1、LOGO1第十章 维生素的测定LOGO2一二请在这里输入您的主要叙述内容整体概述三请在这里输入您的主要叙述内容请在这里输入您的主要叙述内容LOGO3主要内容v概述vVA 和VE的测定v胡萝卜素的测定vVD的测定vVB1的测定vVB2的测定vVC的测定LOGO4概述 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。LOGO5维生素都具有以下共同特点：这些化合物或其前体化合物都在天然食物中
2、存在；它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。LOGO6 我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防止中毒，都离不开分析检测工作。维生素分类：脂溶性（A、D、E、K）水溶性两类（B族、C）LOGO7v 测定方法有紫外可见分光光度法、荧光光度法。它们灵敏、快速、选择性较好。v光谱法分离效能较高，在维生
3、素分析中占有越来越重要的地位。LOGO8第一节 脂溶性维生素的测定 VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。脂溶性维生素具有以下理化性质：1.溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2.耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。LOGO9 耐热性 氧化性VA 好，能经受煮沸 易被氧化（光、热促进其氧化）V D 好，能经受煮沸 不易被氧化 V E 好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被化 （光、热、碱促进其氧化）3耐热性、耐氧化性LOGO10 维生素A A存
4、在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含V VA A，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为V VA A，故称为V VA A原。一、维生素A的测定LOGO111.原理 在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。2.适用范围及特点 本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于 5-10 g g)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰不易比色测定：该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在6秒钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成
5、极大误差。（一）比色法测定VA的含量LOGO123.试剂 无水硫酸钠 不吸附维生素A 乙酸酐 无水乙醚 不含过氧化物 无水乙醇 不含醛类物质 三氯甲烷 不含分解物 250gL三氯化锑一三氯甲烷溶液 1：1氢氧化钾溶液 维生素A标准溶液 酚酞指示剂 LOGO134.4.操作步骤样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。a.皂化法：适用于VA含量不高的试样，可减少脂溶性物质的干扰，或用棕色玻璃仪器。皂化：称取0.55g样品于圆底烧瓶，加10mlKOH、5ml抗坏血酸钠及2040ml乙醇，在沸水浴上回流30min。使皂化完全，皂化结束分别用5mL乙醇，5mL水自冷凝管顶部冲洗其内部，取出烧瓶冷却
6、至40。LOGO14 将皂化后混合物移至500ml分液漏斗，用30ml水冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗，用50ml乙醚分两次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。振摇并注意放气。静置分层后，水层（在下）放入第二个分液漏斗。皂化瓶再用30ml乙醚分两次清洗，洗液注入第二个分液漏斗。振摇后，静置分层，水层（在下）放入三角瓶，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水层上无黄色醚层。提取LOGO15洗涤用约30ml水加入第一个分液漏斗，轻轻振摇，静置片刻，去除水层，加入1520ml0.5mol/L KOH于分液漏斗，轻轻振摇，弃去下层碱液。继续用水（30ml）洗涤三次，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止。静置醚层1020
7、min。LOGO16浓缩 醚层经无水硫酸钠滤入三角瓶，再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次。置水浴上蒸馏，回收乙醚。等乙醚完全挥发，立即加入一定量三氯甲烷，用于测定。b.研磨法：适用于每1g样品维生素A含量大于510ug样品的测定，如动物肝的检测。步骤简单，省时，结果准确。研磨：精确称取25g样品，放入盛有35倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。LOGO17提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶中，准确加入50100mL乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（12h），或离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中
8、操作，装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中）。浓缩：取澄清的乙醚液25mL，放入比色管中，在7080水浴上抽气蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。LOGO18标准曲线的制备：准确取一定量的维生素A标准液于45个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量的比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各加入乙酸酐1滴，制成标准比色系列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9 mL三氯化锑-三氯甲烷溶液。于6s内测定吸光度，将吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。样品测定：于一比色管中加入10 mL三氯甲烷，加入1滴乙酸
9、酐为空白液。另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入1mL样品液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。LOGO191001000mVcX5 结果计算 X-样品中维生素的含量，mg/100g（若按国际单位，每国际单位相当于.3g维生素）；c-由标准曲线上查得样品中含维生素的含量，gmL；m-样品质量，g；-提取后加三氯甲烷定量之体积，mL；100-以每100g 样品计。LOGO20注意：1.维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。2.三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。LOGO21（二）
