1、 第一节第一节 天然抗原的制备天然抗原的制备一、颗粒天然抗原的制备一、颗粒天然抗原的制备二、可溶性抗原的二、可溶性抗原的制备制备一、颗粒天然抗原的制备一、颗粒天然抗原的制备 1.细菌抗原细菌抗原 2.2.血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备1.细菌抗原细菌抗原(多用液体或固体培养物多用液体或固体培养物集菌集菌后处理后处理)1)1)H H抗原抗原(鞭毛抗原，蛋白质）鞭毛抗原，蛋白质）:用有毒力的菌株，菌液用用有毒力的菌株，菌液用0.30.30.50.5甲醛处理甲醛处理 2)2)O O抗原（菌体抗原，细胞壁多糖抗原）抗原（菌体抗原，细胞壁多糖抗原）:需要需要1001
2、00加温加温2 2 2.5h2.5h后应用。后应用。3)3)ViVi抗原（伤寒沙门菌的表面抗原，糖脂）抗原（伤寒沙门菌的表面抗原，糖脂）：应在杀菌后再加：应在杀菌后再加0.50.51 1氯化钙溶液。氯化钙溶液。有些细胞膜成分，如组织细胞膜、血细胞膜经打碎后亦可有些细胞膜成分，如组织细胞膜、血细胞膜经打碎后亦可制成颗粒抗原。颗粒抗原悬液呈乳浊状，多采用制成颗粒抗原。颗粒抗原悬液呈乳浊状，多采用静脉内免疫法静脉内免疫法，较少使用较少使用佐剂佐剂作皮内注射。作皮内注射。细菌菌体抗原细菌菌体抗原的制备流程图的制备流程图液体培养或液体培养或 斜面培养富集菌体斜面培养富集菌体 37 24h37 24h10
3、0100水浴水浴 2 22.5h2.5h 杀菌杀菌无菌试验无菌试验NSNS稀释成稀释成8 81010亿亿/ml/mlO O菌体抗原菌体抗原返回返回 4)菌苗 用细菌体制成的生物制品用细菌体制成的生物制品a.a.活菌苗：活菌苗：制备关键制备关键:获得减毒或无毒菌株，但应保持免疫原性。获得减毒或无毒菌株，但应保持免疫原性。优点优点;一般只需接种一次，且需量较小，但引起的一般只需接种一次，且需量较小，但引起的 免疫效果好，能维持较长时间。免疫效果好，能维持较长时间。缺点缺点:活菌苗需维持其活力，菌苗的保存需一定的冷藏条活菌苗需维持其活力，菌苗的保存需一定的冷藏条 件，且有效期短。件，且有效期短。实例
4、：预防结核病的卡介苗、鼠疫活菌苗等。实例：预防结核病的卡介苗、鼠疫活菌苗等。b.b.死菌苗死菌苗b.b.死菌苗死菌苗制备关键：用化学或物理方法将病原菌制备关键：用化学或物理方法将病原菌杀杀死死后仍可后仍可保持免疫原性保持免疫原性特点特点:病原菌已被杀死，不能繁殖，用量病原菌已被杀死，不能繁殖，用量较大，接种后可能出现局部肿痛或发热等较大，接种后可能出现局部肿痛或发热等全身反应全身反应;大多需多次接种。大多需多次接种。实例：霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙混合菌实例：霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙混合菌苗、百日咳菌苗等。苗、百日咳菌苗等。2.2.血红细胞抗原和组织细胞粗血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备抗原的
5、制备绵羊红细胞抗原的制备绵羊红细胞抗原的制备组织和细胞粗抗原的制备组织和细胞粗抗原的制备 绵羊红细胞的制备流程图绵羊红细胞的制备流程图 摇动摇动15-20min15-20min 44可保存可保存3 3周周 取适量取适量 NSNS洗涤洗涤3 3次次2000r/min2000r/min 10min 10minNSNS稀释至稀释至 2 25%5%抗凝血剂天然抗凝剂（肝素）Ca+2鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾）有溶血现象有溶血现象应弃去应弃去2 2）组织和细胞粗抗原的制备）组织和细胞粗抗原的制备 处理好的组织用生理盐水洗去血迹及污染物。处理好的组织用生理盐水洗去血迹及污染物。将洗将洗净的组织剪成小块，进行
6、粉碎。净的组织剪成小块，进行粉碎。组织匀浆后通过组织匀浆后通过200020003000r/min3000r/min离心离心10min10min后分成后分成两个部分两个部分 沉淀物含有大量的组织细胞和碎片沉淀物含有大量的组织细胞和碎片-组织和细胞粗组织和细胞粗抗原；抗原；上清液作为提取可溶性抗原的材料，提取前还要通过上清液作为提取可溶性抗原的材料，提取前还要通过100010002000r/min202000r/min2030min30min的高速离心，以除去微小的高速离心，以除去微小的细胞碎片，此时上清液应澄清的细胞碎片，此时上清液应澄清来源来源:组织和细胞，其成分比较组织和细胞，其成分比较复杂
