1、 基因治疗几个发展时期基因治疗几个发展时期1980-1989 准备期准备期 技术、宗教，伦理，法律技术、宗教，伦理，法律1990-1995 狂热期狂热期公众，媒体公众，媒体1996-至今至今 理性期理性期出现临床结果出现临床结果 早期期望值过高，目前理论研究和技早期期望值过高，目前理论研究和技术的发展水平均还不能满足成功临床试术的发展水平均还不能满足成功临床试验的需要，安全性问题还一直没有彻底验的需要，安全性问题还一直没有彻底解决。然而，目前对许多疾病分子机制解决。然而，目前对许多疾病分子机制和对基因载体的研究取得了长足的进步，和对基因载体的研究取得了长足的进步，为基因治疗较大范围临床试验开展
2、打下为基因治疗较大范围临床试验开展打下了坚实的基础。了坚实的基础。选择选择 在治疗上合适的基因在治疗上合适的基因已知其在某已知其在某特定疾病中的病理、生理作用特定疾病中的病理、生理作用适当的基因导入系统适当的基因导入系统病毒或非病病毒或非病毒载体毒载体临床前试验的有效性和安全性评价临床前试验的有效性和安全性评价临床实验的有效性检测手段临床实验的有效性检测手段Cardiac ischaemia(Heart)VEGF gene(vascular growth factor),plasmid,intracardiac2000 J.IsnerLimb ischaemia(Hands,Feet)VEGF
3、 gene(vascular growth factor),plasmid,intramuscular1998 J.IsnerSCID(Immunodeficiency)IL2R gene(gamma-C receptor)retrov.,ex vivo BM2000 A.FischerHaemophilia B(Blood)FIX,RV,Skin fibroblast,腹部皮下移植,1991,复旦大学Factor IX gene(clotting factor),aav,adenoIII,intramuscular1999-2000 M.Kay,K.High1992，Jerry Hsueh(
4、薛京伦）Cystic Fibrosis(Lung,Pancreas)CFTR gene(chlorine transpor-ter),retrov.,aav,adenoII,localno significant resultsin spite of several trialsADA deficiency(Immunodeficiency)ADA normal gene(enzyme)retrovirus,ex-vivo BM1990 F.Anderson,2002 C.BordignonDiseasetransferred functionClinical Resultsadditiona
5、l popular and emerging examples:Morbus Gaucher,Morbus Parkinson,Crigler Njiar,OTC deficiency,Duchennes MD,Restenosis control1.第一个基因治疗的遗传病第一个基因治疗的遗传病(1990):腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症。）缺乏症。ADA缺乏症是一种罕见的遗传病，患缺乏症是一种罕见的遗传病，患者者ADA基因缺陷，不能产生功能性基因缺陷，不能产生功能性ADA酶。酶。ADA缺乏的孩子一出生就有缺乏的孩子一出生就有严重的免疫缺陷，十分容易受感染，严重的免疫缺陷，十分容易受感
6、染，需要在几乎无菌的环境中生存。需要在几乎无菌的环境中生存。ADA缺乏症能用缺乏症能用PEG-ADA治疗，但这种药治疗，但这种药物十分昂贵（物十分昂贵（60,000美元美元/年），而且年），而且必须通过持续静脉注射来维持疗效。必须通过持续静脉注射来维持疗效。DNA vaccine for cancer and infectious diseases示Ringers液注射组。早期期望值过高，目前理论研究和技术的发展水平均还不能满足成功临床试验的需要，安全性问题还一直没有彻底解决。进展 展望理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系）3）以其他载体系统进行血友病B基因治疗1999-2000 M.采用
