1、第八单元 色谱操作 色谱分离条件的选择色谱分离条件的选择 吸附色谱的操作技术吸附色谱的操作技术 操作形式：吸附薄层色谱 吸附柱色谱 柱色谱法柱色谱法 经典的柱色谱法是将作为固定相的吸附剂装在一根玻管柱中(柱长一般从几十厘米到上百厘米不等)，从管顶加入样品溶液，再从管顶加人流动相。使流动相从上往下流过而使各种成分分离并依次流出色谱柱的过程称为洗脱。在洗脱时，可在柱的下端依次收集洗脱液并进行检查，每一份洗脱液从几毫升到几十毫升甚至几百毫升不等。整个分离过程需几小时甚至几天才能完成。经典柱色谱法主要用于分离和精制较大量的样品，通常适用于几十毫克到几十克样品的分离。近几十年来飞速发展的高效液相色谱法采
2、用远小于经典色谱法的色谱柱(柱长530cm，柱内径0.24.0 cm)，较细的固定相(粒径510m)，用高压泵输送流动相，具有分离性能好、分析速度快、流出组分容易收集、可以在线检测和仪器化等经典色谱法所无法比拟的优点。色谱柱的选择色谱柱的选择 色谱柱的内径与柱长的比例一般在1：101：20(30)之间。有时为了获得好的分离效果，可采用细长的色谱柱；有时为了从溶液中吸去某种成分、滤去不溶物以及在利用活性炭脱色时为滤去细微的活性炭颗粒或若硅胶的颗粒较细，而粒度分布范围窄，则可采用短柱(1：5)，这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量。有的色谱柱下端有活塞,有的有塞板。装柱装柱 A干法装柱干法
3、装柱。直接用小漏斗将吸附剂均匀装入柱内的方法。B湿法装柱湿法装柱。将吸附剂装入盛有洗脱液的柱内，或将吸附剂与洗脱液混合成混悬液再装入柱中。C操作要点操作要点 装柱前柱底要垫一层脱脂棉、玻璃纤维或塞板以防吸附剂外漏。干法装柱时要用橡皮槌轻轻敲打色谱柱，使吸附剂装填连续均匀、紧密，然后用洗脱剂洗脱并保持一定液面；湿法装柱时注意打开下端活塞，洗脱剂应始终保持一定的液面高度，为了增强分离效果，提高分离速度，可在柱面覆盖一层处理干净的均匀的细沙（石英沙、粗硅胶）。根据所采用吸附剂的不同，装柱方法略有不同：氧化铝氧化铝 一般先准确量取一定体积的溶剂(Vo)，将色谱柱的活塞稍打开，将溶剂滴人接受器中，同时将
4、氧化铝慢慢地加入，保持边沉降边添加的状态，直至加完。氧化铝加入速度不宜太快，否则将带人空气泡。必要时可以在色谱管外轻轻敲打振动，使氧化铝均匀下降，并有助于赶走气泡。当采用活性较高的氧化铝进行色谱时，更应注意。待氧化铝加完后，仍使溶剂流动一定时间，然后将氧化铝上面的溶剂全部滴人接受器，准确量取接受器内的溶剂量(V1)。从VoV1之差，就可以知道氧化铝内包含的溶剂体积。这样在色谱过程中，就可以掌握大致在什么时候开始收集流出组分；当变换溶剂的时候，就可以知道新换溶剂大致在哪一流分开始。硅胶硅胶 由于硅胶多为多孔性物质，一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶剂一起倾
5、人层析柱中，最好一次倾人，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果。另亦可采用干法装柱，将所需硅胶一次倾人柱中，然后蹾紧至硅胶高度不改变为止。当采用分配层析时，应先将预先选定的固定相溶剂如水、缓冲液或极性溶剂加入硅胶中，一般比例为1：0.51较为适中，搅拌混合均匀，倾人预先选定的移动相溶剂中并激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡层析管中事先放人用固定相溶剂剧裂振摇饱和后的移动相，将上述吸着固定相的硅胶按湿法装柱，不断轻敲管壁，使均匀紧密另外亦可采用加硅胶于固定相饱和的移动相中，按湿法装柱，然后用固定相饱和的流动相通过硅胶柱，使达到层析时稳定的平衡条件 活性炭活