7、复杂 1.1.组织和细胞成分组织和细胞成分混合抗原混合抗原制备制备 2.2.蛋白质抗原蛋白质抗原制备制备 3.3.核酸抗原核酸抗原制备制备 4.4.类脂多糖类脂多糖抗原制备抗原制备 5.5.免疫球蛋白免疫球蛋白片段制备片段制备 二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸 1.1.组织和细胞成分混合抗原制备程序组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液上清液澄清澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包去除包膜或结膜或结缔组织缔组织
8、脏器进行灌洗脏器进行灌洗洗去血迹洗去血迹及污物及污物NSNS内含内含0.5g0.5gL NaNL NaN2 2冷浴中组织剪碎冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液粉碎制成组织匀浆液3000r3000rminmin10min10min取上清液取上清液去除细胞碎片去除细胞碎片及微小组织及微小组织离心离心 蛋白质抗原制备蛋白质抗原制备 蛋白质是蛋白质是良好的良好的抗原，要制备特异性高抗原，要制备特异性高 的抗血清通常需要的抗血清通常需要纯化纯化。可采用：。可采用：1.1.超速离心法超速离心法 2.2.选择性沉淀法选择性沉淀法 3.3.凝胶层析法凝胶层析法 4.4.离子交
9、换层析法离子交换层析法 5.5.亲合层析法亲合层析法 原理原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有使具有不同沉降速度不同沉降速度的颗粒的颗粒,处于处于不同密度不同密度 的梯度层内的梯度层内，达到彼此分离的目的。，达到彼此分离的目的。特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：用于少部分应用：用于少部分大分子抗原大分子抗原和一些比较和一些比较轻轻 的抗原物质的抗原物质的分离，如的分离，如IgMIgM、C1qC1q、甲状腺球、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白蛋白、
10、载脂蛋白A A、B B等。等。2 2、选择性沉淀法、选择性沉淀法 原理：原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用度不同）；常用33335050饱和度的硫酸胺饱和度的硫酸胺。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。3 3凝胶
11、层析法（凝胶过滤法）凝胶层析法（凝胶过滤法）原理：原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分胶网孔结构内，反复受到
12、阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。成大、中、小三种类型。原理：原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，置，从而使血清中的蛋白质分成从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋球蛋白和清蛋
13、白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。5 5亲和层析法（亲和色谱）亲和层析法（亲和色谱）原理：原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的将纯化的抗抗IgGIgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的柱。当样品流过此柱时，待分离的IgGIgG可选择性地与免疫吸附可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体剂上的特异性配体(抗抗IgG)IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的将
14、待分离的IgIg洗脱下来，达到纯化的目的。洗脱下来，达到纯化的目的。优点：优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。提取纯度高、抗原抗体不失活性。核酸抗原制备核酸抗原制备大分子的核酸大分子的核酸具有免疫原性具有免疫原性。提取核酸的主要步骤：提取核酸的主要步骤：破碎细胞破碎细胞核酸从细胞中游离出来核酸从细胞中游离出来酸沉淀核酸酸沉淀核酸除去蛋白质除去蛋白质乙醇乙醇酚和氯仿酚和氯仿 类脂多糖抗原制备类脂多糖抗原制备苯酚法提取苯酚法提取LPSLPS：干燥菌体干燥菌体或湿菌体或湿菌体水中水中混匀混匀激烈搅匀激烈搅匀加热加热5min5min冰水冰水急冷急冷降至降至1010以下以下离心离心上层的水层上层的水层(