7、Western dot-blot分析表明，于肌肉注射rAAV/hFIX病毒子后第15天，小鼠血液中即开始出现抗hFIX抗体，血浆中hFIX水平亦开始下降.1）1991年，复旦大学反转录病毒介导的ex vivo途径临床试验取得了安全有效的结果1990-1995 狂热期公众，媒体血友病B:5000ng/ml血友病A 有10-40%的人群产生抑制物其症状表现为自发性出血，严重者可因关节出血导致关节变形和残废甚至死亡。这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越的基因治疗的原因之一！外源性基因替补疗法 输注外源性抑癌基因p53可抑制或杀灭癌细胞。ADAADA缺乏症被选为第一个基因治疗试验有缺乏症被
8、选为第一个基因治疗试验有以下几点原因：以下几点原因：单基因遗传病，功能清晰，基因小单基因遗传病，功能清晰，基因小基因调控简单，只要基因调控简单，只要“开启开启”状态状态ADAADA酶量无需精确调控：很少量的酶也酶量无需精确调控：很少量的酶也可使患者受益，酶量很多也能耐受。可使患者受益，酶量很多也能耐受。血友病目前的临床治疗方法：血友病目前的临床治疗方法：蛋白替代法：输血、输凝血酶原、注射重蛋白替代法：输血、输凝血酶原、注射重组组FVIII，FIX，能有效地改善出血症状和，能有效地改善出血症状和延长生命，但是昂贵，且存在感染延长生命，但是昂贵，且存在感染HIV，HBV（乙肝），（乙肝），HCV（
9、丙肝）风险（丙肝）风险蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效血友病血友病A 有有10-40%的人群产生抑制物的人群产生抑制物血友病血友病B 有有5%的人群产生抑制物的人群产生抑制物这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越的基因治疗的原因之一！的基因治疗的原因之一！血友病是目前血友病是目前SGT最有希望达到最有希望达到理想疗效的遗传病病种理想疗效的遗传病病种现行血友病现行血友病B治疗手段、效果不理想治疗手段、效果不理想单基因遗传病单基因遗传病不需要精确的表达调控，无需所有细胞表达不需要精确的表达
10、调控，无需所有细胞表达表达广谱表达广谱理想的动物模型（二个狗品系，理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系）个小鼠品系）疗效易于评价疗效易于评价血友病血友病A：100-200ng/ml血友病血友病B:5000ng/ml血友病血友病B基因治疗靶细胞选择基因治疗靶细胞选择ex vivo:In vivo:皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞直接、连续注射直接、连续注射角质细胞角质细胞内皮细胞内皮细胞上皮细胞上皮细胞成肌细胞成肌细胞造血干细胞造血干细胞骨髓基质细胞骨髓基质细胞支持细胞支持细胞 尽管人体天然的尽管人体天然的FVIII和和FIX都是由肝都是由肝细胞产生的。然而，实验证明，由非肝细胞产生的。然而，实
11、验证明，由非肝细胞如细胞如CHO产生的重组凝血因子与人体产生的重组凝血因子与人体天然的凝血因子在活性和免疫原性上没天然的凝血因子在活性和免疫原性上没有差别，到目前为止没有发现非肝细胞有差别，到目前为止没有发现非肝细胞产生的凝血因子有不同寻常的翻译后修产生的凝血因子有不同寻常的翻译后修饰。饰。因此，肝细胞不一定是血友病基因治因此，肝细胞不一定是血友病基因治疗必然的靶细胞。疗必然的靶细胞。1 1）19911991年，复旦大学反转录病毒年，复旦大学反转录病毒介导的介导的ex vivoex vivo途径临床试验取得途径临床试验取得了安全有效的结果了安全有效的结果反转录病毒载体反转录病毒载体XLIX 5
12、LTR FIX cDNA Neo S Ori P Ori 3LTRN2CMVIX5LTR Neo CMV FIX cDNA 3LTR 血友病血友病 B B 基因治疗临床试验比较基因治疗临床试验比较 患者患者 单位单位 载体载体 基因基因 启动子启动子 靶细胞组织靶细胞组织 治疗策略治疗策略 FIX:C(%)FIX:C(%)临床症状临床症状 治疗前治疗前 治疗后治疗后 LD LD 复旦复旦 RV hFIX LTR RV hFIX LTR 成纤维细胞成纤维细胞 ex vivo 2.2 5.9 ex vivo 2.2 5.9 出血出血,输血减少输血减少 LW LW 复旦复旦 RV hFIX LTR
