1、实验九实验九 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验-ELISA-ELISA实验十实验十 IgGIgG的分离和纯化的分离和纯化程 燕2014年6月9日实验九十酶联免疫吸附试验1实验九实验九 酶联免疫吸附试酶联免疫吸附试（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）实验九十酶联免疫吸附试验2实验目的实验目的 1.掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。2.学习用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法学习用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。）的方法。3.了解了解HBsAg阳性的意义
2、。阳性的意义。实验九十酶联免疫吸附试验3实验原理实验原理 用酶来标记抗原或抗体的免疫分析分析技术。由于酶的高效生物催化作用，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。酶联免疫吸附试验法。实验九十酶联免疫吸附试验4实验原理实验原理 将已知抗体（或抗原）结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体（或酶标抗原）按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（或抗原）发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。实验九十酶联免疫吸附试验5实验原理实验原理ELISA的基本原理有三条
3、：（1）抗原或抗体能以物理性（疏水性）地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。实验九十酶联免疫吸附试验6实验原理实验原理常用酶联免疫吸附试验有常用酶联免疫吸附试验有间接法间接法竞争法竞争法双抗体夹心法双抗体夹心法 实验九十酶联免疫吸附试验7ELISA-ELISA-间接法间接法 此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸
4、附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。酶标抗体酶标抗体固相抗原固相抗原待测抗体待测抗体EEE ELISAELISA间接法示意图间接法示意图实验九十酶联免疫吸附试验8 用于用于抗原及半抗原的定量测定抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测
5、抗原含量呈负相关。固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEEELISA-ELISA-竞争法竞争法 实验九十酶联免疫吸附试验9ELISA-ELISA-双抗体夹心法双抗体夹心法 双抗体夹心法常用于检测抗原。双抗体夹心法常用于检测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本本(含相应抗原含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。加入酶标抗体及底物溶液进行测定。酶标抗体酶标抗体固相抗体固相抗体待测抗原待测抗原EEE 双抗体
6、夹心法检测抗原双抗体夹心法检测抗原实验九十酶联免疫吸附试验10实验材料1 1、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAgHBsAg。包括：包括：HBsAgHBsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上 HBsAgHBsAg阴、阳性血清各阴、阳性血清各1 1份、份、酶标抗体（二抗）酶标抗体（二抗）1 1份，份，显色剂显色剂A A、B B各各1 1份，终止液份，终止液1 1份，洗涤液份，洗涤液1 1份，份，2 2、待检血清、待检血清5 5份份3 3、
7、微量加样器（、微量加样器（10-100ul10-100ul）及匹配的枪头）及匹配的枪头4 4、废液缸、废液缸 注意：有污染性。注意：有污染性。实验九十酶联免疫吸附试验11夹心法检测夹心法检测HBsAgHBsAg方法方法 由于抗体由于抗体1 1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。1 1、加样：、加样：每组每组2 2条条8 8孔，待检孔，待检8 8孔，阴性对照、阳性孔，阴性对照、阳性对照对照、空白对照空白对照各各1 1孔。分别加孔。分别加75ul75ul待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板膜，置膜，置3737恒温箱
8、温育恒温箱温育6060分钟。分钟。2 2、加酶标抗体：、加酶标抗体：除空白对照孔外，每孔加除空白对照孔外，每孔加1 1滴酶标溶液，混匀后滴酶标溶液，混匀后封板，封板，置置3737水浴箱温育水浴箱温育3030分钟。分钟。3 3、洗涤：、洗涤：用洗涤液（用洗涤液（按说明配制按说明配制）注满各孔，静置）注满各孔，静置2020秒，甩去洗秒，甩去洗涤液，重复涤液，重复4 4次，最后一次在吸水纸上拍干。次，最后一次在吸水纸上拍干。4 4、显色：、显色：每孔加底物液每孔加底物液A A、B B 各各1 1滴（滴（50ul50ul），轻拍混匀，置），轻拍混匀，置3737避光显色避光显色3030分钟，肉眼观察。分