15、含含LPS)LPS)下层的酚层下层的酚层菌体残渣于底部菌体残渣于底部吸取吸取水层水层透析透析除酚除酚加热加热超速离心超速离心浓缩浓缩LPS LPS 在上层在上层沉淀的透明沉淀的透明胶状部内胶状部内绞出绞出悬于水中悬于水中离心离心得纯化得纯化LPSLPS同温的苯酚同温的苯酚 免疫球蛋白片段制备免疫球蛋白片段制备1 1酶裂解法酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。为不同的片段。2 2氧化法和还原法氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。链分开的两
16、种常用方法。3.3.还可用还可用强变性剂强变性剂或利用或利用改变改变pHpH将免疫球蛋将免疫球蛋 白亚单位分开。白亚单位分开。酶水解免疫球蛋白示意图酶水解免疫球蛋白示意图FcFc段，用段，用以制备抗以制备抗重链血清重链血清F(abF(ab)2 2，常作为抗常作为抗体试剂用体试剂用于试验于试验木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（papain)papain)胰蛋白酶胰蛋白酶(pepsin)(pepsin)胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin)(pepsin)1.1.氧化法：氧化法：优点是切开后，肽链不能重新优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化；形成二硫键、便于肽链纯化；缺点是色氨酸侧链容易被破坏缺点是
17、色氨酸侧链容易被破坏 氧化法和氧化法和还原法还原法2.2.还原法：还原法：将二硫键还原成巯基。但极不将二硫键还原成巯基。但极不 稳定，易重新形成二硫键，必须及时用稳定，易重新形成二硫键，必须及时用 碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化 三、半抗原免疫原的制备1.1.半抗原：半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。包括抗生素）及其他化学物品等。2.2.载体：载体：蛋白质类蛋白质类 多肽聚合物多肽聚合物 大分子聚合物大分子聚合物
18、3.3.半抗原半抗原-载体连接方法载体连接方法:载体类型载体类型 1.1.蛋白质：蛋白质：人血清白蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白牛血清白蛋白、兔、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.2.多肽聚合物多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。物产生高效价、高亲和力的抗体。3.3.大聚合物大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等
19、，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。可诱发动物产生抗体。通过电荷和微孔吸附手段通过电荷和微孔吸附手段 半抗原半抗原-载体连接方法载体连接方法1 1碳化二亚胺法：碳化二亚胺法：R-NH=CH-RR-NH=CH-R半抗原载体蛋白质半抗原载体蛋白质搅拌搅拌1 12h2h室温室温2424h h透析除去未反透析除去未反应的半抗原应的半抗原人工免疫原人工免疫原混合混合带游离的羧基或氨基的半抗原与载体连接带游离的羧基或氨基的半抗原与载体连接混合混合 半抗原半抗原-载体连接方法载体连接方法2 2戊二醛法戊二醛法:半抗原半抗原-NH-NH2 2载体蛋白
20、载体蛋白-NH-NH2 2半抗原半抗原-N=-N=CH-(CHCH-(CH2 2)3 3-CH=-CH=NH-NH-载体蛋白载体蛋白OHC-(CHOHC-(CH2 2)3 3-CHO-CHO*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能联接剂戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能联接剂与载体和半抗原的氨基相连接 半抗原半抗原-载体连接方法载体连接方法3 3氯甲酸异丁脂法：氯甲酸异丁脂法：半抗原半抗原-COOH-COOH载体蛋白载体蛋白-NH-NH2 2Cl-COO-CHCl-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2半抗原半抗原-COO-COO-CH-COO-COO-CH2 2CH(CHC
21、H(CH3 3)2 2半抗原半抗原-CO-CO-NHNH-载体蛋白载体蛋白简便，用于简便，用于类固醇抗原类固醇抗原制备制备HO-HO-CHCH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2 半抗原半抗原-载体连接方法载体连接方法4 4琥珀酸酐法：琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备用于不含羧基衍生物半抗原制备半抗原半抗原-CH-CH2 2OHOHCHCH2 2-CO -CO CHCH2 2-CO-CO 带羧基的半抗原带羧基的半抗原琥珀酸衍生物琥珀酸衍生物半抗原半抗原-CH-CH2 2-OOC-CH-OOC-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH返回返回吡啶吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化再