13、RV hFIX LTR 成纤维细胞成纤维细胞 ex vivo 2.4 4.1 ex vivo 2.4 4.1 输血量减少输血量减少 Z ZL L 复旦复旦 RV hFIX CMV RV hFIX CMV 成纤维细胞成纤维细胞 ex vivo 1.8 4.1 ex vivo 1.8 4.1 按鼻止血按鼻止血;出出 血血,输血减少输血减少 XDF XDF 复旦复旦 RV hFIX CMV RV hFIX CMV 成纤维细胞成纤维细胞 ex vivo 1.5 3.2 ex vivo 1.5 3.2 改善不明显改善不明显 A A 宾大宾大 AAV hFIX EF AAV hFIX EF 肌肉肌肉 in
14、 vivo 1 in vivo 1 1.6 1.6 输血减少输血减少 50%50%B B 宾大宾大 AAV hFIX AAV hFIX EF EF 肌肉肌肉 in vivo 0.3 1 in vivo 0.3 1 输血减少输血减少 80%80%C C 宾大宾大 AAV hFIX EF AAV hFIX EF 肌肉肌肉 in vivo in vivo 没有变化没有变化 没有变化没有变化 蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效新的AAV 血清型 和慢病毒载体已成功 改进慢病毒,gutless Ad和不同血清Anderson,2002 C.缺乏创新性，各自为政,规模小,资金投入有限,缺乏中心的辐
15、射作用；血友病A 有10-40%的人群产生抑制物VSVG假型RV介导的hFIX cDNA在血友病B小鼠中的基因治疗（1）病毒性肝炎的基因治疗AAV-Hemophilia B3）以其他载体系统进行血友病B基因治疗血友病是目前SGT最有希望达到基因治疗研究和相关研究如基因组学,病毒学,免疫学,转基因动物,临床医学的结合不够；病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。以高剂量AAV病毒肌肉注射老鼠试验中，未引起组织毒性,所有动物脾大小正常，未发现囊泡区的增生。初级 人才流失,高级人才匮乏；VEGF gene(vascula
16、r growth factor),plasmid,intracardiac2）2003年，以年，以AAV-2/hFIX介导的直介导的直接肌肉注射，基因治疗血友病接肌肉注射，基因治疗血友病B方案方案已被批准临床试验（国家药品监督管已被批准临床试验（国家药品监督管理局药物临床批件，理局药物临床批件，2003L00403）ITR CMV hFIX minigene PA ITR ITR CMV mFIX PA ITRpAVChFIXmpAVCmFIXpAVChFIXmR重组重组AAV载体载体 ITR CMV hFIX R338A PA ITRmFIX level(ng/106cells/24 h)0
17、20040060080010001200140016001800pAVM2bAmFIXpAVM4bAmFIXpAVCmFIX293细胞HeLa细胞BHK细胞小鼠成肌细胞mFIX in vivo expression0100200300400500600700800-31329456589111135161187220281350days post injectionmFIX level(ng/ml)ABCDEFGHI 血友病小鼠经血友病小鼠经rAAV基因治疗后基因治疗后,FIX凝凝血活性提高血活性提高,出血症状改善出血症状改善3.2 40ul APTT 1007.5 50ul APTT 34采
18、用采用Western dot-blotWestern dot-blot分析表明，于肌分析表明，于肌肉注射肉注射rAAV/hFIXrAAV/hFIX病毒子后第病毒子后第1515天，小鼠天，小鼠血液中即开始出现抗血液中即开始出现抗hFIXhFIX抗体，血浆中抗体，血浆中hFIXhFIX水平亦开始下降水平亦开始下降.经经BethesdaBethesda分析分析,未发现抗小鼠未发现抗小鼠IXIX因子抗因子抗体体.0天天 3天天 15天天 27天天 39天天 阳性对照阳性对照抗抗IX因子抗体分析因子抗体分析肌注肌注FIX后，抗体在后，抗体在7天后开始明显增加，天后开始明显增加，15天时天时达到最高，约为
