1、1概述概述鉴别实验鉴别实验杂质检测杂质检测含量（效价）测定含量（效价）测定第第1313章章 生物制品分析概论生物制品分析概论第一节 概述生物药物（biopharmaceutics或biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学等学科的原理与方法制得的天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。生物药物主要包括生化药物生化药物（biochemical drugs）、生物技术药物生物技术药物（bio-technology drugs)和生生物制品物制品（biological products)等。3生物制品种类与特点生物制品种类生物制品
2、种类疫苗类抗毒素及抗血清血液制品重组DNA制品诊断制品其他制品4疫苗类疫苗类细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗双价疫苗及多价疫苗5生物制品种类与特点生物制品特点生物制品特点分子量大不是定值生化法结构确证需检查生物活性要求安全性检查需做效价测定第二节 鉴别反应 理化鉴别法理化鉴别法化学法紫外分光光度法高效液相色谱法 生化鉴别法生化鉴别法酶法电泳法 生物鉴别法生物鉴别法血清学法生物学法789第三节 杂质检查 特殊杂质检查特殊杂质检查宿主细胞蛋白残留量外源性DNA残留量产品相关杂质残余抗生素 安全性检查安全性检查无菌热源细菌内毒素异常毒性与特异性毒性过敏反应1112131、结构确证研究、结构确证研究 1.
3、1关于氨基酸序列研究 多采用固相合成，合成工艺不能独立作为一项结构确证性研究 可以采用的方法：Edman、MS/MS、NMR等 对于序列较长的情况可以用内切酶裂解后分析小片段的序列14合成多肽类药物 氨基酸分析氨基酸分析（证明多肽的组成是否正确）（证明多肽的组成是否正确）；质谱测定（质谱测定（提供相对分子质量及序列的信息）；提供相对分子质量及序列的信息）；序列分析以及肽图测绘等；序列分析以及肽图测绘等；紫外：紫外：对具有生色团结构的小肽有一定的测试意对具有生色团结构的小肽有一定的测试意义；义；红外：红外：适用于小肽（含三个氨基酸的肽）、拟肽适用于小肽（含三个氨基酸的肽）、拟肽等；等；核磁共振：
4、核磁共振：可对小肽的结构提供部分信息；可对小肽的结构提供部分信息；其他方法：其他方法：HPLC、比旋度测定等。、比旋度测定等。159.0284.8560.6836.41112.21388.0Mass(m/z)525.30102030405060708090100%Intensity4700 MS/MS Precursor 1312.7 Spec#1 MCBP=522.2,525b4(+1)b8(+1)667.2446b5(+1)b6(+1)b3(+1)504.1906y6(+1)b7(+1)1123.4965y5(+1)b2(+1)439.2479y3(+1)1282.6265y8(+1)84
5、3.3364602.30391255.5779437.1705312.1514y2(+1)827.3514b9(+1)611.3574742.2863300.16421142.12351269.6775845.7062983.4919393.1536494.2235661.4524270.1886112.09951089.4990LP9.0280.8552.6824.41096.21368.0Mass(m/z)9.4E+40102030405060708090100%Intensity4700 MS/MS Precursor 1293.7 Spec#1 MCBP=1293.4,94427129
6、3.2965y7(+1)b2(+1)b8(+1)y6(+1)b4(+1)b3(+1)791.4446b5(+1)419.1746Wy2(+1)311.1819842.4384y5(+1)439.2478b10(+1)1105.5052b6(+1)628.3733b7(+1)y3(+1)1094.5402y4(+1)1252.6249532.2585773.4149639.2771350.15041097.69531234.5961253.1680858.4617965.4611112.1012725.2939605.2610P452.2216L16肽图分析肽图分析GH_peptidesT10T
7、8T4T3T1T12T13T14T2T7T9T15T20-T21T18-19T17-T18-19T6-16T11肽段序列肽段序列理论分子量理论分子量出峰时间（min）出峰时间（min）实际测得的质荷比实际测得的质荷比T1fptiplsr929.546.32930.7T2lfdnamlr978.542.31979.7T3ahr382.45.69383.4T4lhqlafdtyqefeeayipk2342.176.62*1172.3T5eqk403.4NDNDT6ysflqnpqtslcfsesiptpsnr2616.2NDNDT7eetqqk761.47.66762.4T8snlellr843.