22、经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原二亚胺法制备载体半抗原 第三节第三节 多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备1.1.概念概念2.2.多克隆抗体的特点多克隆抗体的特点3.3.多克隆抗体的制备流程多克隆抗体的制备流程一、一、概念概念1.1.克隆：无性繁殖细胞系，由克隆：无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞单一个祖先细胞分裂繁分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。如无突变发生，其基因是完全相同的。2.多克隆抗体多克隆抗体:用一种包含用一种包含多种抗原决定簇的抗原多种抗原决定簇的抗原免疫免疫动物，可刺激
23、机体动物，可刺激机体多个多个B B细胞克隆细胞克隆产生针对多种抗原表产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种多种抗体的混合物抗体的混合物，即多克隆抗体。，即多克隆抗体。二二 、多克隆抗体多克隆抗体的特点的特点 特点特点:不均一性不均一性(抗体的异质性抗体的异质性),由外源性和内源由外源性和内源 性因素引起的性因素引起的1)外源性外源性:抗原分子结构复杂抗原分子结构复杂,具有多种抗原具有多种抗原 决决 定簇定簇,每种决定簇引起一种相应抗体的每种决定簇引起一种相应抗体的 产生产生.反映了机体对抗原物质的精细结反映了机体对抗原物质的精
24、细结 构的识别能力构的识别能力.2)内源性内源性:免疫球蛋白的血清型免疫球蛋白的血清型(回顾回顾)免疫蛋白为大分子蛋白质，具备抗原的各种免疫蛋白为大分子蛋白质，具备抗原的各种性质，对异种、同种异体，甚至宿主自身都是良性质，对异种、同种异体，甚至宿主自身都是良好的抗原，且是一个抗原复合体，带有多种抗原好的抗原，且是一个抗原复合体，带有多种抗原决定簇。决定簇。Ig分子的这种异质性反映了抗体形成细分子的这种异质性反映了抗体形成细胞的遗传性差异，代表抗体分子在不同水平上的胞的遗传性差异，代表抗体分子在不同水平上的遗传变异性；通常可用血清学方法检测出来，并遗传变异性；通常可用血清学方法检测出来，并据此将
25、据此将Ig及其肽链（及其肽链（H和和L链）分成不同的血清学链）分成不同的血清学类型。类型。同种型同种型 同种异型同种异型 独特型独特型免疫球蛋白的血清型免疫球蛋白的血清型:三、多克隆抗体的制备流程三、多克隆抗体的制备流程 1.1.免疫动物的选择免疫动物的选择 2.2.免疫的方法免疫的方法 3.3.动物采血法动物采血法 4.4.免疫血清的分离与保存免疫血清的分离与保存一、免疫动物选择一、免疫动物选择 能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。1.1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；抗原与免疫动物种属
26、差异越远越好；2.2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、体重合乎要求；体重合乎要求；3.3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答；应答；4.4.按需要量选择大小不同的动物。按需要量选择大小不同的动物。二、免疫方法 4.4.免疫方案免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗微量免疫法：卡介苗7 7天天弗氏佐剂弗氏佐剂1 1月月 抗原抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉 1.1.免疫原的注射剂量免疫原的注射剂量 2.2.免疫途
27、径：免疫反应产生速度依次为静脉免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌 3.3.免疫时间间隔：首次和第二次之间免疫时间间隔：首次和第二次之间10-2010-20天为宜，第二次以后天为宜，第二次以后 7-107-10天。免疫次数天。免疫次数3-53-5次。次。三、动物采血法三、动物采血法1.1.颈动脉放血法：最常用的方法颈动脉放血法：最常用的方法-常用于家兔的全采血常用于家兔的全采血 2.2.心脏采血法：要求操作熟练心脏采血法：要求操作熟练-常用于家兔和豚鼠的采血。常用于家兔和豚鼠的采血。3.3.静脉采血法：静脉采血法：颈静脉采血常用于绵羊；耳静