19、正常对照的达到最高，约为正常对照的8倍左右，到倍左右，到60天时抗天时抗体的量开始减少，为正常对照的体的量开始减少，为正常对照的5倍，此后到倍，此后到120天，抗体的量基本不变。天，抗体的量基本不变。抗抗AAV抗体检测抗体检测除了肝脏外，其他器官也可以用于产生 基因修复、RNA修复（Trans-ELISA方法检测微小腺病毒(miniAd)及第一代腺病毒(firstAd)介导cFIX在血友病B小鼠血浆中的表达2003 1;32(3):245-54.基因治疗研究和相关研究如基因组学,病毒学,免疫学,转基因动物,临床医学的结合不够；小鼠尾静脉大容量快速注射10g CMV-hFIX 质粒 DNA()，
20、注射后不同时间采血，通过ELISA检测血浆中hF的水平。也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细胞内，增强这些细胞的抗癌作用。血友病是目前SGT最有希望达到研究了肌肉注射重组AAV在体内的分布，分散程度与注射剂量成比例，主要分布在注射肌肉组织,经过半定量PCR发现肌肉中的载体数是其它组织的1,00010,000倍。Anderson,2002 C.杀伤性基因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶（HSV/TK）为代表；ITR CMV hFIX minigene PA ITR内源性因子合成和病毒载体引起的免疫 以外周内皮源细胞实施基因修饰的反应是血友病基因转移的潜在威胁 可能具有发展前景,aav,ade
21、noII,local这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越的基因治疗的原因之一！缺乏孵化和转化机制,更缺乏风险基金；血友病血友病 B B 基因治疗动物实验比较基因治疗动物实验比较 单单 位位 载体载体 基因基因 启动子启动子 动物模型动物模型 FIX FIX 表达表达 持续时间持续时间 症症 状状 FIX:Ag FIX:C FIX:Ag FIX:C (ng/ml)(%)(ng/ml)(%)复旦大学复旦大学 AAV hFIXm MCK AAV hFIXm MCK 血友病血友病 B B 小鼠小鼠 250 6.0 27 250 6.0 27 天天 出血减少出血减少 /ac/actin ti
22、n 肌肉注射肌肉注射 复旦大学复旦大学 AAV hFIXm CMV AAV hFIXm CMV 血友病血友病 B B 小鼠小鼠 482 34.2 13 482 34.2 13 周周 凝血凝血正常正常 R338A R338A 肌肉注射肌肉注射 复旦大学复旦大学 AAV mFIX CMV AAV mFIX CMV 血友病血友病 B B 小鼠小鼠 550 27.5 350 550 27.5 350 天天 凝血凝血正常正常 肌肉注射肌肉注射 宾州大学宾州大学 AAV hFIX CMV AAV hFIX CMV 免疫缺陷小鼠免疫缺陷小鼠 5 5-7 17 1 年年 无法观察无法观察 肌肉注射肌肉注射 宾
23、州大学宾州大学 AAV cFIX CMV AAV cFIX CMV 血友病血友病 B B 狗狗 70 1.4 2.5 70 1.4 2.5 年年 凝血时间缩短凝血时间缩短 肌肉注射肌肉注射 斯坦福大学斯坦福大学 AAV hFIX LTR AAV hFIX LTR 血友病血友病 B B 小鼠小鼠 1800 25 17 1800 25 17 月月 纠正出血症状纠正出血症状 肝脏输注肝脏输注 斯坦福大学斯坦福大学 AAV cFIX LTR AAV cFIX LTR 血友病血友病 B B 狗狗 95 240 1%240 天天 部分纠正部分纠正 肝脏输注肝脏输注 3）以其他载体系统进行血友病）以其他载体
24、系统进行血友病B基因治疗基因治疗微小腺病毒载体介导微小腺病毒载体介导hFIX小基因离体表达小基因离体表达01002003004005006007008000 0.5 1 1.5 2 2.5 3456789 10 11周血浆中F I X 含 量(n g/m l)miniAdcFIXAdcFIXcontrolELISA方法检测微小腺病毒方法检测微小腺病毒(miniAd)及第一代腺病毒及第一代腺病毒(firstAd)介导介导cFIX在血友病在血友病B小小鼠血浆中的表达鼠血浆中的表达VSVG假型假型RV介导的介导的hFIX cDNA在血友病在血友病B小鼠中的基小鼠中的基因治疗因治疗 VSVG假型假型R
25、V滴度高，与传统滴度高，与传统RV比较抗补体灭活效应高，不比较抗补体灭活效应高，不同剂量病毒上清液腹腔注射新生血友病同剂量病毒上清液腹腔注射新生血友病B小鼠，小鼠凝血功能改小鼠，小鼠凝血功能改善，凝血活性提高善，凝血活性提高3%以上，表达持续以上，表达持续 120d以上。以上。重组慢病毒载体介导人凝血重组慢病毒载体介导人凝血IX因子的表达及宫内基因治疗因子的表达及宫内基因治疗0100200300400500600700800293TL-02BHK细胞类型hFIX细胞上清表达量ng/mlFUXWFAXW 重组慢病毒载体重组慢病毒载体 FUXW FAXW感染离体细胞感染离体细胞293T、L-02、
