1、1 第十一章第十一章 疾病产生的分子基础疾病产生的分子基础 Chapter11 Molecular Basis of Chapter11 Molecular Basis of Diseases Development Diseases Development 汤立军汤立军中南大学生命科学学院中南大学生命科学学院分子生物学研究中心分子生物学研究中心2u人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等发生和发展都涉及到有关蛋白血压等发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作质及其复合物的结构、功能
2、和相互作用异常。用异常。u疾病的本质是蛋白质功能紊乱，基本疾病的本质是蛋白质功能紊乱，基本原理是各种原因引起蛋白质质和量的原理是各种原因引起蛋白质质和量的改变。改变。3 1 1.基因结构的改变；基因结构的改变；2 2.受细胞调节因素或其受细胞调节因素或其它因素影响使基因的表它因素影响使基因的表达发生改变；达发生改变；3 3.外来的致病基因；外来的致病基因；4 4.蛋白质翻译后加工及蛋白质翻译后加工及蛋白质降解发生变化。蛋白质降解发生变化。蛋白质功能紊乱的原因各不相同，具有不同蛋白质功能紊乱的原因各不相同，具有不同分子机制。分子机制。4第一节第一节 基因结构改变与疾病基因结构改变与疾病 第二节第
3、二节 细胞间信号异常与疾病细胞间信号异常与疾病第三节第三节 细胞内因素与疾病细胞内因素与疾病第四节第四节 翻译后加工运输障碍与疾病翻译后加工运输障碍与疾病第五节第五节 蛋白质降解异常与疾病蛋白质降解异常与疾病第六节第六节 病原微生物基因引起的疾病病原微生物基因引起的疾病第七节第七节 疾病分子机制的研究策略疾病分子机制的研究策略5第一节第一节 基因结构改变与疾病基因结构改变与疾病一、基因突变一、基因突变二、基因突变的遗传学效应二、基因突变的遗传学效应三、结构基因变异导致的疾病三、结构基因变异导致的疾病四、调控序列变异导致基因表达水平变化四、调控序列变异导致基因表达水平变化6一一、基因突变的多种类
4、型基因突变的多种类型1.点突变点突变是单个碱基的替换是单个碱基的替换2.缺失缺失是一个或多个核苷酸的丢失是一个或多个核苷酸的丢失3.插入插入是一个或多个核苷酸的增加是一个或多个核苷酸的增加4.倒位倒位是一段核苷酸序列染色体位置的改变是一段核苷酸序列染色体位置的改变5.基因突变还分为基因突变还分为配子突变配子突变与与体细胞突变体细胞突变6.动态突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递指串联重复拷贝数随世代的传递而改变而改变7例脆性例脆性X综合征综合征 “CCG”“CCG”重复发生在重复发生在FMR1FMR1（脆性（脆性X X智力低下智力低下基因基因1 1）的）的5 5 非翻译区，拷贝数不稳定。非
5、翻译区，拷贝数不稳定。850拷贝拷贝(正常人正常人)52200拷贝拷贝(携带者携带者)2001000拷贝拷贝(患者患者)8强直性肌营养不良强直性肌营养不良 DMPKDMPK基因基因3 3非翻译区非翻译区CTGCTG三核苷酸序列异常重复扩增超过三核苷酸序列异常重复扩增超过100100（正常人为（正常人为5 5 4040），重复数目与症状严重性相关），重复数目与症状严重性相关 ；HuntingtonHuntington舞蹈病舞蹈病 huntingtonhuntington基因内的基因内的CAGCAG三核苷酸序列异常重复扩增，亨廷顿病患者三核苷酸序列异常重复扩增，亨廷顿病患者3535100100个或
6、更多（正常人为个或更多（正常人为11113030）；）；FriedreichFriedreich共济失调症共济失调症 内含子内含子CAACAA拷贝数过度拷贝数过度增加。增加。91 1.碱基置换突变碱基置换突变(substitution mutation)substitution mutation)二、不同的基因突变引起不同的遗传效应二、不同的基因突变引起不同的遗传效应a.错义突变(missense mutation)b.b.无义突变无义突变(nonsense mutation)nonsense mutation)c.c.同义突变同义突变(consenseconsense mutation)mu
7、tation)10a.a.错义突变错义突变（missensemissense mutation mutation）指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不表现出明显的表型效应。活性，不表现出明显的表型效应。11b.b.无义突变无义突变(nonsense mutation)nonsense mutation)l亮氨酸的密码子亮氨酸的密码子UUAUUA，中间的，中间的U U变为变为A A这样一这样一个碱基变化就会成为（终止密码子）个碱基变化就会成为（终止密码子）UAAUAA