10、高效液相色谱法测定VAVA和VEVE1 原理 样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。2.试剂2.1 无水硫酸钠；2.2 抗坏血酸溶液（100g/L）：临用前配制；2.3 氢氧化钾溶液（1+1）；2.4 氢氧化钠溶液（100g/L）LOGO222.5 硝酸银溶液（50g/L）；2.6 无水乙醚：不含有过氧化物；2.7 无水乙醇：不得含有醛类物质；2.8 甲醇：重蒸后使用；2.9 重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏；2.10 银氨溶液：加氨水至硝酸银溶液中，直至
11、生成的沉淀重新溶解为止，再加氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解；2.11 维生素A标准液：视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（纯度90%）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度；LOGO232.12 维生素E标准液：-生育酚（纯度95%），-生育酚（纯度95%），-生育酚（纯度95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度；2.13 内标溶液：称取苯并e芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成每1mL相当于10
12、g苯并e芘的内标溶液；2.14 pH114试纸。LOGO243 仪器与设备3.1 实验室常用设备；3.2 高压液相色谱仪带紫外分光检测器；3.3 旋转蒸发器；3.4 高速离心机，配有小离心管，具塑料盖1.5mL3.0mL塑料离心管（与高速离心机配套）；3.5 高纯氮气；3.6 恒温水浴锅；3.7 紫外分光光度计。LOGO254 分析步骤4.1 试样处理4.1.1 皂化称取1g10g试样（含维生素A约3g，维生素E各异构体约为40g）于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL10%抗坏血酸，苯并e芘标准液2.00mL，混匀。加10mL氢氧化钾（11），混匀。于沸水
13、浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。LOGO264.1.2 提取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2次3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。4.1.3 洗涤用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。LOGO274.1.4 浓缩将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套的250mL300mL球形蒸发瓶内，用约100mL乙醚冲洗分液漏
14、斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。4.1.5 将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min（5000rpm）。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。LOGO284.2标准曲线的制备4.2.1维生素A和维生素E标准浓度的标定 取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如表1所示。
15、LOGO29浓度按下式计算：LOGO304.2.2标准曲线的制备 本标准采用内标法定量。把一定量的维生素A、-生育酚、-生育酚、-生育酚及内标苯并e芘液混合均匀。选择合适灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程70%为高浓度点。高浓度的1/2低浓度点（其内标苯并e芘的浓度值不变），用此种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图（图1）。维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。本标准不能将维生素E和-维生素E分开，故-维生素E峰中包含有 维生素E峰。LOGO314.3 高效液相色谱分
16、析预柱：ultrasphere ODS10um,4mm4.5mm分析柱：ultrasphere ODS5um,4.6mm25mm流动相：甲醇+水(98+2)。混匀，于临用前脱气。紫外检测器波长：300nm。量程0.02进样量：20uL流速：1.7ml/minLOGO324.4试样分析 取试样浓缩液20uL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。4.4.1定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。4.4.2定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。LOGO335 计算LOGO346 说明v 本标准适用于食品中维生素A和维生素
17、E的同时测定。最小检出量分别为VA0.8ng、-生育酚91.8ng、-生育酚36.6ng、-生育酚20.6ng。v 定性方法采用标准色谱图保留时间定性，定量方法采用内标两点法进行定量计算。先制备标准曲线，根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得其含量。或用回归方程求出其含量。用微处理机两点内标法计算时，按其计算公式由微处理机直接给出结果。v 实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器，避免维生素的破坏。v 测定维生素E还有比色法、荧光法等。LOGO35二、-胡萝卜素的测定 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡
18、萝卜素，其中在分子结构中含有-紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如、胡萝卜素，其中以-胡萝卜素效价最高。LOGO36 胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当然也含有胡萝卜素。-胡萝卜素的结构如下：LOGO37 胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。胡萝卜素在450 nm 波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取-胡萝卜素时，这些色素也能
19、被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法和高效液相色谱法。LOGO38（一）纸层析法1 原理 以石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，再以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。2 试剂2.1 石油醚（沸程3060）：同时是展开剂。2.2 丙酮：分析纯。2.3 丙酮-石油醚混合液：3：7（V/V）。LOGO392.4 无水硫酸钠：分析纯。2.5 5%硫酸钠溶液。2.6 1：1氢氧化钾溶液：取50g氢氧化钾溶于50mL水。2.7 无水乙醇：需