26、BHK 72h后的后的hFIX蛋白表达蛋白表达01020304050510152030405060时间/天hFIX血浆表达量FAXW(小剂量组)FAXW(静脉缓慢注射组)FAXW(大剂量组)FUXW组PBS对照组重组重组FAXW.FUXW病毒在血友病病毒在血友病B小鼠体内表达小鼠体内表达hFIX的时效曲线的时效曲线 HIV是基因组结构及基因是基因组结构及基因调节机制最为复杂的逆转调节机制最为复杂的逆转录病毒之一录病毒之一,基于基于HIV的重的重组反转录病毒载体，能广组反转录病毒载体，能广泛感染各种非分裂细胞泛感染各种非分裂细胞,也也保留了能够整合在宿主染保留了能够整合在宿主染色体上的特点色体上
27、的特点.且免疫反应且免疫反应小小,重组重组HIV是一个很有发是一个很有发展潜力的病毒载体展潜力的病毒载体ABP肝特异性启肝特异性启动子指导人的凝动子指导人的凝血因子血因子IX的重组的重组HIV载体：重组慢载体：重组慢病毒载体质病毒载体质FUXW,FAXWD等等 非病毒途径导入基因：尾静脉大容量快速注射法非病毒途径导入基因：尾静脉大容量快速注射法尾静脉大容量快速注射裸尾静脉大容量快速注射裸DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达，能够介导外源基因在动物肝内高效表达，我们以凝血因子我们以凝血因子（hF）为报告基因建立了尾静脉液压法裸质粒转）为报告基因建立了尾静脉液压法裸质粒转移体系。移体系。人人F
28、在小鼠体内的表达在小鼠体内的表达小鼠尾静脉大容量快速注射小鼠尾静脉大容量快速注射10g CMV-hFIX 质粒质粒 DNA()，注射后不同时，注射后不同时间采血，通过间采血，通过ELISA检测血浆中检测血浆中hF的水平。示的水平。示Ringers液注射组。液注射组。血友病基因治疗进展与展望血友病基因治疗进展与展望 进展进展 展望展望新的新的AAV 血清型血清型 和慢病毒载体已成功和慢病毒载体已成功 改进慢病毒改进慢病毒,gutless Ad和不同血清和不同血清用于用于FVIII、FIX生产研究生产研究 型型AAV正在开展正在开展除了肝脏外，其他器官也可以用于产生除了肝脏外，其他器官也可以用于产
29、生 基因修复、基因修复、RNA修复（修复（Trans-FVIII、FIX slicing）提供新的方案设计思路）提供新的方案设计思路内源性因子合成和病毒载体引起的免疫内源性因子合成和病毒载体引起的免疫 以外周内皮源细胞实施基因修饰的以外周内皮源细胞实施基因修饰的反应是血友病基因转移的潜在威胁反应是血友病基因转移的潜在威胁 可能具有发展前景可能具有发展前景血友病临床试验正在开展血友病临床试验正在开展 以干细胞治疗实施的基因修饰将成以干细胞治疗实施的基因修饰将成（RV，AAV，或，或ex vivo皮肤成纤维皮肤成纤维 为可能为可能细胞细胞 ）4）总结）总结 血友病基因治疗需要安全、有效、无免疫原性
30、的转移血友病基因治疗需要安全、有效、无免疫原性的转移系统，并要求持续表达，且必须优于蛋白替代法。系统，并要求持续表达，且必须优于蛋白替代法。血友病具有很好的的动物模型血友病具有很好的的动物模型,Hem A,HemB均有均有 小鼠和狗小鼠和狗模型，能模拟、预测临床症状、评价有效性和安全性，有助于临模型，能模拟、预测临床症状、评价有效性和安全性，有助于临床前制定策略。床前制定策略。目前已开展病毒和非病毒转移系统研究，病毒的工作占多数，目前已开展病毒和非病毒转移系统研究，病毒的工作占多数，但非病毒系统的工作可能更具魅力：但非病毒系统的工作可能更具魅力：可在无细胞系统中装配可在无细胞系统中装配 免疫原
31、性小免疫原性小杂合非病毒载体系统杂合非病毒载体系统 将病毒某些成分加入系统，以提高基因转移效率，对血友将病毒某些成分加入系统，以提高基因转移效率，对血友病基因治疗很有吸引力病基因治疗很有吸引力 三、肿瘤的基因治疗三、肿瘤的基因治疗 目前，进入临床试验的基因疗法有目前，进入临床试验的基因疗法有70%是针对癌症的，虽然大多数尚未被肯定疗效，是针对癌症的，虽然大多数尚未被肯定疗效，但代表了癌症治疗的方向。但代表了癌症治疗的方向。恶性肿瘤基因治疗方案中，所用的治疗基恶性肿瘤基因治疗方案中，所用的治疗基因大致可归为三类：细胞因子类；杀伤性基因大致可归为三类：细胞因子类；杀伤性基因类，以疱疹病毒因类，以疱