9、钟，肉眼观察。5 5、终止：、终止：每孔加终止液每孔加终止液1 1滴（滴（50ul50ul），轻拍混匀。在），轻拍混匀。在1010分钟内酶标分钟内酶标6 6、测定：、测定：用酶标仪（波长用酶标仪（波长450nm450nm）测定各孔吸光度）测定各孔吸光度ODOD值。值。实验九十酶联免疫吸附试验12 酶：辣根过氧化物酶(HRP)底物：3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M H2SO4终止反应，在450nm测定吸光度。实验九十酶联免疫吸附试验13结果判断结果判断 1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。2、P/N值2.1者判为H
10、BsAg阳性；P/N值2.1者判为阴性。介于中间为可疑。S：待测样本OD值COV：cut-off value=NCx+0.100NCx：阴性对照OD值的均值阳性判定值=S/COV1.0：阳性1.0：阴性实验九十酶联免疫吸附试验14实验九十酶联免疫吸附试验15实验报告1、计算5个待测样本的S/COV，判断结果2、本实验中采用的酶、底物及反应原理。实验九十酶联免疫吸附试验16实验十实验十 IgG的分离和纯化的分离和纯化实验九十酶联免疫吸附试验17实验目的实验目的 实践实践IgGIgG分离纯化过程分离纯化过程 了解分离、纯化抗体的原理了解分离、纯化抗体的原理 比较成年牛血清与新生牛血清中比较成年牛血
11、清与新生牛血清中IgGIgG的含量的含量（眼观）（眼观）实验九十酶联免疫吸附试验18实验原理实验原理 利用蛋白质盐析原理，分离血清中的利用蛋白质盐析原理，分离血清中的IgGIgG:不同蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶不同蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同浓度的盐溶解度不同，因此，可利用不同浓度的盐溶液使血清中的各个蛋白质成分分别析出。液使血清中的各个蛋白质成分分别析出。实验九十酶联免疫吸附试验19血清蛋白质：复杂混合物。1、白蛋白、a1、a2、球蛋白，纤维蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝细胞合成。2、球蛋白主要来自浆细胞。免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（-球蛋白）中。免
12、疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。实验九十酶联免疫吸附试验20 一般一般pH7.0pH7.0时，时，5050硫酸铵饱和度可将所有硫酸铵饱和度可将所有的的5 5种种IgIg（球蛋白）沉淀出来。（球蛋白）沉淀出来。3333饱和度饱和度大部分大部分IgGIgG可沉淀出来。可沉淀出来。意义：制备出的纯化意义：制备出的纯化IgGIgG，可用于酶标抗体，可用于酶标抗体或荧光抗体的制备。或荧光抗体的制备。实验九十酶联免疫吸附试验21实验器材实验器材1 1动物抗血清：成年牛血清、新生牛血清动物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2 2硫酸铵饱和溶液、硫酸铵饱和溶液、0.01mol/L0.0
13、1mol/L的的PBS PBS 3 3冰箱、离心机、电磁搅拌器、天平、尼龙绳冰箱、离心机、电磁搅拌器、天平、尼龙绳等。等。实验九十酶联免疫吸附试验22实验步骤实验步骤1.1.取取xmlxml血清（血清（2ml2ml），加等量，加等量0.01mol/L0.01mol/L的的PBSPBS稀释，搅拌稀释，搅拌下逐滴加入饱和下逐滴加入饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4溶液溶液2X ml2X ml（4ml4ml），边加边搅，边加边搅拌，拌，44静置静置3030分钟以上，使其充分沉淀。分钟以上，使其充分沉淀。2.2.离心：离心：300030004000r/min4000r/min离心离心20mi
14、n20min，弃上清。，弃上清。3.3.以以0.01mol/L0.01mol/L的的PBSPBS溶解沉淀至溶解沉淀至XmlXml（5ml5ml），），再逐滴加入再逐滴加入饱和饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 X/2mlX/2ml（2.5ml2.5ml)。置。置44，30306060分钟。分钟。4.4.再离心：再离心：3000r3000r4000r/min4000r/min离心离心20min20min，弃上清。，弃上清。5.5.重复上述第重复上述第3 3、4 4步骤步骤1 12 2次，可得到较纯的次，可得到较纯的IgGIgG。6.6.透析除盐透析除盐:装入透析袋装入透析袋,分别在蒸馏水、分别在蒸馏水、0.01mol/L0.01mol/L的的PBSPBS透析，每天换透析外液透析，每天换透析外液3 3 5 5次，次，2 2 3 3天。天。凝胶电泳、凝胶电泳、层析层析。实验九十酶联免疫吸附试验23实验报告问答题：比较成年牛血清与新生牛血清中IgG含量的比较。分析差异的原因。实验九十酶联免疫吸附试验24
