1、细菌细菌16S rDNA技术在细菌鉴技术在细菌鉴定中的应用定中的应用主讲人：李新琼一、细菌基因组的提取一、细菌基因组的提取细菌基因组提取的主要方案包括：细菌基因组提取的主要方案包括：1 1、水煮模板；、水煮模板；2 2、CTAB/NaCl CTAB/NaCl 法；法；3 3、盐析法、盐析法 多聚酶链式反应多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)(polymerase chain reaction)简称简称PCRPCR技术，技术，是是8080年代中期发展起来的一种体外扩增特异年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNADNA片段的技片段的技术。此法操作简便，术。此法操作简
2、便，可在短时间内在试管中获得数百万个可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的特异的目的DNADNA序列的拷贝，序列的拷贝，PCRPCR技术虽然问世仅数年时技术虽然问世仅数年时间，间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。泛的应用。二、二、16S rDNA 的的PCR扩增扩增PCRPCR技术实际上是模拟体内技术实际上是模拟体内DNAD
3、NA合成过程，是合成过程，是在模板在模板DNADNA，引物和种脱氧核苷酸存在的条件引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于下依赖于DNADNA聚合酶的酶促合反应，聚合酶的酶促合反应，PCRPCR技术的特技术的特异性取决于引物和模板异性取决于引物和模板DNADNA结合的特异性。结合的特异性。反应反应分三步：变性（分三步：变性（denaturationdenaturation）；退火）；退火（annealingannealing）；延伸（）；延伸（ex tensionex tension）。）。变性（变性（denaturation）：）：模板模板DNADNA经加热至经加热至95 95 左右一定时间后，
4、使模板左右一定时间后，使模板 DNA DNA双链双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。退火（退火（annealling）：）：将下降至适宜温度（一般较将下降至适宜温度（一般较TmTm低低5 5），引物与变性的），引物与变性的DNADNA单链（模板）在碱基互补的基础上形成引物单链（模板）在碱基互补的基础上形成引物-模板杂交双模板杂交双链。由于反应体系中引物浓度远远大于模板链。由于反应体系中引物浓度远远大于模板DNADNA浓度，且引浓度，且引物结构简单，这极大地限制了变性后模板物结构简单，这极大地限制了变性后模板DNADN
5、A单链之间的互单链之间的互补结合。补结合。延伸（延伸（extension）：）：将温度上升至在将温度上升至在7070左右时，左右时，TaqDNATaqDNA聚合酶催化以引物为聚合酶催化以引物为起始点的从起始点的从 5 5向向33端端 DNA DNA链延伸反应，随着链延伸反应，随着4 4种种dNTPdNTP(包括包括dATPdATP、dTTPdTTP、dGTPdGTP、dCTPdCTP)的掺入，合成新的的掺入，合成新的DNADNA互补链。互补链。16SrDAN16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基是编码原核生物核糖体小亚基rRNArRNA（16SrRNA16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究
6、中最常用、最有）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的用的“分子钟分子钟”。16SrRNA16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，缘关系，16SrRNA16SrRNA的大小为的大小为1500bp1500bp左右，所含信息能反映左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在目前常用的是建立在PCRPCR技术基础上的技术基础上的16SrRNA16SrRNA基因的基因的直接测序法，方便快捷。直接测序法，方便快捷。较之较之5S 5S 和和23SrDNA23SrD
7、NA等看家基因而异，它具有分子大等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石细菌化石”之称。之称。其序列包含其序列包含1010个可变区（个可变区（variable regionvariable region）和与之相）和与之相同的同的11 11个恒定区（个恒定区（constant regionconstant region），可变区因细菌而异，），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。且变异程度与细菌的系统发育密切相关。注：V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9为可变区位置。F27、R534，F357、R926，F
8、968、R1492为三对扩增引物。核苷酸序列及其位置是以大肠埃希菌为参考序列。DNA DNA模板模板 引物引物 耐热聚合酶反应缓冲液耐热聚合酶反应缓冲液 dNTPdNTP 含含Mg2Mg2、DNADNA模板：反应中模板：反应中DNADNA量在量在50ng50ng200ng200ng左右。且左右。且DNADNA纯度较高，纯度较高，以增加反应特异性。以增加反应特异性。、dNTP:dNTP:反应体系中达反应体系中达100M100M200M200M。、Mg2+Mg2+：Mg2+Mg2+是是TaqTaq酶的辅基浓度在酶的辅基浓度在2.0mM2.0mM左右，左右，浓度太低浓度太低TaqTaq酶活力降低；太
9、高反应特异性降低。酶活力降低；太高反应特异性降低。、引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约、引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约2020碱基左右；含量在碱基左右；含量在40407070之间；引物内部之间；引物内部不能有回该序列；引物不能有回该序列；引物端不能互补。端不能互补。、TaqTaq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性DNADNA聚合聚合酶，在酶，在9595时时3030分钟还有分钟还有5050活力。活力。n例如：艾伯特埃希菌例如：艾伯特埃希菌16S 16S rDNArDNA扩增扩增三、琼脂糖凝胶电泳三、琼脂糖凝胶电泳四、四、DNA测序及比对测序及比对
10、1 1、用、用DNA DNA 纯化试剂盒对纯化试剂盒对PCRPCR产物进行纯化，产物进行纯化，并送至测序公司进行序列测定。并送至测序公司进行序列测定。2 2、将测序得到的、将测序得到的16S DNA16S DNA的序列在的序列在NCBINCBI进行进行blastblast比对，选择与比对序列高度相似的菌株。比对，选择与比对序列高度相似的菌株。3 3、将选择的序列与测序的序列用、将选择的序列与测序的序列用MEGAMEGA软件构软件构建菌株进化树。建菌株进化树。4.4.用于发现细菌新种类用于发现细菌新种类5.The5.The MicroSeq 500 16S rDNAMicroSeq 500 16
11、S rDNA细菌鉴定系统细菌鉴定系统3.3.用于鉴定血液培养的细菌用于鉴定血液培养的细菌2.2.用于区分进化关系密切的细菌用于区分进化关系密切的细菌1.1.用于鉴定难以培养的细菌用于鉴定难以培养的细菌五、基于五、基于16S rDNA的应用的应用六、六、16S rDNA的不足的不足1 1、有的菌种由于种间差异小，单独依靠、有的菌种由于种间差异小，单独依靠16SrDNA16SrDNA鉴定鉴定不能鉴定到种。需要其它鉴定方法补充。不能鉴定到种。需要其它鉴定方法补充。2 2、16SrDNA 16SrDNA鉴定是基于鉴定是基于PCRPCR的鉴定方法，与其它的鉴定方法，与其它PCRPCR鉴定方法一样存在容易污染，获得假阳性结果，应注鉴定方法一样存在容易污染，获得假阳性结果，应注意做好阴性对照。意做好阴性对照。