32、疹病毒I型胸苷嘧啶激酶（型胸苷嘧啶激酶（HSV/TK）为代表；以）为代表；以p53为代表的抑癌基因及反为代表的抑癌基因及反义癌基因类。义癌基因类。2003年年10月月16日，全世界第一个基因日，全世界第一个基因治疗药物治疗药物p53腺病毒注射液由中国国腺病毒注射液由中国国家药品监督管理局颁发新药证书！家药品监督管理局颁发新药证书！常见癌症治疗方案常见癌症治疗方案外源性基因替补疗法外源性基因替补疗法 输注外源性抑癌基因输注外源性抑癌基因p53可抑制或杀灭癌细胞。可抑制或杀灭癌细胞。抗原基因导入疗法抗原基因导入疗法 将组织相容复合体将组织相容复合体MHC基因转移给肿瘤细胞，基因转移给肿瘤细胞，MH
33、C II型分子在肿瘤细胞表面大量表达，与肿瘤抗原型分子在肿瘤细胞表面大量表达，与肿瘤抗原结合形成复合抗原，从而暴露出结合形成复合抗原，从而暴露出“靶点靶点”被免疫细胞被免疫细胞识别和消灭识别和消灭反义基因疗法反义基因疗法 以癌基因以癌基因DNA的有义链为模板合成出反义链，将其的有义链为模板合成出反义链，将其转入肿瘤细胞内，形成的双链核酸阻断癌基因表达和癌转入肿瘤细胞内，形成的双链核酸阻断癌基因表达和癌细胞增殖。细胞增殖。自杀基因疗法自杀基因疗法 将自杀基因（又称前药转换酶基因如胸苷激酶将自杀基因（又称前药转换酶基因如胸苷激酶tk基因基因和胞嘧啶脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶CD基因等基因等）,导入癌细胞
34、内，使癌细胞导入癌细胞内，使癌细胞死亡。死亡。细胞因子基因导入疗法细胞因子基因导入疗法 将白细胞介素将白细胞介素II、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子基因导入肿瘤细胞内，所产生的细胞因子可引起癌细胞基因导入肿瘤细胞内，所产生的细胞因子可引起癌细胞死亡；也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细死亡；也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细胞内，增强这些细胞的抗癌作用。胞内，增强这些细胞的抗癌作用。我们的部分工作我们的部分工作腺病毒载体介导的腺病毒载体介导的TK/ACV对大鼠脑胶质瘤离体对大鼠脑胶质瘤离体/活体的杀伤作用活体的杀伤作用 目前癌症基因治疗的研究大多是
35、在观察毒副目前癌症基因治疗的研究大多是在观察毒副反应为主的反应为主的期临床试验，极少数进入期临床试验，极少数进入/期临期临床试验，结果有待进一步观察。目前的临床研究床试验，结果有待进一步观察。目前的临床研究进程很慢，这与癌症复杂的发病机制和有效载体进程很慢，这与癌症复杂的发病机制和有效载体的研发有关，虽然动物实验的结果不断涌现，但的研发有关，虽然动物实验的结果不断涌现，但并不能完全代表人类，只有临床试验具有决定性并不能完全代表人类，只有临床试验具有决定性的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤会在手术、放疗和
36、化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。要的组成部分。在注射区的骨骼肌仅有中等或轻微的慢性感染，感染仅限于肌束膜组织，无肌肉纤维解剖学上的改变。1980-1989 准备期 技术、宗教，伦理，法律5LTR Neo CMV FIX cDNA 3LTR一哄而上,一哄而下,缺乏基因治疗正确认识.血友病B基因治疗靶细胞选择1）1991年，复旦大学反转录
37、病毒介导的ex vivo途径临床试验取得了安全有效的结果新的AAV 血清型 和慢病毒载体已成功 改进慢病毒,gutless Ad和不同血清血友病是目前SGT最有希望达到Klein C et al“Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA”Gastroenterology.0天 3天 15天 27天 39天 阳性对照重组慢病毒载体 FUXW FAXW感染离体细胞1996-至今 理性期出现临床结果p53 for cancer treatment杀伤性基因类，以疱疹病毒I