8、。l酪氨酸的密码子是酪氨酸的密码子是UACUAC，置换突变使，置换突变使UACUAC变变为密码子为密码子UAGUAG后翻译便后翻译便终终止。止。UAG、UGA、UAA终止密码子终止密码子12c.c.同义突变同义突变(synonymous mutation)(synonymous mutation)：密码：密码子发生改变子发生改变,但所编码的氨基酸不变。但所编码的氨基酸不变。例如：例如：CUUCUU CUCCUC CUGCUG 亮氨酸亮氨酸13 2 2.缺失或插入突变缺失或插入突变(deletion or insertion deletion or insertion mutation)muta
9、tion)a.a.密码子缺失或插入密码子缺失或插入 b.b.移码突变移码突变(frame-shift mutation)frame-shift mutation)c.c.整基因或大片段缺失整基因或大片段缺失 14a.a.密码子缺失或插入密码子缺失或插入CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys SerCTG ACT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Glu Glu Lys SerCTG ACT CC G GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Lys SerC CT CCT GAG GAG AAG TCT
10、 Pro Pro Glu Glu Lys Ser15b.b.移码突变移码突变CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser TG ACT CCT GAG GAG AAG TCT TGA CTC CTG AGG AGA AGT CT CT ACT CCT GAG GAG AAG TCTCTA CTC CTG AGG AGA AGT CT Leu Leu Leu Arg Arg Ser 插入或缺失带来的无义突变插入或缺失带来的无义突变CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys
11、 Ser163 3.融合突变融合突变(fusion mutation)fusion mutation)细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对因间错位配对,产生两种含不同等位基因的染色体。产生两种含不同等位基因的染色体。171819白血病中部分常见的融合基因白血病中部分常见的融合基因204.4.基因突变影响基因突变影响 hnRNAhnRNA 的剪接的剪接 基因突变发生在基因突变发生在 hnRNAhnRNA 的一级结构上的一级结构上特定的剪接位点上，特定的剪接位点上，形成新的剪接位点形成新的剪接位点或或使使正常剪接位点消失正常剪接位点消失，导致，导
12、致 hnRNAhnRNA 的剪接错的剪接错误，产生异常的误，产生异常的 mRNAmRNA，最终产生异常的蛋最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。白表达产物，改变生物性状。21真核生物基因的剪接位点：真核生物基因的剪接位点：由内含子的由内含子的55端端“GTGT”和和33端端“AG”AG”，及，及内含子和外显子内的其它调控元件共同决定。内含子和外显子内的其它调控元件共同决定。EXON1INTRON1EXON2EXON1EXON2EXON1INTRON1EXON2hnRNASplicing?YesNo22例：家族性孤立性生长激素缺乏例：家族性孤立性生长激素缺乏型遗传病型遗传病 由于由于GH-1
13、GH-1基因的基因的EXONEXON上第上第5nt5nt由由G GA A，破坏一个破坏一个ESEESE，使，使EXONEXON被跳过，而最终造成被跳过，而最终造成编码蛋白缩短，影响功能。编码蛋白缩短，影响功能。23转入了人缺陷型转入了人缺陷型的的GH-1GH-1基因基因利用利用RNAiRNAi使导使导入基因沉默入基因沉默2007年2425三三 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病 结构基因发生改变会改变蛋白质的一结构基因发生改变会改变蛋白质的一级结构，进而改变蛋白质的理化性质。级结构，进而改变蛋白质的理化性质。26 1 1.蛋白质结构变化引起的疾病蛋白质结构变化