20、经脱醛处理。2.8 -胡萝卜素标准溶液：取50.0mg-胡萝卜素标准品，溶于100mL三氯甲烷中，浓度约为500g/mL，准确测其浓度。取标准溶液10.0L，加正己烷3.00mL，混匀，测吸光值，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取均值。LOGO40计算公式 A 3.01=E 0.01式中:胡萝卜素标准溶液浓度，ug/mL；A吸光值；E-胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长 450nm，比色杯厚度为1cm，溶液浓度为1ppm的吸光系数，为0.2638；3.01 测定过程中稀释倍数的换算。0.01 0.01LOGO412.9 -胡萝卜素标准使用液：将已标定的标准
21、液用石油醚准确稀释后，每毫升溶液相当50g，避光保存于冰箱中。3 仪器和设备3.1 实验室常用设备。3.2 玻璃层析缸。3.3 分光光度计。3.4旋转蒸发器：具150mL球形瓶。3.5 恒温水浴锅。3.6 皂化回馏装置。3.7 点样器或微量注射器。3.8 滤纸：定性，快速或中速。LOGO424 样品的采集和处理4.1 粮食：样品用水洗三次，置60烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。4.2 蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。5 测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）5.1 样品提取取
22、适量试样，相当于原样15g)（含胡萝卜素约2080g）匀浆，粮食试样视其胡萝卜素含量而定，植物油和高脂肪试样取样量不超过10g。置100ml带塞锥形瓶中，加脱醛乙醇30ml，再加10ml 氢氧化钾溶液（1+1），回流加30min，然后用冰水使之迅速冷却。皂化后试样用石油醚提取，直至提取液无色为止，每次提取石油醚用量为1525mlLOGO435.2洗涤 将皂化后试样提取液用水洗涤至中性。将提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。5.3浓缩与定容 将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60，蒸发
23、至约1mL 时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00mL 石油醚定容，备层析用。LOGO445.4 纸层析5.4.1 点样：在18cm30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点（如图1所示），吸取0.1000.400mL浓缩液(5.3)在AB和CD间迅速点样。LOGO455.4.2 展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。5.4.3 洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中
24、。5.5 比色测定用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下，测吸光度，以其值从标准曲线上查出-胡萝卜素的含量，供计算时使用。LOGO465.6 标准曲线绘制 取 胡萝卜素标准使用液（浓度为50g/mL）1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00mL分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为0.100mL，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00g。为测定低含量样品，可在0至2.50g间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线 LOGO476 计算 m1 V2X=100
25、 m V1X样品中胡萝卜素的含量，以-胡萝卜素计，ug/100g；m1 在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量，g；V1点样体积，mL；V2 样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，mL；m样品质量，g。LOGO487 说明v此法简便，色带清晰，最小检出量为0.11ug。v样品和标准液的提取一定要注意避免丢失。v浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。v定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。LOGO49三、维生素D的测定 维生素D是指含有抗佝楼病活性的一类物质，具有维生素D活性的化合物约有l 0种，其中最重要的是维生素D2、维生素D 3及其维生素D原。维
26、生素D2、D 3只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7-脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。LOGO50 分析方法有比色法、高效液相色谱法、薄层层析法。（一）三氯化锑比色法1 原理 在三氯甲烷溶液中，VD与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与VD的含量成正比。2 试剂三氯化锑-三氯甲烷溶液：250g/L。将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100mL三氯甲烷的棕色试剂瓶中振摇，使之溶解，再加入无水硫酸钠10g。用时吸取上清液。LOGO51三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液：在试剂中加入为其体积30g/L的乙酰氯，摇匀。无水乙醚：不含过氧化物检查方法：取5mL乙醚加1mL10
27、0g/L碘化钾溶液，振摇1min，如含过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色；或加入4滴5g/L淀粉溶液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。去除方法：重蒸乙醚时，瓶内放入少许铁末或铁丝。弃去10%初留液和10%残留液。LOGO52无水乙醇：不含醛类物质检查方法：在盛有2mL银氯溶液的小试管中，加入35滴无水乙醇，摇匀，再加入100g/L氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中含有醛。脱醛方法：取2g硝酸银，溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入盛有1L乙醇的试剂内，振摇后，暗处放置2d（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初馏液50mL。若乙醇中含醛较多时，
