1、1实时定量PCRQuantitative Real-Time PCR梁沛中国农业大学昆虫学系2主要内容n基本原理n几个概念n绝对定量n相对定量n常见问题3一、基本原理41993年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR的方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。荧光染料：EB（溴乙锭）PCR仪：改良的热循环仪激发光：UV射线检测器：CCD相机缺点：仪器耗费巨大；非特异产物导致定量不准确5n1995年美国PE公司成功开发TaqMan技术n1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等6n实时定量PCR技术
2、（real-time quantitative PCR）是指在PCR反应体系中加入，实时监测整个PCR过程中荧光信号的累积强度，并利用特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。nRT-PCR：Reverse-transcription PCRnqRT-PCR:quantitative Real-time PCR789检测通道n2004年推出的7300和7500均为第三代产品，2001推出的7900为第二代产品。n7300：4通道n7500：5通道n均需加Rox染料进行校正1011两种荧光标记法1.染料染色-SYBR Green I-EB2.探针标记-Taqman-Taqman MGB-分子信标
3、12SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm1.荧光染料法荧光染料法13化学原理14染料法的优缺点：n实验设计简单，仅需要设计一对上下游引物，不需要设计探针，通用性好；n成本低；n可通过分析检验扩增产物的特异性。n低通量实验一般优先考虑使用SYBR Green I染料法。15染料法的优缺点nSYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高SYBR Green I 可与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性nSYBR Green I 不能区分不同扩增片段发出的荧光而导致它不能用于多
4、重反应 162.荧光探针法(Taqman)17Taqman ProbeQuencherReporter18Tagman probe 的工作原理19探针与PCR产物的数量关系n每产生一个新的DNA片段，就切断一条探针n每切断一条探针，就产生一个单位的荧光信号n信号强度与DNA的copy数成正比20探针法的优缺点nTagman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性n可用于多重反应，即可同时检测多个目的基因。n但探针设计成本较高，有时探针设计困难。21二、几个概念221.扩增曲线n描述PCR动态进程的曲线称为扩增曲线。nPC
5、R的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线CyclesFluoresces231.扩增曲线n扩增曲线分三个阶段：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可选择该阶段进行定量分析。扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。242.荧光阈值n一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。n是人为设定的一个值，可设在指数扩
6、增阶段任意位置上。n缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（自动）。2.荧光阈值25262.荧光阈值n手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是超过域值的荧光信号。273.Ct值nCycle threshold，就是当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环次数。线性图谱半对数图谱28Ct值的重现性293.Ct值nCt值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，达到阈值所需的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。n正常的Ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。3031Ct值定量的数学
7、原理32Ct值定量的数学原理33Ct值定量的数学原理34Ct值定量的数学原理0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold10410310235靶标基因的定量36靶标基因的定量50001000012需要制备标准品需制作绝对标准曲线无需标准品，需制作相对标准曲线37靶标基因的定量CYP6B6Actin38三、绝对定量39三、绝对定量40三、绝对定量41三、绝对定量1.化学合成目的基因，是纯度高、定量准确是受化学合成工艺限制，只能合成120bp以下的长度；2.回收纯化PCR产物后克隆到载体上，然后抽提
8、质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量是稳定、准确。42三、绝对定量43三、绝对定量(以dsDNA为例）dalton/bp44三、绝对定量n3000 碱基质粒，浓度100 ng/ul nMW=3000 bp x 660 dalton/bp=1.98 x 106 daltons。ncopy数-3x 1010 copies/ul100ng1.98 x 10645绝对定量举例Copies/ul Ct 1Ct 2Meant CtSTD510328.1828.6428.410.16510425.2525.1425.190.04510522.1122.4622.280.12510618.6318.9
9、218.770.10Blank46绝对定量举例扩增效率（扩增效率（E）计算）计算E=10-1/斜率斜率 =10-1/-3.18 =2.06E%=(2.06-1)100%=106%47绝对定量举例n如未知样本Ct为20.5，将Ct值带入线性方程：n20.5=-3.183 X+40.211nX=（20.5-40.211）/-3.183 =6.19n未知样本拷贝数=106.19=1548816 copies/ul48四、相对定量n无需知道目的基因的绝对拷贝数 1.模板均一性问题模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等 2.RNA制备制备：RNA纯化得率、均一性等 3.反转录反转录：反转录的
10、效率等49内标/内参照n因因RNA纯化后得率不同、纯化后得率不同、RNA反转录为反转录为cDNA的效率的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度可能不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度可能不同。因此，在进行基因表达研究中都会用看家基因不同。因此，在进行基因表达研究中都会用看家基因（house-keeping gene）对数据进行标准化，以校）对数据进行标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。正因样品初始浓度不同而造成的差异。n常用的看家基因有：常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18S rRNA等等50相对定量的方法n双标准曲线法双标准曲线法nCt法法51双标
11、准曲线法n优点：优点：分析简单，实验优化简单。n缺点：缺点：对每一个基因每一个基因，每一轮实验每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况。n应用应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一。处理组处理组目的目的基因表达量基因表达量处理组处理组参照参照基因表达量基因表达量对照组对照组目的目的基因表达量基因表达量对照组对照组参照参照基因表达量基因表达量相对表达量相对表达量52Ct法法nCt，即，即Ct的变化值的变化值n假定目
12、的基因和参照基因的扩增效率相同，均为假定目的基因和参照基因的扩增效率相同，均为100%2-(Ct1-Ct2)2-Ct53Ct法法举例举例Cyp6B6 ave Ct18S RNA ave Ct标准化的Cyp6B6 Ct校正Ct处理组处理组22.812.310.5-1.4对照组对照组24.512.611.902-Ct=54Ct法法n优点：优点：优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。n要求：要求：标准曲线斜率差值70%高效、全长的高效、全长的cDNA61建立反应体系n做普通PCR、跑核酸电泳的枪严禁用于定量PCR！n加buffer、
13、引物和水在独立房间n加模板在另一房间n加模板和其它反应物的移液枪要严格区分，不能混用！n增大模板的加样量，以减少孔间误差。n使用mix以减少系统误差；每个样品至少3个重复62样品设置6364656667引物设计及评价引物设计的基本原则：1)避免重复碱基，尤其是G.2)引物的退火温度要高，一般要在60度以上3）GC=30-80%.4)3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。6)PCR扩增产物长度：不要太大，一般在80-250bp之间都可；80150 bp最为合适（可以延长至300 bp）.68引物设计及评价n做溶解曲线Dissociation cur
14、ve69引物设计及评价70SYBR法常见问题及注意事项特异性扩增产物特异性扩增产物非特异性扩增产物非特异性扩增产物引物二聚体引物二聚体71探针设计原则1.探针位置尽可能地靠近上游引物，扩增片段长度在50150bp范围内；2.探针长度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引物Tm高510，GC含量在40%70%。3.探针的5端应避免使用碱基G。4.探针内部或探针与2条引物之间避免3个碱基以上的互补序列。72探针设计原则5.整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。6.为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在Blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。73Primer express 3.0747576Thanks for your attention!