14、引起的疾病（1 1）血红蛋白病血红蛋白病(hemoglobinopathyhemoglobinopathy)27血红蛋白结构血红蛋白结构l血红蛋白是由血红蛋白是由4 4条肽链（两个条肽链（两个和两个和两个链）组链）组成的。每条肽链成的。每条肽链都类似于肌红蛋都类似于肌红蛋白的肽链，都结白的肽链，都结合一个血红素。合一个血红素。28血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症2930基因突变类型基因突变类型异常异常Hb氨基酸变化氨基酸变化临床特征临床特征错义突变错义突变Hb Shuangfeng27GluLys(GAGAAG)不稳定不稳定Hb病病Hb S6GluVal(GAGGUG)镰刀
15、型细胞镰刀型细胞贫血贫血Hb Bibba136LeuPro(CUGCCA)不稳定不稳定Hb病病无义突变无义突变Hb Mckees Rocks145Tyr终止终止(UAUUAA)不稳定不稳定Hb病病终止密码突变终止密码突变Hb Constant Spring142UAACAA(延长：延长：142Gln-173)-地贫地贫血红蛋白病分子基础血红蛋白病分子基础31基因突变类型基因突变类型 异常异常Hb氨基酸变化氨基酸变化临床特征临床特征密码子缺失密码子缺失Hb Gun Hill9195缺失缺失不稳定不稳定Hb病病密码子插入密码子插入Hb Grady118与与119间插入间插入3个氨个氨基酸基酸无明显
16、症状无明显症状移码突变移码突变Hb Tak147UAAACUAA延长：延长：Thr-158UAA不稳定不稳定Hb病病融合突变融合突变Hb Lepore-Boston87(Gln)-116(His)-地贫地贫Hb Kenya81(Leu)-86(Ala)-地贫地贫血红蛋白病分子基础血红蛋白病分子基础32（2 2）家族性高胆固醇血症）家族性高胆固醇血症一种常染色体显性遗传疾病，其特征为低一种常染色体显性遗传疾病，其特征为低密度脂蛋白（密度脂蛋白（LDLLDL）-胆固醇水平明显升高，可胆固醇水平明显升高，可出现黄色瘤和动脉硬化症。出现黄色瘤和动脉硬化症。病因：肝脏表面特异性的病因：肝脏表面特异性的L
17、DL-LDL-受体数目受体数目减少或缺乏，导致肝脏对血循环中减少或缺乏，导致肝脏对血循环中LDL-LDL-胆固醇胆固醇的清除能力下降，进而引起血循环中的清除能力下降，进而引起血循环中LDL-LDL-胆固胆固醇水平升高。醇水平升高。33 LDL LDL 受体基因变异，导致其编码蛋白结构异受体基因变异，导致其编码蛋白结构异常，功能下降或完全丧失。常，功能下降或完全丧失。配体结合结构域，由配体结合结构域，由LDLLDL受体蛋白受体蛋白N N端端292292个个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸。该结构中有氨基酸残基组成，富含半胱氨酸。该结构中有7 7个由个由4040个氨基酸残基组成的重复序列个氨基酸残基组
18、成的重复序列(天冬天冬-半胱半胱-X-X-天冬天冬-甘甘-丝丝-天冬天冬-谷谷)，每个重复序列中含有，每个重复序列中含有6 6个半胱氨酸残基，全部个半胱氨酸残基，全部4242个半胱氨酸。个半胱氨酸。341.配体结合配体结合 结构域结构域2.EGF前体前体 结构域结构域3.含糖基含糖基 结构域结构域4.跨膜结构域跨膜结构域5.胞液结构域胞液结构域LDL LDL 受体受体ABNH2 Cys 1 2 3 4 5 6 7CCOOH352 2.蛋白质合成量变化引起的疾病蛋白质合成量变化引起的疾病36人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构37 珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因珠蛋白
19、基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控，表现为以下特点：素的精确调控，表现为以下特点：v 组织特异性组织特异性v 发育阶段特异性发育阶段特异性v 协同性协同性38-地贫基因缺失类型地贫基因缺失类型12正常正常基本基本正常正常+轻度轻度贫血贫血+轻度轻度贫血贫血0高度高度贫血贫血+0Hb Barts综合征综合征 0 039珠蛋白结构基因突变抑制珠蛋白结构基因突变抑制珠蛋白合成使珠蛋白合成使珠珠蛋白量减少甚至完全缺失蛋白量减少甚至完全缺失,引起引起-地贫地贫u第第1717位赖氨酸密码子位赖氨酸密码子AAG(Lys)AAG(Lys)TAG,TAG,发生无义突发生无义突变变,引起引起0 0地贫地贫;