28、可适量增加硝酸银用量。LOGO53石油醚：沸程3060；重蒸。维生素D标准溶液，称取0.25g维生素D，用三氯甲烷稀释至100mL，此液浓度为2.5mg/mL，临用前三氯甲烷配制成0.0252.5ug/L的标准使用液。聚乙二醇（PEG）600。白色硅藻土：celite545（柱色谱载体）氨水无水硫酸钠氢氧化钾溶液：0.5mol/LLOGO54中性氧化铝，色谱用，100200目。在550灰化炉中活化5.5h，降温至300左右取出装瓶。冷却后，每100g氧化铝加入4mL水，用力振摇，使无块状，瓶口封紧贮存在于干燥器内，16h后使用。3 测定步骤样品处理：皂化与提取同VA的测定。如果样品中有VA共存
29、，可用以下方法进行分离纯化。a.分离柱的制备：取一支内径为2.2cm，具有活塞和砂芯板的玻璃色谱柱。LOGO55第一层：加入12g无水硫酸钠，铺平整。第二层：称取15g硅藻土置于250mL碘价瓶中，加入80mL石油醚，振摇2min,再加入10mL聚乙二醇600，剧烈振摇10min，使其黏合均匀，然后倾入色谱柱内。第三层：加5g中性氧化铝。第四层：加入24g无水硫酸钠。轻轻地转动色谱柱，使第二层的高度保持在12cm左右。LOGO56b.纯化：先用3050mL石油醚淋洗衣分离柱，然后将样品提取液倒入柱内，再用石油醚继续淋洗。弃去最初收集的10mL滤液，再用200mL容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度
30、保持23mL/min.将淋洗液移入500mL分流漏斗中，每次加入100150mL水，洗涤3次（去除残留的聚乙二醇，以免与三氯化锑作用形成混浊物，影响比色）将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器中减压浓缩至干或在水浴上用水泵减压抽干，立即加入5mL三氯甲烷溶解备用。LOGO57测定a.标准曲线的绘制：准确吸取VD标准使用液（浓度视样品中维生素D含量高低而定）0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL于10mL容量瓶内，用三氯甲烷定容。取上述标准比色液各1mL于1cm比色杯中，立即加入三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液3mL，在某种程度上500nm波长下，于2min内测定吸光度。绘制标
31、准曲线。b.样品测定：吸取样品纯化液1mL于1cm比色杯中，以下操作同标准曲线的绘制。LOGO584 结果计算 VX=100 m1000式中X样品中VD的含量，mg/100g 标准曲线上查得样品溶液中VD的含量，ug/mL V样品提取后三氯甲烷定容之体积，mL m样品质量，gLOGO595 说明v食品中VD的含量一般很低，而VA、VE、胆固醇等成分的含量往往都大大超过VD，严重干扰VD的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。v操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响，可使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍，并可减少部分甾醇的干扰。v此法不能区分VD2和VD3，测定值是两者的总量。LOGO60第二
32、节 水溶性维生素的测定 水溶性维生素B B1 1、B B2 2和C C，广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的形式存在，除满足人体生理、生化作用外，多余的量都能从机体排出。水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，持别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；LOGO61 维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。测定水溶性维生素的方法通常用高效液相色谱法、荧光比色法、比色法和微生物法等LOGO62一、维生素Bl的测定
33、维生素Bl又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。VB1的测定方法有分光度法、荧光法、高效液相色谱法。分光光度法适用于测定VB1含量较高的食物，如大米、大豆、酵母、强化食品等；荧光法和高效液相色谱法适用于微量测定。LOGO63（一）荧光法测定VB11 原理 样品经热稀酸处理，以提取VB1。如果所含VB1为游离态，可直接在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如样品中含杂
34、质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。LOGO642 仪器荧光分光光度计；电热恒温培养箱；Maizel-Gerson反应瓶；盐基交换管3 试剂 3.1 正丁醇：优级纯或重蒸馏的分析纯。3.2无水硫酸钠：分析纯。3.3淀粉酶和蛋白酶。3.4 水：去离子水或蒸馏水。3.5 0.1mol/L盐酸：8.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。LOGO653.6 0.3mol/L盐酸：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。3.7 2mol/L乙酸钠溶液：164g无水乙酸钠或272g含水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL。3.8 25%氯化钾溶液：250g氯化钾溶于水中稀释
35、至1000mL3.9 25%酸性氯化钾溶液：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL。3.10 15%氢氧化钠溶液：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL。3.11 1%铁氰化钾溶液：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存。LOGO663.12 碱性铁氰化钾溶液：取4mL1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用。3.13 3%乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL。3.14 活性人造浮石：称取100g经40目筛的人造浮石，以10倍于其容积的3%热乙酸搅洗2次，每次10min，再用5倍于其容积的25%热氯化钾搅洗15min；然后
36、再用3%热乙酸搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存。LOGO673.15 硫胺素标准贮备液：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01molmL盐酸中，并稀释至1000mL。此溶液每毫升相当0.1mg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。3.16 硫胺素标准中间液：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10g硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。3.17 硫胺素标准使用液：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，此溶液每毫升相当10g硫胺素。用时现配。3.18 0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4Ml0.