6、性炭 因活性炭在水中的吸附力最强，一般在水中装柱。色谱柱内先加少量蒸馏水，再以玻璃纤维塞住底部，并除去玻璃纤维中的气泡。活性炭以蒸馏水浸泡1h左右，不断搅拌除去气泡。然后倒人柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。粉末活性炭因流速太慢，需与硅藻土(1：1)混合后，再用蒸馏水调成糊状装柱。并且待样品上柱后，在色谱管顶端连一有自动控制的加压泵或在色谱管下端连一减压泵进行色谱。聚酰胺聚酰胺 预处理预处理：取聚酰胺粉以90一95乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入色谱柱中。用34倍体积的90一95乙醇洗涤，洗至洗液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用22.5倍体积，质量浓度为5的NaOH水溶液、
7、1倍体积的蒸馏水、22.5倍体积的10醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，备用。装柱装柱：若用含水溶剂系统洗脱，常以水装柱，方法同活性炭的装柱。若用非极性溶剂系统洗脱时，常以溶剂组分中极性低的组分装柱。若以氯仿装柱，因其比重较大使聚酰胺粉浮在上面，加样时应将柱底端的氯仿层放出并立即加样，加样后顶端用棉花塞紧。在色谱柱关闭时，应将顶端多余的氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层带。加样加样 样品上柱可采取二种方式：湿法 干法 湿法湿法 如样品能溶于移动相可用少量移动相溶解，制成体积小、浓度高的溶液，尽可能保留加样色带狭窄，轻轻注入已准备好的色谱柱上，上样时注意沿着柱内壁慢慢加入，始终保持吸附剂
8、上端表面平整，勿使色谱柱面受到扰动，否则将影响色谱效果。干法干法 如果样品难溶于移动相或不易溶于开始色谱使用的有机溶剂，那么先将样品溶于易溶的、易挥发的有机溶剂中，以少量的吸附剂拌匀，然后将有机溶剂挥发干净，加适量的移动相拌匀再上柱，再按上述装柱法装柱，将带有样品的吸附剂加在色谱柱中的吸附剂上面。并在上面覆盖一薄层纯净的砂，然后用移动相展开 上样量上样量 一般为上样量：上样量：吸附剂=1：601：30 氧化铝的样品量 一般为1：2050，根据被分离化合物的性质而定。氧化铝对萜烯、倍半萜烯等的吸附力较弱，这时氧化铝用量可增至样品量的100200倍，而且为了尽量减少这类而且为了尽量减少这类化合物在
9、色谱柱中的扩散，色谱过程不能有间歇。化合物在色谱柱中的扩散，色谱过程不能有间歇。硅胶色谱样品量，一般为1：301：60，若作为分配层析比例应加大，主要根据分离物质的难易采确定较难分离者有时甚至可选1：5001：1000。聚酰胺色谱样品量 一般每100m1聚酰胺可上样1.52.5g，实际上其比例视具体情况而定样品先用洗脱溶剂溶解，浓度约2030%。若不溶解于洗脱剂，可选用易挥发的有机溶剂溶解，拌入干粉中后将溶剂减压蒸去，湿法装入柱顶 洗脱洗脱 洗脱方式：等强度（isocratic）梯度 （gradient）等强度洗脱：在同一洗脱周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目少、性质差别不大的样品。梯度
10、洗脱：同一洗脱周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。分析组分数目多、性质相差较大的复杂样品时须采用梯度洗脱技术，使所有组分都在适宜条件下获得分离。梯度洗脱能缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度；但是常常引起基线漂移和降低重现性。梯度洗脱曲线类型梯度洗脱曲线类型：两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程序进行混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度线性梯度 凹形梯度凹形梯度 凸形梯度凸形梯度 阶梯形梯度阶梯形梯度 线性梯度最为常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱；如果用等强度洗脱获得的色谱图前段峰重叠，后段峰分开且保留时间太长，可以适当降低起始溶剂的强度后，采用凹形梯度洗