20、u珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失1 1、或、或个核苷酸，会使突变点以后的读码框遭到破坏，往往个核苷酸，会使突变点以后的读码框遭到破坏，往往造成造成-珠蛋白肽链合成提前终止，而引起珠蛋白肽链合成提前终止，而引起0 0地贫。地贫。40四、调控序列变异导致基因表达水平变化四、调控序列变异导致基因表达水平变化 顺式作用元件的基因突变，会降低顺式作用元件的基因突变，会降低珠蛋白基因的珠蛋白基因的转录，使转录，使珠蛋白合成减少，引起珠蛋白合成减少，引起+-地贫。地贫。TATA盒：盒：-32（CA)、-30(TC)、-29(AG)、-28(AG)。CAAT盒：盒：-101、
21、-92、-88、-87、-86等位点的点突变。等位点的点突变。CAATTATACAP PolyA 尾尾1 30 31 104 105 14653 IVS IVSIS41l启动子和外显子启动子和外显子1 1之间大于之间大于1010kbkb的缺失的缺失;l另一种是启动子和外显子另一种是启动子和外显子1 1之间大于之间大于6 6kbkb的缺失。的缺失。两种突变都使两种突变都使LDLLDL受体基因的表达能力完全丧失。受体基因的表达能力完全丧失。LDLLDL受体启动子变异受体启动子变异42 一些内含子的变异也会影响蛋白质的合一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。成，使体内
22、相应蛋白质含量减少或缺失。Apo B100 Apo B100 基因内含子的第一个碱基会基因内含子的第一个碱基会发生发生G GT T突变，突变基因转录后生产的突变，突变基因转录后生产的hnRNAhnRNA，会影响会影响Apo B100 mRNAApo B100 mRNA的正常剪切。的正常剪切。43第二节第二节 细胞间信号异常导致基因细胞间信号异常导致基因 表达异常引起疾病表达异常引起疾病 人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。因表达也受到细胞间信
23、号的调控。44AFP AFP 接受异常细胞增殖信号成为肝癌发生的接受异常细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素重要因素u胚胎发育过程中胚胎发育过程中,AFP,AFP增强子激活增强子激活,而沉寂子处于而沉寂子处于抑制状态。抑制状态。u胎儿出生后胎儿出生后,AFP,AFP沉寂子处于活化状态沉寂子处于活化状态,阻碍增强阻碍增强子的启动效应。子的启动效应。u在异常细胞增殖信号的作用下在异常细胞增殖信号的作用下,c-mycc-myc、c-fosc-fos、c-junc-jun等癌基因表达异常增加等癌基因表达异常增加,其表达产物与其表达产物与 AFPAFP基基因顺式作用元件结合因顺式作用元件结合,激活激活 A
24、FPAFP基因表达。基因表达。45粉尘刺激粉尘刺激 肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞 分分泌泌TGF-TGF-1 1 成纤维细胞成纤维细胞 促细胞分裂和促细胞分裂和ECM ECM 蛋蛋白基因表达白基因表达 ECM ECM 增加增加 矽肺发生矽肺发生尘肺是由于长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘肺是由于长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘引起的以肺纤维化为主要病变的疾病尘引起的以肺纤维化为主要病变的疾病46第三节第三节 细胞内因素导致基因细胞内因素导致基因 表达异常引起疾病表达异常引起疾病l 异常的细胞内信号异常的细胞内信号 持续高血糖引起的糖尿病心肌病持续高血糖引起的糖尿病心肌病 高血
25、糖高血糖 内皮细胞二酰甘油内皮细胞二酰甘油(DAG)PKC (DAG)PKC （血管紧张素转换酶）（血管紧张素转换酶）ACE ACE AngAng 心肌重塑、心肌重塑、心肌肥大。心肌肥大。47l异常的异常的DNADNA甲基化（不同的甲基化（不同的DNADNA甲基化模式形成不甲基化模式形成不同的表观遗传特征）同的表观遗传特征）hCG5转录起始区低甲基化低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合 cAMP Tumor 48Proteins complexed with DNA allow for more“open”structure;can be transcribed.Methylation lea
26、ds to change in chromatin structure;more condensed state is transcriptionally inactivegenes are“off”49第四节第四节 翻译后加工运输障碍与疾病翻译后加工运输障碍与疾病50 白化白化 Albinism 51酪氨酸酶与酪氨酸酶与型泛素性白化病型泛素性白化病酪氨酸酶催化结构域点突变可以使酪氨酸酶的酪氨酸酶催化结构域点突变可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失活性降低甚至消失,黑色素合成减少或不能合成黑色素合成减少或不能合成,导致导致型泛素性白化病型泛素性白化病;酪氨酸酶催化结构域以外的点突变也能导致色酪氨酸
