1、2022-12-9FDA药物相互作用研究药物相互作用研究指南指南引见内容 简介 药物相互作用研讨的背景知识 药物相互作用研讨的普通战略 体内药物相互作用的实验设计 药物代谢酶确实认 CYP酶抑制/诱导作用的体外评价 P-gp底物和抑制剂的体外实验研讨简介美国FDA药物评价和研讨中心(CDER)生物制品评价和研讨中心(CBER)2006年9月共同发布药物相互作用研讨-实验设计、数据剖析及其在剂量调整和处方标签中的运用的指南简介 指南为新药和重生物制品的研发者提供了：药物代谢药物转运体内体外相互作用研讨规范简介 内容触及药物相互作用研讨的全进程内容触及药物相互作用研讨的全进程 包括：包括：实验设计
2、实验设计 研讨人群或体外研讨用细胞、微粒体研讨人群或体外研讨用细胞、微粒体 探针底物、抑制剂、诱导剂的选择探针底物、抑制剂、诱导剂的选择 观察目的、样本量和数据统计剖析，等观察目的、样本量和数据统计剖析，等 除了代谢性药物相互作用以外，还对除了代谢性药物相互作用以外，还对P糖蛋白介导的药物糖蛋白介导的药物相互作用的研讨方法给予了详细的指点相互作用的研讨方法给予了详细的指点 与与1999年版本相比的添加内容年版本相比的添加内容1.药物相互作用研讨的背景知识包括细胞色素P450(CYP)酶在内的多个药物代谢酶都能被联用的药物所抑制/诱导药物浓度发作庞大改动影响药物平安性和有效性 同时,药物转运蛋白
3、相关的药物相互作用遭到越来越多的关注 如:P-gp、无机阴离子转运蛋白OAT，等。表一：人类主要的转运蛋白和的底物、抑制剂、诱导剂2.药物相互研讨的普通战略 依据体外代谢、和诱导实验的结果及体内代谢实验数据确定体内相互作用研讨必要性。流程图 目前尚未发现CYP2D6酶被诱导的状况，而CYP2C,CYP2B和P-gp是可以和CYP3A一同被诱导的。CYP3A对一切的诱导剂都很敏感。因此，调查受试药物能否可以诱导CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19和CYP3A时，只需求体外调查对CYP1A2和CYP3A酶的诱导状况即可。假定体外实验显示受试药物对CYP3A无诱导作用，那么就可以
4、免做对CYP2C和CYP2B的诱导研讨。3.体内药物相互作用实验设计 实验设计 研讨群体 底物和作用药物的选择 给药途径 给药剂量3.1实验设计 思绪：比拟底物S浓度在有和没有作用药物I时的变化状况。随机交叉法 先服用S后服用S+I组、先服用S+I组后服用S组 单次第交叉法 总是先服用S后服用S+I组、或相反 平行设计 一组服用S,一组服用S+I设计方案时应该留意：(1)假定实验需求抵达稳态血药浓度而底物或作用药物和(或)其代谢物的半衰期较长,此时不能采用额外给予一个负荷剂量的方法加快抵达稳态。(2)假定作用药物是一个快速可逆的抑制剂,其服用时间应该在测定当天服用底物前或同时服用,这样才干添加
5、其敏理性。关于基于作用机制的抑制剂(如红霉素),在服用底物药物前服用作用药物可以增加相互作用强度。假定作用药物(抑制剂或诱导剂)的吸收受多种要素的影响(如胃pH值),那么需求采取适当的方法控制吸收方面的变化。(3)为了扫除由于食物、饮料、果汁等影响代谢酶和转运蛋白而惹起误差,指南建议实验进程中要严峻控制饮食。3.2 研讨群体 普通是安康受试者。在特定环境下，受试药物表现的治疗效果或许药效学效果不在安康者身上出现，此时要从患者群体中招募受试者。药物相互作用的水平可以因受试者某个详细CYP酶的基因型不同而有所差异。3.3 底物和作用药物的选择 表二：指南推荐的CYP酶底物。鸡尾酒方式鸡尾酒方式释义