38、型胸苷嘧啶激酶（HSV/TK）为代表；1）1991年，复旦大学反转录病毒介导的ex vivo途径临床试验取得了安全有效的结果四、传染病的基因治疗四、传染病的基因治疗（1）病毒性肝炎的基因治疗）病毒性肝炎的基因治疗 病毒性肝炎基因治疗研究虽然取得了一病毒性肝炎基因治疗研究虽然取得了一系列的进展，但是，由于病毒性肝炎的发病系列的进展，但是，由于病毒性肝炎的发病机制还没有完全了解清楚，目前基因治疗在机制还没有完全了解清楚，目前基因治疗在病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身
39、发展的速度和状态，另一方面也疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。程度。病毒性肝炎基因治疗病毒性肝炎基因治疗最近部分工作最近部分工作Xu R et al”Molecular therapeutics of HBV”Curr Gene Ther.2003 Aug;3(4):341-55.病毒学杂志病毒学杂志.2003 Mar;17(1):81-4.Ding CL et al“Expression of HBcAg in eukaryotic cells by retroviral vector mediated g
40、ene transfer”中华实验和临床病中华实验和临床病毒学，毒学，2003 Mar;17(1):81-4.Klein C et al“Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA”Gastroenterology.2003 Jul;125(1):9-18 Han JQ et al“Approach to transforming hepatitis B virus as a gene therapeutic vector”中华肝脏病杂志中华肝脏病杂志 2003,Ju
41、n;11(6):344-6.（2）AIDS 基因治疗基因治疗-近期一些工作近期一些工作Zhang D et al:“Optimization of ex vivo activation and expansion of macaque primary CD4-enriched peripheral blood mononuclear cells for use in anti-HIV immunotherapy and gene therapy strategies”J Acquir Immune Defic Syndr.2003 1;32(3):245-54.Ananthalakshmi P
42、oluri et al“Genetic therapy for HIV/AIDS”Expert Opinion on Biological Therapy.2003,vol.3,no.6,pp.951-963 Fanning G et al“Gene therapy for HIV/AIDS:the potential for a new therapeutic regimen”J Gene Med.2003 Aug;5(8):645-53 Akkina R et al“siRNAs,ribozymes and RNA decoys in modeling stem cell-based ge
43、ne therapy for HIV/AIDS”Anticancer Res.2003 May-Jun;23(3A):1997-2005.（3）SARS 基因治疗基因治疗反义技术？反义技术？在在“反义反义”技术领域潜心耕耘了技术领域潜心耕耘了23载的载的AVI公司一直不为外界公司一直不为外界所知，直到非典出现，该公司一鸣惊人。事实上，所知，直到非典出现，该公司一鸣惊人。事实上，AVI公司只花了公司只花了几天时间，就把对付田鼠冠状病毒和企鹅西尼罗河病毒的几天时间，就把对付田鼠冠状病毒和企鹅西尼罗河病毒的“反义反义”技术技术“改造改造”成了对付非典病毒的武器。成了对付非典病毒的武器。是否成功有待证
44、明是否成功有待证明 但是，一些专家对但是，一些专家对AVI公司成功对付非典的可能性表示怀疑。纽公司成功对付非典的可能性表示怀疑。纽约阿尔伯特约阿尔伯特爱因斯坦医学院的赛爱因斯坦医学院的赛斯滕博士说，他要看更多的数据。斯滕博士说，他要看更多的数据。这位被称为这位被称为“反义反义技术之父技术之父”的博士还强调，他的领域充满的博士还强调，他的领域充满了失败，了失败，“我们的了解不多，（这一技术）实在太复杂我们的了解不多，（这一技术）实在太复杂”。“反义反义”技术之复杂在于，一是它除了能切断有害基因及其编技术之复杂在于，一是它除了能切断有害基因及其编码的蛋白质之间的信号传播，也会影响与疾病没有关系的其