11、脱，梯度起始阶段溶剂强度低，使分离度增大，而末尾阶段溶剂强度迅速增加，使组分快速洗脱出柱；也可降低起始溶剂的强度后，采用快速线性梯度洗脱；或者采用阶梯式梯度洗脱。总之，应该根据样品的实际情况，选择适宜的梯度曲线、梯度速度和时间、梯度起始和结束的溶剂组成。由薄层色谱摸索柱色谱条件由薄层色谱摸索柱色谱条件 分离条件最佳与可用范围的分离条件最佳与可用范围的k值表值表 k=0.4 ,Rf=0.7 k=4.0 ,Rf=0.2色谱类型 参数 最佳范围 可用范围 HPLC k 25 110 TLC k 0.44 0.19 GC k 2 0.220 注意：注意：洗脱时要尽量避免使用下列溶剂：洗脱时要尽量避免使
12、用下列溶剂：A醇类、乙酸乙酯，如样品中含酯醇类、乙酸乙酯，如样品中含酯类易发生酯交换。类易发生酯交换。B丙酮丙酮 与硅胶作用与硅胶作用 C甲酸、吡啶，溶解固定相甲酸、吡啶，溶解固定相 流速流速：过快不能达到平衡 过慢色带扩散 最佳流速：最佳流速：1V0/0.51h V0=流动相在色谱柱内所占柱内所占体积 一般为上柱硅胶量的1.5倍;松的为2倍，紧的为1.2倍 流份收集体积：流份收集体积：过小 增加工作量 过大人为混合 一般流份体积一般流份体积:1流份流份=V0 1/10 预测被分离物质的洗脱体积预测被分离物质的洗脱体积 V保保 =V V0 0 /Rf 式式:V V0 0=流动相在色谱柱内所占体
13、积流动相在色谱柱内所占体积 V保保=保留体积保留体积(被分离物质的洗脱体积被分离物质的洗脱体积)若若Rf=0.1,则则 V保保=10 V V0 0 若若Rf=0.2,则则 V保保=5 V V0 0 若若Rf=0.3,则则 V保保=3.3 V V0 0 一般连续洗脱般连续洗脱(柱色谱柱色谱)的条件的条件:以以TLC的的 Rf=0.10.3条件为佳条件为佳 先用单一溶剂,若Rf值过大,则降低溶剂极性 若Rf值过小,则增加溶剂极性 若单一溶剂不能使Rf值=0.10.3,则用混合溶剂 一种溶剂 Rf=0 另一种溶剂 Rf=1 混合使 Rf=0.10.3.若斑点较多,则选适当溶剂,使第一斑点展出,而其它
14、斑点留在原点。梯度洗脱起步溶剂的确定梯度洗脱起步溶剂的确定:极性小于洗脱剂极性小于洗脱剂,一般为洗脱剂中极性小组分的一般为洗脱剂中极性小组分的2倍倍 例例:CHCL3:MeOH=10:1;5:1 ;2.5:1 ;1:1 起步溶剂起步溶剂=20:1 检测时检测时,点样的物质有点样的物质有:待分离物质待分离物质(总样总样);标准物质标准物质(对照品对照品);柱洗脱下来的各个流分柱洗脱下来的各个流分 溶剂的重复使用：溶剂的重复使用：a若洗脱液为单一溶媒，则采用蒸馏法若洗脱液为单一溶媒，则采用蒸馏法回收溶媒后，进行循环使用。回收溶媒后，进行循环使用。b若洗脱液为混合溶媒，应先回收溶媒，若洗脱液为混合溶
15、媒，应先回收溶媒，再进行调节密度。如；三元系统的洗脱溶再进行调节密度。如；三元系统的洗脱溶媒媒CHCI3MeOHH2O=6：4：2，新配，新配制时制时d=1.064,回收溶媒后，用回收溶媒后，用MeOH、H2O调节密度，再用调节密度，再用TLC检查，与原斑点检查，与原斑点Rf值相同即可。值相同即可。吸附剂的再生吸附剂的再生 用过的吸附剂经适当方法处理后，可以重复使用。A氧化铝氧化铝 色谱分离后，除去氧化铝柱上端含聚合物及带有深颜色的氧化铝，用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后，可重复使用、。为了使吸附在氧化铝表面的有机物分解，高温活化时间可适当延长。活化后，氧化铝的颜色比使用后