6、：在一个实验中受试者同时服用多种释义：在一个实验中受试者同时服用多种CYP酶底物。酶底物。实验设计需思索以下要素：实验设计需思索以下要素：(1)一种特定酶的底物对该酶具有较高的选择一种特定酶的底物对该酶具有较高的选择性性;(2)底物之间没有相互作用发作底物之间没有相互作用发作;(3)受试者的数量抵达统计学要求。受试者的数量抵达统计学要求。(4)药物浓度变化在平安范围内药物浓度变化在平安范围内;(5)中选的中选的CYP酶都参与药物代谢消弭酶都参与药物代谢消弭;(6)药物其他代谢途径或许不被抑制的途径的药物其他代谢途径或许不被抑制的途径的药物肃清率低。药物肃清率低。评价：评价：这种鸡尾酒实验的阴性
7、结果可以免除对其中某个详细酶的进这种鸡尾酒实验的阴性结果可以免除对其中某个详细酶的进一步评价一步评价,但是阳性结果那么需求进一步的体内研讨。但是阳性结果那么需求进一步的体内研讨。鸡尾酒实验可比单个相互作用研讨提供更多的信息鸡尾酒实验可比单个相互作用研讨提供更多的信息,而结论确而结论确实定水平取决于药物其他不被抑制的代谢途径的肃清率分实定水平取决于药物其他不被抑制的代谢途径的肃清率分数数(肃清率分数越小肃清率分数越小,确定水平越高确定水平越高)。假定单一的相互作用实验显示抑制效应可以招致严重的平安假定单一的相互作用实验显示抑制效应可以招致严重的平安隐患隐患,那么不能中止鸡尾酒设计法。那么不能中止
8、鸡尾酒设计法。3.4 给药途径 受试药物的给药途径应与未来临床运用的方式分歧。体内相互作用研讨采取的给药方式取决于未来上市剂型。3.5 给药剂量 实验设计应尽可以将底物和作用药物相互作用的结果最大化，因此指南推荐作用药物抑制剂/诱导剂运用最大平安剂量和最短给药距离。当运用低于临床常用剂量的给药方案时，体内药物相互作用研讨方案应在结果报告中中止讨论。4.药物代谢酶确实认 假定某个酶对药物的代谢量占整个药物消弭量 25%,那么可以确认此酶是药物的主要代谢酶。将药物和肝细胞或肝切片一同孵育,然后经过色谱方法剖析孵育介质和细胞内药物浓度,这种方法可以直接取得氧化、水解或基团转移构成的代谢物,提供平行代
9、谢还是先后代谢的信息。另一种方法是用HPLC来剖析孵育介质。实验还需求优化介质中受试药物浓度和孵育时间。临床预期的稳态血药浓度可以用来指点体外实验介质中药物浓度的选择。有三种方法可以很好地确认不同的有三种方法可以很好地确认不同的CYP酶对药物代谢的贡酶对药物代谢的贡献献:(1)特定的化学物质或抗体作为特定酶的抑制剂特定的化学物质或抗体作为特定酶的抑制剂 表表5：列出了常用的特异性化学抑制剂。：列出了常用的特异性化学抑制剂。在确定代谢酶种类及其在药物代谢中的相对贡献时在确定代谢酶种类及其在药物代谢中的相对贡献时,药物药物的浓度要的浓度要Km 值值,而抑制剂的浓度既要保证其选择性又要而抑制剂的浓度
10、既要保证其选择性又要保证足够的量保证足够的量,所以可以采用一系列的抑制剂浓度。当运所以可以采用一系列的抑制剂浓度。当运用基于作用机制的抑制剂时用基于作用机制的抑制剂时,最好将抑制剂与酶预先孵育最好将抑制剂与酶预先孵育15 30 min。(2)运用不同的人重组CYP酶,这种技术对研讨单个CYP酶在整个药物代谢中的相对贡献的大小具有很高的价值,但不能代表人肝微粒体酶中的相对的代谢比率。(3)依据不同供体来源的CYP酶不同活性树立人肝微粒体库。指南建议至少采用上述两种方法来确认药物代谢酶5.CYP酶抑制造用的体外评价Review:Ki：抑制率常数，抑制造用越强，此值越小IC50：反响被抑制一半时抑制
11、剂的浓度，越低说明抑制剂的抑制才干越强。5.CYP酶抑制造用的体外评价 CYP酶抑制剂体外实验设计本卷须知:(1)IC50测定时,在底物代谢率允许的状况下,尽量使底物的浓度低于其Km 值,使IC50与其Ki 值更具相关性;(2)肝微粒体蛋白浓度通常 1 gL-1;(3)缓冲液的性质、pH对Vmax和Km 的影响清楚,尽可以采用规范化的剖析条件;(4)反响系统中最好控制底物或抑制剂的消耗不逾越10%30%,但是关于Km 值很低的药物来说,控制反响体系底物消耗10%很困难;(5)建议树立时间-产物构成量的线性关系;(6)建议树立酶量-产物构成量的线性关系;(7)由于某些无机溶剂具有酶诱导或抑制造用