45、它基码的蛋白质之间的信号传播，也会影响与疾病没有关系的其它基因和蛋白质；二是它有可能最终被证实不能切断信号传播。因和蛋白质；二是它有可能最终被证实不能切断信号传播。目前临床试验成功的例子目前临床试验成功的例子AAV-Hemophilia BTreatment of certain types of cancer using conditionally replicating oncolytic virusesTreatment of vascular and coronary artery disease using viral vectors that express angiogenic
46、factors p53 for cancer treatmentDNA vaccine for cancer and infectious diseases 基因治疗几个发展时期基因治疗几个发展时期1980-1989 准备期准备期 技术、宗教，伦理，法律技术、宗教，伦理，法律1990-1995 狂热期狂热期公众，媒体公众，媒体1996-至今至今 理性期理性期出现临床结果出现临床结果蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效血友病血友病A 有有10-40%的人群产生抑制物的人群产生抑制物血友病血友病B 有有5%的人群产生抑制物的人群产生抑制物这也是我们把
47、治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越的基因治疗的原因之一！的基因治疗的原因之一！微小腺病毒载体介导hFIX小基因离体表达血友病小鼠经rAAV基因治疗后,FIX凝血活性提高,出血症状改善人F在小鼠体内的表达血友病临床试验正在开展 以干细胞治疗实施的基因修饰将成在注射区的骨骼肌仅有中等或轻微的慢性感染，感染仅限于肌束膜组织，无肌肉纤维解剖学上的改变。VEGF gene(vascular growth factor),plasmid,intracardiac理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系）且免疫反应小,重组HIV是一个很有发展潜力的病毒载体（
48、1）病毒性肝炎的基因治疗1999-2000 M.目前临床试验成功的例子除了肝脏外，其他器官也可以用于产生 基因修复、RNA修复（Trans-SCID(Immunodeficiency)Fanning G et al“Gene therapy for HIV/AIDS:the potential for a new therapeutic regimen”J Gene Med.ADA normal gene(enzyme)retrovirus,ex-vivo BM采用采用Western dot-blotWestern dot-blot分析表明，于肌分析表明，于肌肉注射肉注射rAAV/hFIXrA
49、AV/hFIX病毒子后第病毒子后第1515天，小鼠天，小鼠血液中即开始出现抗血液中即开始出现抗hFIXhFIX抗体，血浆中抗体，血浆中hFIXhFIX水平亦开始下降水平亦开始下降.经经BethesdaBethesda分析分析,未发现抗小鼠未发现抗小鼠IXIX因子抗因子抗体体.0天天 3天天 15天天 27天天 39天天 阳性对照阳性对照抗抗IX因子抗体分析因子抗体分析 血友病血友病 B B 基因治疗动物实验比较基因治疗动物实验比较 单单 位位 载体载体 基因基因 启动子启动子 动物模型动物模型 FIX FIX 表达表达 持续时间持续时间 症症 状状 FIX:Ag FIX:C FIX:Ag FI
50、X:C (ng/ml)(%)(ng/ml)(%)复旦大学复旦大学 AAV hFIXm MCK AAV hFIXm MCK 血友病血友病 B B 小鼠小鼠 250 6.0 27 250 6.0 27 天天 出血减少出血减少 /ac/actin tin 肌肉注射肌肉注射 复旦大学复旦大学 AAV hFIXm CMV AAV hFIXm CMV 血友病血友病 B B 小鼠小鼠 482 34.2 13 482 34.2 13 周周 凝血凝血正常正常 R338A R338A 肌肉注射肌肉注射 复旦大学复旦大学 AAV mFIX CMV AAV mFIX CMV 血友病血友病 B B 小鼠小鼠 550 2