16、的稍淡，一般来说，氧化铝可重复使用多次，重复次数随色谱过程中有机物污染的程度而定。B硅胶硅胶 由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单。一般可用乙醇或甲醇洗涤，或于索氏提取器中连续抽提除去杂质，洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。硅胶的再生也可用510倍体积，质量浓度为1的氢氧化钠煮沸0.5h如仍不呈强碱性(以酚酞作指示剂)，可追加适量质量浓度为1的氢氧化钠，趁热过滤，以蒸馏水洗3次，再以36倍5盐酸煮沸0.5h，以蒸馏水洗至中性，120活化，过筛即得。C聚酰胺聚酰胺 用过的聚酰胺粉，一般用5氢氧化钠洗涤，洗到氢氧化钠液颜色极淡为止。有时因某些鞣质与聚酰胺有不可逆吸
17、附，用氢氧化钠很难洗脱时，可用质量浓度为5的氢氧化钠在柱中浸泡。每天将柱中的氢氧化钠液放出一次，并加入新的氢氧化钠液浸泡，这样浸泡洗涤一周后，鞣质可基本洗完。然后用蒸馏水洗至pH89，再以2倍量10醋酸洗，最后以蒸馏水洗至中性，即可重复使用。D活性炭活性炭 用过的活性炭可以用酸碱处理回收。因活性炭来源较易，价格便宜，一般不回收使用。薄层色谱法薄层色谱法 优点：优点：所使用的固定相是一次性的，因此样品的所使用的固定相是一次性的，因此样品的预处理比较简单；预处理比较简单；被分离物质的性质没有限制，应用范围广被分离物质的性质没有限制，应用范围广 固定相特别是流动相选择范围宽：有利于固定相特别是流动相
18、选择范围宽：有利于不同性质化合物的分离；在同一薄层板上可根据不同性质化合物的分离；在同一薄层板上可根据被分离化合物的性质选择不同显色剂或检测方法被分离化合物的性质选择不同显色剂或检测方法进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。直观性，且随化学成分及显色方法的不同，直观性，且随化学成分及显色方法的不同，斑点显色的颜色丰富多彩，有利鉴别。斑点显色的颜色丰富多彩，有利鉴别。制板制板 板板 类型类型:软板软板-不含黏合剂不含黏合剂 硬板硬板-含黏合剂的含黏合剂的 前者系将吸附剂或载体直接在玻璃板上用干法前者系将吸附剂或载体直接在玻璃板上用干法涂成均匀的薄层，但软板疏松，操作很不方便，涂成均匀的薄层，但
19、软板疏松，操作很不方便，目前很少使用。目前很少使用。制备含黏合剂的硬板，必须先要制备固定相的制备含黏合剂的硬板，必须先要制备固定相的匀浆，它是由吸附剂与黏合剂以一定的比例用水匀浆，它是由吸附剂与黏合剂以一定的比例用水调和而成。由于固定相及黏合剂类型不同，性能调和而成。由于固定相及黏合剂类型不同，性能也不相同，常用的黏合剂有煅石膏、羧甲基纤维也不相同，常用的黏合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠素钠(CMCNa)和某些聚合物如聚丙烯酸等。和某些聚合物如聚丙烯酸等。规格规格:薄层所用的玻璃板为薄层所用的玻璃板为2mm厚，除另有厚，除另有规定外，一般为规定外，一般为 5cm20cm 10cmX10cm 10
20、cm20cm 20cmX20cm 薄层板活化薄层板活化:步骤步骤 晾干晾干 铺好的薄层板应先晾干，铺好的薄层板应先晾干，活化温度活化温度 在在105110活化。活化。活化时间活化时间 为为0.51h，保存保存 保存于干燥器中备用。保存于干燥器中备用。注注:有些薄层板铺好后阴干即可使用，有些薄层板铺好后阴干即可使用，有些薄层板则需要保存在一定湿度下才能有些薄层板则需要保存在一定湿度下才能获得较好的分离效果，如聚酰胺薄层板。获得较好的分离效果，如聚酰胺薄层板。点样点样 样品溶液的制备样品溶液的制备 溶解样品的溶剂，对点样非常重要。尽量避免用水，因为水溶液斑点容易扩散，且不易挥发。一般用甲醇、乙醇、
21、丙酮、氯仿等挥发性溶剂，因为点样后它们能迅速挥发，可减少色斑的扩散。对水溶性样品，采取先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。点样量点样量 点样量多少视薄层的性能及显色剂的灵敏度等而定。一般是数微克至几十微克。在检测器灵敏度足够时，应降低点样量，以减少拖尾。点样的量器点样的量器 为管口平整的点样毛细管或平口的微量注射器。吸取一定量样品溶液，轻轻接触于薄层的点样线上。当溶液稀时，反复点几次，每次点干后再点，溶剂应迅速挥去，否则造成样斑扩散而影响分离效果。点样原点面积点样原点面积 原点面积扩散直径以不超过23mm为宜。各点距离为12cm。如在空气中点样以不超过10min为宜，以免吸附剂在空气中吸湿