12、,溶剂的浓度都要 1%(v/v),最好 0.1%,实验应包括无溶剂对照和溶剂对照;(8)实验应该有一个抑制剂的阳性对照。相互作用水平的模拟：R=1+I/Ki I代表作用部位抑制剂的浓度,Ki 是抑制常数 指南推荐体内相互作用的可以性经过 I/Ki 来推断,I代表服用临床最大用药量后平均稳态的药物浓度(游离或结合的全部药物),比值降低,发作相互作用的可以性增大。虽然经过体外数据定量预测体内相互作用发作的可以性存在困难,但可以经过同一个药物对不同CYP 酶(CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19、CYP2D6和CYP3A)的Ki 值中止挑选排序,体内实验从 I/Ki 最大者(或许
13、Ki 最小者)的CYP酶末尾,假定实验显示体内不存在药物相互作用,其他的 I/Ki 相对较小的CYP酶的体内实验就可以不做。6.CYP酶诱导作用的体外评价 实验设计中应包括一个公认的酶诱导剂作为阳性对照,来减小不同供体酶催化活性差异惹起的误差。表7:诱导剂选择列表实验中应留意：实验中应留意：(1)受试药物的浓度应该参考临床治疗剂量的血药浓度受试药物的浓度应该参考临床治疗剂量的血药浓度,至少至少包括包括3个涵盖治疗窗的挑选浓度个涵盖治疗窗的挑选浓度,其中至少其中至少1个浓度要逾越个浓度要逾越平均预期治疗浓度平均预期治疗浓度1个数量级个数量级;(2)与肝细胞共孵育与肝细胞共孵育23 d后后,经过经
14、过CYP特异的探针药物特异的探针药物(参考参考指南推荐指南推荐)测定酶活性测定酶活性;(3)运用新颖区分的或许冻存的肝细胞中止实验时运用新颖区分的或许冻存的肝细胞中止实验时,应该至少应该至少选择选择3份不同的供体以添加诱导实验中存在的团体差异。份不同的供体以添加诱导实验中存在的团体差异。评价药物酶诱导作用时评价药物酶诱导作用时,指南建议指南建议:(1)药物体外实验惹起的酶活性的改动药物体外实验惹起的酶活性的改动40%阳性对照结果时阳性对照结果时,可以以为药物具有酶诱导作用可以以为药物具有酶诱导作用,需求进一步的体内研讨需求进一步的体内研讨;(2)EC50可以用来比拟不同诱导剂诱导能可以用来比拟
15、不同诱导剂诱导能 力的强弱力的强弱;(3)指南以为指南以为,依据目前了解的依据目前了解的CYP酶诱导的细胞学机制酶诱导的细胞学机制,假定假定一个诱导实验显示对一个诱导实验显示对CYP3A4 酶没有诱导作用酶没有诱导作用,可以推断可以推断此药物对此药物对CYP2C8,CYP2C9和和CYP2C19也没有诱导作用。也没有诱导作用。7.P-gp底物和抑制剂的体外实验研讨 调查药物能否是P-gp的底物或抑制剂,最稀有的方法有哪些？双向转运测定法由于更直接,因此被作为规范的方法。ATP酶活性测定法和摄取/外排法可以用于快速挑选,但是不能区分是底物还是抑制剂。假定药物透过性(膜分散才干)低,ATP酶法和荧
16、光定量法经常无法识别能否是P-gp的底物。对高通透性化合物,双向转运测定法也不适用。这些底物作为阳性对照，保证明验用细胞可以表达功用性的P-gp.7.1双向转运实验确定药物能否是双向转运实验确定药物能否是P-gp的底物的底物选择好细胞系和选择好细胞系和P-gp底物阳性对照后底物阳性对照后,遵照以下步骤完成实验遵照以下步骤完成实验:(1)设计几个不同的药物浓度设计几个不同的药物浓度(如如1,10,100molL-1)调查调查P-gp 对药物对药物的外排作用的外排作用;(2)实验末尾前实验末尾前,将极性细胞组成的膜两侧的介质去掉将极性细胞组成的膜两侧的介质去掉,参与新的介质并孵参与新的介质并孵育育