27、酶催化结构域以外的点突变也能导致色素缺失素缺失,蛋白质不能正确折叠蛋白质不能正确折叠.没有正常折叠的酪没有正常折叠的酪氨酸酶不能从内质网输出而滞留在内质网氨酸酶不能从内质网输出而滞留在内质网,无法完无法完成其成熟及运输过程。成其成熟及运输过程。52蛋白转运异常蛋白转运异常酪氨酸酶酪氨酸酶P蛋白蛋白高尔基体高尔基体黑色素体黑色素体P蛋白基因突变蛋白基因突变黑色素合成障碍黑色素合成障碍引起引起型泛发性型泛发性白化病白化病内质网内质网酪氨酸酶与酪氨酸酶与型型泛素性白化病泛素性白化病53第五节第五节 蛋白质降解异常与疾蛋白质降解异常与疾病病54蛋白质降解途径蛋白质降解途径 u溶酶体途径，降解细胞吞入的
28、胞外蛋白质溶酶体途径，降解细胞吞入的胞外蛋白质u泛素泛素-蛋白酶体途径，降解胞内泛素化的蛋白质蛋白酶体途径，降解胞内泛素化的蛋白质 泛素泛素(ubiquitinubiquitin,UbUb)E1(E1(特异性泛素激活酶特异性泛素激活酶)E2(E2(泛素结合酶泛素结合酶),),E3(E3(泛素连接酶泛素连接酶)蛋白酶体蛋白酶体(proteasomeproteasome)蛋白的降解蛋白的降解5556泛素泛素-蛋白酶体系统活性被异常抑制或激活均可导蛋白酶体系统活性被异常抑制或激活均可导致机体紊乱。致机体紊乱。2004 年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖阿龙切哈诺沃(AaronCiechanover)阿夫拉
29、姆赫什科(AvramHershko)欧文罗斯(IrwinRose)57高血脂高血脂:载脂蛋白的过度降解载脂蛋白的过度降解泛素泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起到重要蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起到重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。Apo A,Apo B100,Apo E,etc.58阿尔茨海默病阿尔茨海默病:蛋白酶体活性的抑制蛋白酶体活性的抑制 阿尔茨海默病（阿尔茨海默病（Alzheimers disease,AD）是）是一种中枢神经系统退行性病变的疾病。临床上首一种中枢神经系统退行性病变的疾病。临床上首先表现
30、为近期记忆力降低先表现为近期记忆力降低,继而表现持续性智能衰继而表现持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失退、失语、判断推理能力丧失,以及运动障碍等。以及运动障碍等。AD最显著的神经病理组织学特征是老年斑和神经最显著的神经病理组织学特征是老年斑和神经原纤维缠结。现已发现原纤维缠结。现已发现,-淀粉样蛋白淀粉样蛋白在老年斑的在老年斑的形成过程中起十分重要的作用形成过程中起十分重要的作用。59第六节第六节 病原微生物基因引起的疾病病原微生物基因引起的疾病u感染引起机械或生物学损伤；感染引起机械或生物学损伤；u争夺营养造成营养缺乏；争夺营养造成营养缺乏；u毒素引起细胞代谢功能异常；毒素引起细胞代谢功
31、能异常；u基因整合到宿主基因组，造成基因结构改基因整合到宿主基因组，造成基因结构改 变和表达异常。变和表达异常。60第七节第七节 基因结构和表达与疾病的研究策略基因结构和表达与疾病的研究策略1.通过基因结构分析确定基因变异通过基因结构分析确定基因变异 核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、化学切割错配、酶促切割错配化学切割错配、酶促切割错配3.通过功能学研究确定致病基因通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、转基因技术、基因敲除、反义技术、基因诱导超表达反义技术、基因诱导超表达2.基因表达水平分析基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析差异