22、而降低活度。展开展开 展开方式：上行展开 下行展开 双向展开 多次展开 径向展开 连续展开 定位定位 确定组分在薄层板上的位置。类型：a.光学检测光学检测(物理方法物理方法)b.显色定位显色定位(化学方法化学方法)通用型显色剂通用型显色剂:专属型显色剂专属型显色剂:C.生物检测法生物检测法 a.光学检测光学检测(物理方法物理方法)对于那些对可见光有吸收的化合物，在自然光下就可以观察到不同颜色的斑点；对于在可见光下不能显色，但可吸收紫外光的化合物，在紫外灯下可显示不同颜色的斑点；还有一些化合物吸收了较短波长的光后会在色谱上显出不同颜色的荧光斑点；对可见光、紫外光都不吸收，也没有合适的显色方法的化
23、合物可以用荧光淬灭技术进行检测。光学检测法具有使用方便、被检出组分不被破坏的优点。b.显色定位显色定位(化学方法化学方法)根据待测组分的性质，喷洒适宜试剂(显色剂)使之发生反应生成有色物质而显色的方法称为显色法。显色剂有通用型和专属型两种。通用型显色剂通用型显色剂:碘使许多化合物显色，如生物碱、氨基酸衍生物、肽碘使许多化合物显色，如生物碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类及皂苷等。多数情况下碘是一种非破坏性的显色类、脂类及皂苷等。多数情况下碘是一种非破坏性的显色剂，它的最大特点是与物质的反应是可逆的，不会改变组剂，它的最大特点是与物质的反应是可逆的，不会改变组分的性质，当碘升华挥去后，斑点便于进一步处
24、理。分的性质，当碘升华挥去后，斑点便于进一步处理。专属型显色剂专属型显色剂:是指对某个或某一类官能团显色的试剂。由于化合物种类繁多，因此专属性显色剂也是很多的。例如茚三酮是氨基酸的专用显色剂，对脂肪族伯胺也呈正反应；羧酸可用酸碱指示剂作显色剂，含酚羟基物质可喷三氯化铁铁氰化钾试剂。各类化合物的显色剂可在有关手册中查阅。C.生物检测法生物检测法 具有某些生物活性的物质，可以采用生物实验的方法进行专属性检测。把含有某种特定细菌的凝胶混悬液倒在展开后的薄层上，在适当温度培养一段时间，可以用此方法检测出某些具有抑菌或杀菌作用的活性物质。检测不同的化合物可以采用不同的细菌，例如检测青霉素可用金球菌，检测
25、四环素可用干草杆菌等。除了抗生素以外，其他一些有生理活性的物质，例如有溶血作用的化合物(如皂苷)也可以利用类似的方法检出。将血液明胶混悬液倒在薄层表面上，如果有溶血物质存在，过一定时间可以明显地看到透明的、几乎无色的斑点，背景为浑浊的红色。显色方式显色方式 蒸气显色 喷雾显色 浸渍显色 加热显色 定性分析：定性分析：保留值保留值 比移值比移值Rf 相对比移值相对比移值 板上化学反应板上化学反应 板上光谱图板上光谱图 色谱与其它技术联用色谱与其它技术联用 保留值定性保留值定性比移值（比移值（Rf）比移值比移值Rf是溶质移动距离和展开剂移是溶质移动距离和展开剂移动距离之比，是薄层色谱的基本定性参数
26、。动距离之比，是薄层色谱的基本定性参数。它说明组分在色谱系统中的保流行为。它说明组分在色谱系统中的保流行为。可用范围：可用范围：0.2一一0.8 最佳范围：最佳范围：0.30.6 相对比移值（相对比移值（Rr）是被分离组分是被分离组分a和参考物质和参考物质s在同一薄在同一薄层板上、同一展开条件下的层板上、同一展开条件下的Rf值之比。由值之比。由于参考物质的于参考物质的Rf或移动距离可大于或小于或移动距离可大于或小于被分离组分的被分离组分的Rf值或移动距离。因此，值或移动距离。因此，Rr值可大于或小于值可大于或小于1。Rr值的重复性和可比性值的重复性和可比性都优于都优于Rf。相对比移值以下式表示