37、1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。LOGO684 操作方法4.1试样处理 样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后混匀使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。4.2 提取精确称取一定量试样（估计其硫胺素含量约为1030g，一般称取210g试样），置于100mL三角瓶中，加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，后放入高压锅中加热水解12130min,，凉后取出。LOGO69 用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5（以0.04%溴甲酚绿为外指示剂）。按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋
38、白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于4550温箱过夜保温（约16h）。凉至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。4.3净化 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。用移液管加入提取液2080mL（使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为25g）。LOGO70 加入约10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。加入25%酸性氯化钾（温度为90左右）20mL，收集此液于25mL刻度试管内，冷至室温，用25%酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。重复上述操作，将20mL硫胺
39、素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。4.4 氧化 将5mL试样净化液分别加入A、B两个Maizel-Gerson反应瓶。LOGO71 在避光条件下将3mL15%氢氧化钠加入反应瓶A，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇，将A、B两个反应瓶同时用力振摇1.5min。重复上述操作，用标准净化液代替试样净化液。静置分层后弃去下层碱性溶液，加入23g无水硫酸钠使溶液脱水。4.5 测定 荧光测定条件：激发波长365nm，发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。LOGO72 依次测定下列荧
40、光强度：试样空白荧光强度（试样反应瓶A）；标准空白荧光强度（标准反应瓶A）；试样荧光强度（试样反应瓶B）；标准荧光强度（标准反应瓶B）。LOGO735 结果计算 V V1 1 100X=(U-Ub)S-Sb V2 m 1000式中：X样品中硫胺素含量，mg/100g；U试样荧光强度；Ub试样空白荧光强度；S标准荧光强度；Sb标准空白荧光强度；硫胺素标准使用液浓度，g/mL V用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL；V1试样水解后定容之体积，mL；LOGO74 V2试样用于净化的提取液体积，mL；m试样质量，g；1001000 试样含量由g/g换算成mg/100g的系数。6 说明一般食品中VB1有
41、游离型的，也有结合型，即与淀粉、蛋白质等结合在一起的，故需用酸和酶水解，使结合型B1成为游离型，再采用此法测定。硫色素能溶解于正丁醇，在正丁醇中比在水中稳定，故用正丁醇等提取硫色素。萃取时振摇不宜过猛，以免乳化，不易分层。LOGO75紫外线破坏硫色素，所以硫色素形成后要迅速测定，并力求避光操作。用甘油-淀粉润滑剂代替凡士林涂盐基交换管下活塞，因凡士林具有荧光。谷类物质不需酶分解，样品粉碎后用25%酸性氯化钾直接提取，氧化测定。LOGO76二、维生素B2的测定 维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是
42、植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。分析方法：荧光法，微生物法。LOGO77（一）荧光法测定VB21 原理 将样品在酸性溶液中加热，提取VB2，通过调整pH，过滤后，可除去蛋白质，滤液在酸性环境下以高锰酸钾溶液氧化，再除去某些荧光杂质的干扰，然后测定试液的荧光强度。VB2在440500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与VB2的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠将VB2还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中VB2所产生的荧光强度，与标准VB2对照进行定量。LOGO782 仪器 荧光分光度计；高压消毒锅；电热恒
43、温培养箱；核黄素吸附柱3 试剂3.1 硅镁吸附剂：60100目。3.2乙酸钠溶液：2.5mol/L3.3 木瓜蛋白酶：100g/L,用2.5mol/L乙酸钠溶液配制，使用时现配。3.4淀粉酶：100g/L,用2.5mol/L乙酸钠溶液配制，使用时现配。LOGO793.5 盐酸：0.1mol/L3.6 氢氧化钠溶液：1mol/L3.7 低亚硫酸钠溶液:200g/L。此液用时现配，保存于冰水浴中，4h内有效。3.8 洗脱酸：丙酮+冰乙酸+水（5+2+9）3.9溴甲酚绿指示剂：0.4g/L3.10高锰酸钾溶液：30g/L3.11过氧化氢溶液：30%3.12 核黄素标准液的配制：（纯度98%）LOGO