32、显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析61 基本原理基本原理:在一定条件下，异源双链核酸分子在一定条件下，异源双链核酸分子RNARNA：RNARNA或或RNARNA：DNADNA中错配碱基可被核糖核酸酶中错配碱基可被核糖核酸酶RNaseRNase识识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。即可确定错配的位置。一、基因结构分析一、基因结构分析1 1.核糖核酸酶切分析核糖核酸酶切分析（RNaseRNase cleavage cleavage）62GCATACGTAT野生型野生型5335突变型突变型GCTTACGAAT3355异源杂合异源
33、杂合双链酶切双链酶切GCAUACGTAT35353535GCAUACGAAT？体外合成体外合成RNA探针探针GCAUA53野生型探针野生型探针1 163GCATACGTAT野生型野生型5335突变型突变型GCTTACGAAT3355异源杂合异源杂合双链酶切双链酶切TATGCATACG35353535TATGCATTCG体外合成体外合成RNA探针探针TATGC53野生型探针野生型探针2 264未发生酶切未发生酶切发生酶切发生酶切电泳分离电泳分离65缺点：缺点：当当RNARNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；酶切割效率低甚至不切割；分析分
34、析DNADNA的一条链，突变检出率为的一条链，突变检出率为 30%30%；同时；同时分析分析DNADNA的两条链，突变检出率为的两条链，突变检出率为 70%70%；需要制备特异性的需要制备特异性的RNARNA探针探针66 2 2.杂合双链分析法杂合双链分析法（heteroduplexheteroduplex analysis,HA analysis,HA）直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型野生型DNADNA双链。由于突变型和野生型双链。由于突变型和野生型DNADNA形成的异源杂合双形成的异源杂合双链链DNADNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝
35、胶在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链中电泳时，会产生与相应同源双链DNADNA不同的迁移率。不同的迁移率。67杂合双链分析杂合双链分析（heteroduplexesheteroduplexes analysisanalysis）非变性非变性胶电胶电泳泳55 GC TACG AT缺失突变型缺失突变型 GCATA CGTAT野生型野生型533533 野生型野生型DNADNA探针与探针与 野生型野生型DNADNA杂交杂交GCATACGTATTATGCATACG55335533形成异源形成异源杂合双链杂合双链野生型野生型DNADNA探针与探针与缺失型缺失型DNAD
36、NA杂交杂交TATGCAT CGCG ATGCATA5335533568缺点：只适合缺点：只适合200200300bp300bp的片断的片断;不能确定突变的具体位置不能确定突变的具体位置;检出率一般只有检出率一般只有80%80%左右。左右。69 3 3.化学切割错配法化学切割错配法（Chemical cleavage of mismatch,CCMChemical cleavage of mismatch,CCM）基本原理：基本原理：将待测含将待测含DNADNA片段与相应的野生型片段与相应的野生型DNADNA片段或片段或RNARNA片段混合变性杂交。片段混合变性杂交。在异源杂合的双链核酸分子中
37、：在异源杂合的双链核酸分子中：错配的错配的C C能被羟胺和哌啶切割，能被羟胺和哌啶切割，错配的错配的T T能被四氧化锇切割，能被四氧化锇切割，变性凝胶电泳可确定是否存在突变。变性凝胶电泳可确定是否存在突变。70特点：特点：突变检出率高；突变检出率高；如使用荧光检测系统，灵敏度较如使用荧光检测系统，灵敏度较高；高；可检测长度达可检测长度达 2Kb2Kb的核酸片段；的核酸片段；步骤多、费时、有毒；步骤多、费时、有毒；714 4.酶促切割错配酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage)(enzyme mismatch cleavage)酶：酶：T4T4内切核酸酶内切核酸酶 VI
38、IVII识别的序列：识别的序列：DNA:DNADNA:DNA异源杂合分子异源杂合分子优点：最长检测片段可达优点：最长检测片段可达1.5kb1.5kb，省去体外合成，省去体外合成RNARNA探针的步骤探针的步骤缺点：会产生非特异性切割，对错配位点的识缺点：会产生非特异性切割，对错配位点的识别也不是别也不是100%100%72测序：双脱氧自动化序列分析测序：双脱氧自动化序列分析SSCPSSCP：单链构象多态性分析：单链构象多态性分析RFLPRFLP：限制性酶切长度多态性：限制性酶切长度多态性DNADNA芯片技术芯片技术AS-PCRAS-PCR技术技术ASOASOMS-PCRMS-PCRDGGEDG
