；的间隔序列；cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的的分布状态，即：高丰度分布状态，即：高丰度mRNA的的cDNA克隆，所占比例较高，分克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度离基因容易；低丰度mRNA的的cDNA克隆，所占比例较低，分离克隆，所占比例较低，分离基因困难；基因困难；从从cDNA克隆中，不能克隆到基因组克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转
37、录区段中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA文库的优点文库的优点 cDNA文库以文库以mRNA为材料，特别适用于某些为材料，特别适用于某些RNA病病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNA文库的筛选比较简单易行。文库的筛选比较简单易行。每一个每一个cDNA文库都含有一种文库都含有一种mRNA序列，这样在目序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的基因的选择中出现假阳性的概
38、率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。会含有目的基因。cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。直接应用于基因工程操作。cDNA克隆还可用于真核细胞克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能的结构和功能生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA克隆的主要的缺点克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。文
39、库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA文库虽能反映文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。序列的结构与功能方面信息。在在cDNA文库中，相应于高丰度文库中，相应于高丰度mRNA的的cDNA克隆所克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。比较困难。生命科学学院生命科学学院三、目的基因
40、的获得三、目的基因的获得基因工程或基因工程或DNADNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说
41、，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用另一类是利用PCRPCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。然后将之克隆表达。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得目的基因用途很广，主要有以下几个方面：目
42、的基因用途很广，主要有以下几个方面：研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。调控。与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。病发生的分子生物学机理及治疗对策。研究生物种系进化与相关同源性。研究生物种系进化与相关同源性。应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。（如胰岛素、干扰素等药物）。在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目
43、的基因，以改良品种，促进经济发展。良品种，促进经济发展。建立基因疗法院，选用某种正常基因建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。对某些先天性遗传疾病进行治疗。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得基因工程的目的基因工程的目的采用采用DNA重组技术从不同生物基因组中优良性状相关重组技术从不同生物基因组中优良性状相关的基因克隆，转移同一生物基因组中，培育出具有高度应的基因克隆，转移同一生物基因组中，培育出具有高度应用价值的新物种。用价值的新物种。目的基因目的基因那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定那些已被或者准备要
44、分离、改造、扩增或表达的特定基因或基因或DNADNA片段，主要指结构基因。片段，主要指结构基因。目的基因包括目的基因包括蛋白（酶）基因、抗逆性相关基因、生物药和保健品蛋白（酶）基因、抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物讲解相关的基因等。相关基因、毒物讲解相关的基因等。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成1.原核生物的基因组成原核生物的基因组成（1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有 ATG的起始密码子和的起始密码子和TAA（TAG、TGA）的终止密码子。）的终止密码子。（2）启动区：）启
45、动区：RNApol识别、结合和开始转录的一段识别、结合和开始转录的一段DNA核苷酸序列。核苷酸序列。55TTGACATTGACATATAATTATAATA/GA/G3333AACTGTAACTGTATATTAATATTAT/CT/C55-35-35序列序列-10-10序列序列识别序列识别序列PribnowPribnow框框转录起点转录起点161619bp19bp5 59bp9bp生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成1.原核生物的基因组成原核生物的基因组成生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基
46、因组成1.原核生物的基因组成原核生物的基因组成生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成1.原核生物的基因组成原核生物的基因组成（3）SD区：在起始密码子区：在起始密码子ATG上游约上游约10bp处，有一个处，有一个富含嘌呤的保守序列，其与富含嘌呤的保守序列，其与16S rRNA3端序列互补。端序列互补。SD序列与起始密码子序列与起始密码子ATG之间的距离决定了之间的距离决定了mRNA在细菌中的转录效率。在细菌中的转录效率。结构基因的组成100bp启动子区SD区转录区转录中止区ATGORFTAA、TGA、TAGSDSD序列：序列：5AGGAGG
47、U35AGGAGGU33UCCUCCA3UCCUCCA5 5 16S rRNA16S rRNA生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成1.原核生物的基因组成原核生物的基因组成（4）转录终止子和终止因子）转录终止子和终止因子转录终止子：一个基因或一个操纵子转录终止子：一个基因或一个操纵子3端，提供转录端，提供转录停止信号的停止信号的DNA核苷酸序列。核苷酸序列。终止因子：协助终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。的蛋白。-independent生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的
48、获得生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成2.真核生物基因组成真核生物基因组成（1）基因区）基因区生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成2.真核生物基因组成真核生物基因组成（1）基因区）基因区生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成2.真核生物基因组成真核生物基因组成（2）转录启动区）转录启动区mRNArDNAmDNAtDNArRNAtRNARNApoLIRNApoLIIIRNApoLIIaa35构成核糖体NmRNAproteinP1P
49、3P2P1、P2和和P3个有不同的结构特点。个有不同的结构特点。生命科学学院生命科学学院三、目的基因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成2.真核生物基因组成真核生物基因组成（2）转录启动区）转录启动区-25的的TATA box：起始双链解开，并决定转录的起始位点；起始双链解开，并决定转录的起始位点；-80的的CAAT box：可能与可能与RNApol结合有关；结合有关；-100的的GCbox：转录因子（如转录因子（如spI因子）的结合序列。因子）的结合序列。CAAT box和和GC box对转录起始效率较大的影响。对转录起始效率较大的影响。生命科学学院生命科学学院三、目的基
50、因的获得三、目的基因的获得(一一)结构基因组成结构基因组成2.真核生物基因组成真核生物基因组成（3）转录终止子：）转录终止子：对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解甚少。对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解甚少。但在高等真核生物的细胞中，但在高等真核生物的细胞中，mRNA在靠近在靠近3端区有一段端区有一段非常非常conservative sequence AAUAAA，这一序列为链，这一序列为链的切断和的切断和pol(A)化提供了某些终止信号。化提供了某些终止信号。不含不含SDSD序列，核糖体与序列，核糖体与mRNA 5mRNA 5端的帽子结构结合端的帽子结构结合生命科学学院生命科学学院