44、80 a.核黄素标准储备液：25ug/mL.将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。b.核黄素标准使用液：吸取2mL核黄素标准储备液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮于4冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1ug核黄素。LOGO814 操作方法 试样提取a.试样的水解：准确称取准确称取2g10g样品（约含10200ug核黄素）于100mL,三角瓶中，加50mL0.1mo
45、L盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀。用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解，10.3104Pa。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，取少许水解液，用0.4g/L溴甲酚绿检验呈草绿色，pH为4.5。LOGO82b.试样的酶解含有淀粉的水解液：加入(3ml10g/L的淀粉酶溶液，于3740保温约16h。含高蛋白的水解液：加(3ml10g/L木瓜蛋白酶溶液，于3740保温约16h。c.过滤上述酶解液定容至100ml，用干滤纸过滤。此提取液在4 冰箱中可保存一周。LOGO83氧化去杂质 视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液及核黄素标准使用液（约110ug核黄素）分别于20mL的带盖刻
46、度试管中，加水至15mL。各管加0.5mL冰乙酸，混匀。加30g/L高锰酸钾溶液0.5mL，混匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加30g/L双氧水溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色退掉。剧烈振摇此管，使多余的氧气逸出。核黄素的吸附和洗脱a.核黄素吸附柱：硅镁吸附剂约1g用湿法装入柱，占柱长1/22/3（约5cm）为宜（吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上），勿使桂内产生气泡，调节流速约为60滴/minLOGO84b.b.过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用约20mL热水洗去样液中的杂质。然后用5.00ml洗脱液将试样中核黄素洗脱并收集于一带盖10mL刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液
47、体并定容至10mL，混匀后待测荧光。标准曲线的制备 分别精确吸取核黄素标准使用液0.3,0.6,0.9,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0（相当于0.3,0.6,0.9,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0核黄素）或取与试样含量相近的单点标准按核黄素的吸附和洗脱步骤操作。LOGO85测定 于激发光波长440nm,发射光波长525nm，测量试样管及标准管的荧光值。待试样及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液（约57mL）中加0.1mol/L低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作各自的空白值。LOGO865 计算 (A-B)m0 100X=f (C-D)m 100
48、0式中X试样中核黄素（VB2）的含量，mg/100g A试样管荧光值 B试样管空白荧光值 C标准管荧光，D标准管空白荧光值 f稀释倍数，m试样质量，g m0标准管中核黄素质量，ug 100 将试样中核黄素含量由ug/g换算成mg/100g的系数 1000LOGO876 说明v核黄素对光敏感，整个操作应在暗室中进行。v核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型，但摇动后很快被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。LOGO88三、维生素C的测定 维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中
49、含量尤丰富。维生素C方法有靛酚滴定法、2，4-二硝基苯肼法、荧光法和高效液相色谱法LOGO89（一）2,6-二氯靛酚滴定法 1原理 还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血酸含量成正比。LOGO902.试剂（1）2%草酸：溶解20克草酸结晶于200毫升水中，然后稀释至1000mL。（2）1草酸溶液：取上述2草酸溶液500mL，用水稀释至1000mL。（3）1淀粉溶液。（4）6碘化钾溶液。（5）0.
50、1000N碘酸钾溶液：精确取干燥的碘酸钾0.100ml。0.3567克用水稀释至100mL.（6）0.0010N碘酸钾溶液：吸取0.1N碘酸钾溶液1mL，用水稀释至100毫升。此溶液1mL相当于抗坏血酸0.088mg。（7）抗坏血酸标准溶液：准确称取20mg抗坏血酸，溶于1草酸溶液中，移入l00mL量瓶中，并用1草酸溶液稀释至100毫升，混匀，置冰箱中保存 使用时吸取上述抗坏血酸5ml，置于50毫升容量瓶中，用1草酸溶液定容之。此标准使用液每毫升含0.02mg维生素C。LOGO91标定：吸取标准使用液5mL于三角烧瓶中，加入6碘化钾溶液0.5mL，1淀粉溶液3滴，再以0.001N碘酸钾标准溶液