39、GE等等73 二、基因表达系列分析二、基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression,Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)SAGE)是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法法(VelculescuVelculescu et al.,1995)et al.,1995)。SAGESAGE原理原理:分离每个转录本特定位置的较短单一的序列分离每个转录本特定位置的较短单一的序列标签（约标签（约9-19-11 1个碱基对），这些短的序列被连接、克隆个碱基对），这些短的序列被连接
40、、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。的表达丰度。74Serial analysis of gene expression(SAGE)技术流程技术流程反转录反转录酶切酶切连接连接测序测序单条测序对单条测序对3040条条EST测序测序分析分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等基因表达量分析、寻找新基因等等75三、基因功能的研究三、基因功能的研究 转基因技术转基因技术 基因打靶基因打靶 反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸技术 反义反义RNARNA
41、技术技术 核酶技术核酶技术 RNARNA干扰技术干扰技术 基因诱导超表达技术基因诱导超表达技术反义技术反义技术761 1.转基因技术转基因技术 指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。活性物质，从而使受体生物获得新的性状。77 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。之发育成个体。转基因转基
42、因 被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物78转基因动物操作技术流程转基因动物操作技术流程 获取外源目的基因 含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物简明操作步骤79 转基因动物实例一超级奶牛普通奶牛的三倍大（英国）80转基因动物实例二东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因转基因”克隆猪克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆绿色
43、荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆 81转基因动物实例三转基因动物实例三转绿色荧光蛋白的兔82转基因动物实例四转基因动物实例四正在进行转基因山羊的实验 乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊 上海交通大学医学遗传研究所上海交通大学医学遗传研究所83just a joke 842.基因打靶基因打靶(gene targeting)(gene targeting)通过通过DNADNA定点同源重组，改变基因组中的定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。因的功能。基因敲除基因敲除(gene knockout)(gene knockout)：定向敲
44、除定向敲除 基因敲入基因敲入(gene(gene knockinknockin)：定向替代定向替代85 MarrioMarrio CapecchiCapecchi于八十年代末在于八十年代末在UtahUtah大学发展起大学发展起来。实验动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小来。实验动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠鼠就称为敲除小鼠(knockout mice)(knockout mice)。基因敲除技术是研究基因功能的一项非常有用的技基因敲除技术是研究基因功能的一项非常有用的技术术(遗传病研究、研究特定基因的细胞生物学活性遗传病研究、研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的