27、：相对比移值以下式表示：Rr=Rf(a)/Rf(s)薄层色谱定性分析的依据是：薄层色谱定性分析的依据是：在固定的色谱条件下，相同物质的在固定的色谱条件下，相同物质的Rf值相同。值相同。利用定性参数进行定性鉴别的方法利用定性参数进行定性鉴别的方法适用于已知范围的未知物。适用于已知范围的未知物。对照方法：对照方法：已知物对照法已知物对照法 文献法文献法已知物对照法：已知物对照法：即将样品和已知物对照品在同一薄层板即将样品和已知物对照品在同一薄层板上展开，比较组分与对照品上展开，比较组分与对照品Rf值：值：如果二者的值不同，则组分与对照品不如果二者的值不同，则组分与对照品不是同一物质；是同一物质；如
28、果二者的值相同，也不能轻易肯定就如果二者的值相同，也不能轻易肯定就是同一物质，必须用几种性质不同的展开是同一物质，必须用几种性质不同的展开剂或性质不同的吸附剂展开，若二者剂或性质不同的吸附剂展开，若二者Rf值值都一致，同时又对多种显色剂有相同的反都一致，同时又对多种显色剂有相同的反应，这时说组分与对照品为同一物质才比应，这时说组分与对照品为同一物质才比较可靠。较可靠。文献法：文献法：也可利用文献的也可利用文献的Rf值进行定性鉴别，但值进行定性鉴别，但是由于薄层色谱的实验条件很难与文献完是由于薄层色谱的实验条件很难与文献完全一致，因此，最好采用相对比移值进行全一致，因此，最好采用相对比移值进行定
29、性鉴别。定性鉴别。定量分析定量分析 洗脱测定法洗脱测定法 直接测定法直接测定法 A目视比较法目视比较法 B薄层扫描法薄层扫描法 洗脱测定法洗脱测定法 样品经薄层色谱分离后，用适当的溶样品经薄层色谱分离后，用适当的溶剂将斑点中的组分洗脱下来，再用适当方剂将斑点中的组分洗脱下来，再用适当方法进行测定的方法称为洗脱测定法。法进行测定的方法称为洗脱测定法。关键：关键：洗脱剂的选择，所选择的洗脱剂必须洗脱剂的选择，所选择的洗脱剂必须能定量地将待测组分全部洗下；能定量地将待测组分全部洗下；此外，不能将对测定结果有影响的微此外，不能将对测定结果有影响的微量干扰物质同时洗脱下来：量干扰物质同时洗脱下来：例如在
30、进行小蔓长春花中长春胺的测定时，若用乙醇作为洗脱剂，有微量叶绿素干扰测定；当改用0.1molL盐酸溶液作为洗脱剂时，长春胺可以定量洗脱，而叶绿素则不溶于稀酸而留在吸附剂上。测定方法：测定方法：紫外分光光度法紫外分光光度法 显色剂比色法显色剂比色法 荧光分光光度法荧光分光光度法 电化学方法电化学方法 直接测定法直接测定法 A目视比较法目视比较法 样品经薄层色谱分离后，可在薄层板上对斑样品经薄层色谱分离后，可在薄层板上对斑点进行直接测定。最简易的方法是目视比较法。点进行直接测定。最简易的方法是目视比较法。将一系列已知浓度的对照品溶液与样品溶液点在将一系列已知浓度的对照品溶液与样品溶液点在同一薄层板
31、上，展开并显色后，以目视法直接比同一薄层板上，展开并显色后，以目视法直接比较样品斑点与对照品斑点的颜色深度或面积大小，较样品斑点与对照品斑点的颜色深度或面积大小，也可用测面仪直接测定斑点的面积。在严格控制也可用测面仪直接测定斑点的面积。在严格控制色谱条件的情况下，斑点的颜色深度或面积随溶色谱条件的情况下，斑点的颜色深度或面积随溶液浓度液浓度(或点样量或点样量)而变化，由此测出样品的近似而变化，由此测出样品的近似含量或含量范围。含量或含量范围。本法常用于半定量分析或限度检查。本法常用于半定量分析或限度检查。B薄层扫描法薄层扫描法 薄层扫描法与洗脱测定法相比，后者操作麻烦，薄层扫描法与洗脱测定法相
32、比，后者操作麻烦，测定误差大，而前者快速简便，测定误差较小。测定误差大，而前者快速简便，测定误差较小。因此，自因此，自20世纪世纪70年代我国引进薄层色谱扫描仪年代我国引进薄层色谱扫描仪后，薄层定量工作迅速发展。后，薄层定量工作迅速发展。目前用薄层扫描法直接定量已成为薄层色谱的目前用薄层扫描法直接定量已成为薄层色谱的主要定量方法。主要定量方法。薄层扫描法是以一定波长的光照射展开后的薄薄层扫描法是以一定波长的光照射展开后的薄层色谱板，测定其对光的吸收或所发出的荧光进层色谱板，测定其对光的吸收或所发出的荧光进行定量分析的方法。薄层扫描法一般可分为吸收行定量分析的方法。薄层扫描法一般可分为吸收扫描法和荧光扫描法扫描法和荧光扫描法