28、脉采血常用于颈静脉采血常用于绵羊；耳静脉采血常用于 家兔；尾静脉采血常用于小白鼠和大白鼠。家兔；尾静脉采血常用于小白鼠和大白鼠。1.41.4保存：可保存保存：可保存3 36 6个月个月2.2.低温保存：低温保存：-20-20-40-40，可保存，可保存2 23 3年年3.3.冰冻干燥保存：可保存冰冻干燥保存：可保存3 35 5年年 第四节第四节 抗体的纯化和鉴定抗体的纯化和鉴定1.1.抗体特异性的纯化抗体特异性的纯化2.2.特异性特异性IgGIgG类抗体的纯化类抗体的纯化3.3.特异性抗体的鉴定特异性抗体的鉴定 一、抗体特异性的纯化一、抗体特异性的纯化 1.1.亲合层析法：亲合层析法：将交叉抗
29、原交联到将交叉抗原交联到SepharoseSepharose 4B 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。性抗体。2.2.吸附法：吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。二、特异性二、特异性IgGIgG类抗体的纯化类抗体的纯化1.1.盐吸沉淀法：盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取经硫酸铵盐吸提取球蛋白球
30、蛋白 3 3次，基本为次，基本为IgGIgG类抗体，但不纯。类抗体，但不纯。2.A2.A蛋白亲和层析：蛋白亲和层析：SPASPA与与IgGIgG的的FcFc段有很强的段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个与抗体结合，一个A A蛋白至少可以结合二个蛋白至少可以结合二个 IgGIgG分子。适合纯化细胞培养上清中的分子。适合纯化细胞培养上清中的McAbMcAb。3.3.其它：其它：凝胶过滤、离子交换层析等凝胶过滤、离子交换层析等1.单克隆抗体的定义单克隆抗体的定义2.单克隆抗体制备原理单克隆抗体制备原理 3.单抗制备方法单抗制备方法
31、 步骤步骤4.制备过程中注意事项制备过程中注意事项 5.单抗的优缺点单抗的优缺点第五节第五节 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 1975 1975年分子生物学家年分子生物学家G.J.F.kelerG.J.F.keler和和C.MilsteinC.Milstein在细胞在细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，把体外培养和大量杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，把体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的小鼠脾细胞融合，增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体
32、形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高滴度的、用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高滴度的、非常均一的抗体非常均一的抗体单克隆抗体单克隆抗体:由一个识别由一个识别一种抗原表位的一种抗原表位的B细胞克隆细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高,少或无交叉反应性。少或无交叉反应性。Niels K.Jerne G.Kohler C.Mil
33、stein 单克隆抗体单克隆抗体 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的原表位的B B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞细胞杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理单克隆抗体制备步骤单克隆抗体制备步骤1 1.致敏淋巴细胞的准备致敏淋巴细胞的准备 2.2.骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的准备3.3.饲养层细胞的准备饲养层细胞的准备4.4.细胞融合细胞融合5.5.选择性培养选择性培养6.6.特异性抗体的检测特异性抗体的检测7.7.杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化8 8杂交瘤的冻存和复苏杂交瘤的冻存和复苏9 9单克隆抗体