45、基因作用）。以及研究发育调控的基因作用）。基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。离培养、转基因等。86基因打靶的必备条件基因打靶的必备条件 胚胎干细胞胚胎干细胞(ES(ES细胞细胞)能在体外培养，保留发育的全能性能在体外培养，保留发育的全能性 打靶载体打靶载体NeoNeo（新霉素）阳性筛选标志新霉素）阳性筛选标志HSV-HSV-tktk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(herpes simplex virus)胸腺嘧啶胸腺嘧啶激酶激酶(thymidinethymi
46、dine kinasekinase)87基因敲除的基本程序基因敲除的基本程序 打靶载体的构建打靶载体的构建 打靶载体导入打靶载体导入ESES细胞：重组置换细胞：重组置换 基因敲除基因敲除ESES细胞注射入胚泡细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中胚泡植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种嵌合体的杂交育种8889美国犹他大学美国犹他大学Mario R.Capecchi 美国北卡罗来纳州大学美国北卡罗来纳州大学Oliver Smithies 英国卡迪夫大学英国卡迪夫大学 Martin J.Evans 2007年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖:基因打靶基因打靶 903 3.反义技术反义
47、技术91u 核酶技术确定基因在疾病中的作用核酶技术确定基因在疾病中的作用（1 1）RNA RNA分子，催化核糖体分子，催化核糖体RNARNA中内含子的自我中内含子的自我拼接；除了催化拼接；除了催化RNARNA的剪切，还可催化的剪切，还可催化DNADNA的剪的剪切、切、RNARNA的聚合、的聚合、RNARNA链的复制等。链的复制等。（2 2）优点优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成物结合常形成“发夹发夹”结构或结构或“锤头锤头”结构。结构。（3 3）设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。酶活性进行剪切
48、。92核酶的作用机制核酶的作用机制 93 与一般的反义与一般的反义RNARNA相比，核酶具有较稳相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到定的空间结构，不易受到RNARNA酶的攻击。更酶的攻击。更重要的是，核酶在切断重要的是，核酶在切断mRNAmRNA后，又可从杂后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNAmRNA分子。分子。94u 反义反义RNARNA技术技术 antisense RNAantisense RNA 自身没有编码功能，但能与目标自身没有编码功能，但能与目标RNARNA特别是特别是mRNAmRNA的特定区域互补结合的一类的特定区域互补
49、结合的一类RNA;RNA;自然存在，或人工生物合成。自然存在，或人工生物合成。95u 反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸技术(antisense(antisense oligonucleotideoligonucleotide,ASON),ASON)人工合成的能与目的人工合成的能与目的DNADNA或或RNARNA互补的寡核苷酸（互补的寡核苷酸（15-15-20nt20nt）。）。肽核酸肽核酸 (peptide nucleic acid,PNA)(peptide nucleic acid,PNA)核酸分子中的磷酸二酯键骨架被酰胺键骨架核酸分子中的磷酸二酯键骨架被酰胺键骨架取代，具有更强的稳定性。取代，
50、具有更强的稳定性。964.RNA4.RNA干扰（干扰（RNA interferenceRNA interference，RNAiRNAi）内源性或外源性双链内源性或外源性双链RNARNA介导的细胞内介导的细胞内mRNAmRNA发生特异发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。表型的缺失现象。97共抑制现象的发现共抑制现象的发现 研究的早期线索早在研究的早期线索早在2020年前年前,来自于美国和荷兰的来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组两个转基因植物实验组Rich JorgensenRich Jorgensen和同事和同事,