17、30 min;(3)中止双向膜转运通透性研讨中止双向膜转运通透性研讨:在极性膜的在极性膜的A侧侧(apical侧侧,腔侧腔侧,顶区侧顶区侧,转转运方向是运方向是A B)或或B 侧侧(basolateral侧侧,基底侧基底侧,转运方向是转运方向是B A)参参与过量体积的含有与过量体积的含有P-gp底物或受试药物的缓冲液底物或受试药物的缓冲液;(4)在在37C孵育孵育,在预定的时间在预定的时间(通常是通常是1,2,3,4 h)搜集受侧的介质测定搜集受侧的介质测定药物浓度药物浓度,同时迅速补充缓冲液同时迅速补充缓冲液;(5)P-gp底物作为阳性对照中止异常的实验;(6)当采用LLC2PK1-MDR1
18、 MDCK-MDR1 作为实验细胞系时,相应的野生型细胞系LLC-PK1和MDCK作为阴性对照;(7)每个实验至少在不同日期重复3次,调查日间和日内变异状况;(8)理想的实验还应该测定底物的回收率,来消药物代谢和非特异性结合带来的误差 由于Caco-2、野生型的LLC-PK1和MDCK也能表达其他外排转运蛋白,因此在评价药物能否是P-gp底物时要慎重,为添加实验的可信性,建议添加P-gp抑制剂(表10)存在下的底物验证明验,假定药物的外排可被P-gp抑制剂清楚抑制,那么说明药物的外排与P-gp有关。指南还建议,可以经过实验对比MDR1过度表达细胞(转染型细胞)和它们的野生型细胞对药物外排活性的
19、差异,确定P-gp在药物外排中的贡献大小。运用以下公式描画药物跨膜表观通透性:Papp=(Vr/c0)(1/S)(dc/dt)其中,V r是极性膜受侧介质体积,c0是指膜供侧实验药物的浓度,S是指极性细胞构成的膜的面积,dc/dt是受侧介质药物浓度与时间曲线的斜率。准确计算Papp必需求求受侧药物浓度与时间是直线关系。药物经P-gp外排速率RE可以经过以下公式计算:RE=PB/A/PA/BPB/A和PA/B区分代表受试药物B A和AB 的跨膜表观通透性。7.2双向转运实验确定药物能否是双向转运实验确定药物能否是P-gp抑制剂抑制剂(1)运用Caco-2细胞系时,要运用无药介质作为空白对照,测试
20、药物的浓度要适宜;(2)当采用LLC-PK1-MDR1 和MDCK-MDR1作为实验细胞系时,相应的野生型细胞系LLC-PK1和MDCK作为阴性对照;(3)37孵育细胞系0.51 h后,去除孵育介质,换成浓度适宜的P-gp探针底物(表9);(4)孵育细胞系13 h后,测定受侧介质中P-gp探针底物的浓度;(5)每个实验至少在不同日期重复3次,每个实验也要用至少3个极性细胞膜中止测定。7.3受试药能否是受试药能否是P-gp 底物或抑制剂底物或抑制剂,以及能否以及能否需求中止体内实验的判定流程需求中止体内实验的判定流程7.4潜在潜在P-gp诱导药物确实定诱导药物确实定 P-gp的表达可被诱导,的诱
21、导剂包括利福平和圣约翰草.P-gp 对其诱导剂的反响存在清楚的物种差异,因此植物实验不能用来评价受试药对人P-gp的诱导效应.P-gp的表达也受PXR的调控,因此和CYP3A酶具有共诱导现象。Caco-2缺乏PXR,不是研讨P-gp诱导作用的适宜细胞系。文献报道人类结肠腺癌细胞LS180/WT和其多柔比星抵抗亚系(LS180/AD50)、长春碱抵抗亚系(LS180/V)被用来研讨P-gp和CYP3A酶的诱导效应。指南指出,目前体外评价P-gp诱导效应的适当方法没有确立,因此受试药潜在的P-gp诱导活性只能经过体内实验评价。由于CYP3A和P-gp具有相似的诱导机制,受试药对CYP3A的诱导结果可以用来推论试药对P-gp的诱导效应。假定体外实验没有发现受试药对CYP3A 具有诱导效应,不用做CYP3A和P-gp的体内调查实验。假定受试药体外诱导实验阳性而中止的CYP3A体内实验结果阴性,也不用中止受试药的P-gp的体内诱导实验。但是假定CYP3A体内实验显示有酶诱导作用,指南推荐受试药中止P-gp敏感探针底物的体内诱导研讨。