34、的大量制取单克隆抗体的大量制取1010单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 步骤步骤1 1 致敏淋巴细胞的准备致敏淋巴细胞的准备u完全抗原：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于等分子量大于5000Da生物物质生物物质u半抗原半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质物质半抗原需与半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体能刺激动物产生可应用的高效价的抗体 步骤步骤1 1 致敏淋巴细胞的准备致敏淋巴细胞的准备u动物选择：动物选择：品系、
35、年龄、性别、健康状态u抗原免疫：抗原免疫：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定u收集时间：收集时间：末次加强免疫（iV或iP）后72-96h BALB/C小鼠小鼠选择体重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。步骤步骤2 2 骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的准备u常用骨髓瘤细胞系：常用骨髓瘤细胞系：SP20、NS1、P3.653 u融合时骨髓瘤细胞的选择：融合时骨髓瘤细胞的选择：a.处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 b.细胞株保持HGPRT 缺陷状态（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移）步骤步骤3 3 饲养层细胞的准备饲养层细胞的
36、准备u常用饲养细胞：常用饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾细胞，小鼠或大鼠胸腺细胞等。u饲养细胞主要作用：饲养细胞主要作用：可能在培养液中释放某种生长刺激因子；满足新生细胞对细胞密度的依赖性；减少聚苯乙烯培养板孔对新生细胞的毒性等 步骤步骤4 4 细胞融合细胞融合 步骤步骤5 5 选择性培养选择性培养HATHAT选择培养原理选择培养原理随机融合后的细胞类型随机融合后的细胞类型 选择性培养原理：选择性培养原理：核苷酸主要合成途径核苷酸补救合成途径氨基碟呤氨基碟呤 （A）HAT次黄嘌呤次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷（T）核苷酸DNA 步骤步骤6 6 特异性抗体的检测特异性抗体的检测对检测方
37、法的要求：灵敏度高 特异性强 简便快速常用检测方法：ELISA阳性孔的检测 步骤步骤7.杂交瘤细胞的克隆化目的目的：建立单一细胞克隆方法：方法：有限稀释法，显微操作法，软琼脂培养法克隆建立的标准：克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔有限稀释法有限稀释法计数0.5-2/孔 步骤步骤8 8杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏冻存：冻存：慢冻，分步冻存，室温-20-70液氮复苏：复苏：快融，取出立即浸入37-40水浴中，使其迅速融化意义：意义：防止污染及变异 避免染色体丢失 防止细胞密度过高而死亡 步骤步骤 9 9单克隆抗体的大量制取单克隆抗体的大量制取动物体内诱生：动物体内诱生：腹腔
38、接种腹腔接种体外细胞培养：体外细胞培养：悬浮培养系统，细胞固悬浮培养系统，细胞固 定化培养系统定化培养系统 步骤步骤 9 9单克隆抗体的大量制取单克隆抗体的大量制取 腹腔接种腹腔接种 1.辛酸硫酸铵沉淀法辛酸硫酸铵沉淀法原理：原理：先加正辛酸沉淀杂蛋白，后加硫酸铵 沉淀抗体。特点：特点：成本较低，操作简单；抗体活性损失小；抗体纯度高；抗体回收率低；需要高速冷冻离心机。步骤步骤 10单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化2 亲和层析法：亲和层析法：u原理：原理：利用蛋白A或蛋白G通过共价键联接到活化的固相载体上，吸附抗体，然后采用改变pH值的方法将抗体洗脱分离。特点：抗体纯度高；纯化速度快；抗体回收率
39、低；抗体活性有损失；成本高，费用大。单克隆抗体的优缺点单克隆抗体的优缺点u优点优点：在体外“永久”地存活并传代 用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗u局限性局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围 反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂、费时费工、价格较高 结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