8、535.84844.4T9isllliqswlepvqflr2055.2103.51028.6T10svfanslvygasdsnvydllk2262.584.421132T11dleegiqtlmgr1360.765.3681.4T12ledgspr772.416.51773.5T13tgqifk692.426.26693.5T14qtysk625.312.38626.4T15fdtnshnddallk1488.730.05*745.6T16nygllycfr1147.5NDNDT17k146.2NDNDT18dmdk507.2NDNDT19vetflr763.4NDNDT20ivqcr61
9、7.3NDNDT21svegscgf784.3NDNDT17-T18-T19 kdmdkvetflr1380.736.85691.6T18-T19dmdkvetflr1252.641.321253.6T20-T21ivqcrsvegscgf1399.629.31400.6T6-T163761.789.71255171、结构确证研究、结构确证研究 1.2短肽与长肽的划分 尚无定论 1.3空间结构研究 一些长肽需要具有一定的空间结构才能发挥活性，应开展空间结构研究，分析方法：X-Ray、NMR、拉曼光谱、红外、圆二色等182、质量研究、质量研究 2.1质量研究项目 结合一般化学药物的研究思路与合成
10、多肽的结构特征进行 一般包括：外观性状、理化常数（等电点、溶解性等）、鉴别、氨外观性状、理化常数（等电点、溶解性等）、鉴别、氨基酸组成分析、水分、反离子含量、纯度、有机溶剂和基酸组成分析、水分、反离子含量、纯度、有机溶剂和反应试剂残留量、生物安全性检查、含量或活性效价测反应试剂残留量、生物安全性检查、含量或活性效价测定等定等192、质量研究、质量研究 2.2 有关物质研究 合成多肽药物有关物质的特点和研究难点 工艺杂质（缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换等）降解产物及聚合物（脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、beta消除、聚集等）有关物质研究关注点 同时采用不同原理的研究方法（反相HPLC
11、、分子排阻、CE，SDS-PAGE及激光散射等）反相HPLC要采用梯度洗脱方式 专属性验证20 注意点：仿制药物：相关物质大于或等于0.1%，要进行结构确证（注意响应因子）创新药物：除了与仿制药物一样之外，尽可能多的罗列所有可能杂质，要与中间体关联，特别注意手性问题！2190311911479176720552343Mass(m/z)971.30102030405060708090100%Intensity4700 Reflector Spec#1 MC=NF0.7BP=2038.8,9712037.75592040.76951019.37402053.75001021.37962072.75
12、851343.53082044.77041077.37281228.43842154.7664988.4064单体二聚体22min2040608010012014023 min24252627282930mAU 020040060080010001200 VWD1 A,Wavelength=214 nm(TA1TA1-20091019 2009-10-19 18-36-3320091019000028.D)25.165 25.666 26.064 26.456 27.072 27.572 28.251 1234567Thymosin a1胸腺素胸腺素a a1样品样品37度放置稳定性度放置稳定性
13、结果结果24峰峰 15 和主峰分子量完全相同和主峰分子量完全相同 3065.6峰峰 6、7 分子量完全相同分子量完全相同 3047.4NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH D-Aspb b-D-Asp L-Aspb b-L-Asp 43=64种可能（这还不包括各种组合及其他可能）252、质量研究、质量研究 2.3 生物安全性检查 争论较大、具体情况具体分析 2.4关于活性研究 方法的建立和验证很困难，专属性难以保证。第四节 含量（效价）测定 理化分析法理化分析法滴定法光谱法HPLC 生化分析法生化分析法电泳法酶法 生物检定法生物检定法基本概念应用实例
